1.本发明涉及植物的栽培技术领域，特别是涉及一种三叶青试管苗离体保存的方法。
背景技术：
2.三叶青(tetrastigma hemsleyanum diels et gilg)别名三叶崖爬藤、金线吊葫芦，属鼠李目，葡萄科草质藤本。三叶青草质藤本，小枝纤细，有纵棱纹，无毛或被疏柔毛。卷须不分枝，相隔2节间断与叶对生。叶为3小叶，小叶披针形、长椭圆披针形或卵披针形，长3～locm，宽1.5～3cm，顶端渐尖，稀急尖，基部楔形或圆形，侧生小叶基部不对称，近圆形，边缘每侧有4～6个锯齿，锯齿细或有时较粗，上面绿色，下面浅绿色，两面均无毛；侧脉5～6对，网脉两面不明显，无毛；叶柄长2～7.5cm，中央小叶柄长0.5～1.8cm，侧生小叶柄较短，长0.3～0.5cm，无毛或被疏柔毛序腋生，长1～5cm，比叶柄短、近等长或较叶柄长，下部有节，节上有苞片，或假顶生而基部无节和苞片，二级分枝通常4，集生成伞形。花期4～6月，果期8～11月。为我国特有药用植物,广泛分布于长江以南各省份，主要有浙江、江西、福建、湖南、湖北、广东、广西、贵州、重庆、四川西藏、云南、海南和台湾等地区，常生于山坡林下的灌丛中或山谷溪边林下的岩石缝中，生长海拔300～1300m。
3.三叶青全草均可入药，以地下块根和果实的药用效果最好。其性平、味微苦,具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效,主治毒蛇咬伤、扁桃体炎、淋巴结结核、跌打损伤、小儿高热惊厥等疾病。目前临床上还应用于抗癌、抗艾滋病毒，治疗血液病、心脑血管疾病、肝炎、病毒性脑膜炎等疾病。
4.目前三叶青主要依赖于野生挖掘,近年来,由于过度采挖和生境破坏，致使铁三叶青野生资源已濒临灭绝，人工栽培己刻不容缓,但人工栽培存在种苗供应不足，通过组培的方法快速繁殖种苗有很大的市场价值。
5.离体继代培养技术正日益成为试管苗保存的常用手段。但利用继代培养的方法进行试管苗保存，一个比较普遍的问题就是继代频繁。每一次继代都可能造成交叉污染，而当保存量较大时，继代培养所消耗的人力和物力成本很高。不仅如此，一些保存的植物组织培养物，经过多次继代还会引发遗传变异。国内外对三叶青的研究主要集中在临床应用、化学成份以及药理作用方面，组织培养、快繁技术目前有少量报道，但有关其试管苗保存的离体保存技术以及其遗传评价均未见报道。而且，三叶青种质资源田间种植难度大，保存工作量大，易受环境气候及病虫害影响，而组织培养正常继代保存转接频繁、成本高。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供一种三叶青试管苗离体保存的方法，提供一种不但保存15个月后植株生长正常，而且保存材料的后代未发生遗传性变异的三叶青试管苗的离体保存方法。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种三叶青试管苗离体保存的方法，包括以下步骤：
9.(1)选取三叶青茎尖作为外植体，在质量浓度75％酒精中浸泡，无菌水冲洗，滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗，再滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗，剪成0.5
‑
1.0cm长接种在第一培养基中，培养；
10.(2)在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小1
‑
3mm的离体茎尖为材料，将离体茎尖置入第二培养基，培养；
11.(3)将在第二培养基中培养后的茎尖置于25g/l海藻酸钠+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的无钙ms培养液中,用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙ms培养液滴至含0.1mol/l氯化钙+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的培养液中,并于25℃保持2
‑
30min使之成包埋球；
12.(4)将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上,在无菌空气流中干燥1
‑
2h；
13.(5)无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10
‑
20个包埋球；
14.(6)将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架或沙袋后投入液氮进行超低温保存。
15.优选地，所述第一培养基包括500
‑
650mg/l nh4no3、600
‑
700mg/l kno3、100
‑
150mg/l mgso4·
7h2o、60
‑
100mg/l kh2po4、0.1mg/l ba、20
‑
25g/l蔗糖、5
‑
10g/l琼脂。
16.优选地，在第一培养基的培养温度20
±
2℃，光照强度为1500
‑
2000lx，光照时间16h/d，每280
‑
300d继代1次。
17.优选地，所述第二培养基为含0.3
‑
0.5mg/l蔗糖的ms固体培养基。
18.优选地，所述第二培养基的培养温度为25
±
2℃，光照强度为1500
‑
2000lx，光照时间为16h/d。
19.优选地，步骤(3)中每个包埋球大小4
‑
5mm，含有一个茎尖。包含一个茎尖的液滴滴入培养液中，液滴与培养液中钙离子反应生成固化包埋球，较高渗透压的培养液进一步降低包埋球及其中茎尖的含水量，进一步防止细胞中水分在超低温冷冻时生成冰晶。
20.优选地，步骤(6)所述超低温保存为在
‑
196℃进行保存。
21.本发明公开了以下技术效果：
22.1.本发明所提供的方法用于三叶青离体保存，试管苗保存15个月后存活率仍为100％，且植株生长正常，与常规正常培养基上的试管苗仅能存活3个月相比，大大延长了继代培养时间，使继代间隔由平时的1
‑
2个月继代1次转为10个月左右继代1次。因此该方法可防止普通的传代保存法由于多次传代后造成的种性退化及病毒感染，保证种质的优良性和纯洁性。
23.2.本发明提供了一种安全、稳定、可靠、简单、有效地长期保存三叶青试管苗的方法，三叶青试管苗离体茎尖经过超低温保存后，将其化冻处理、恢复再生培养直接成苗，不形成愈伤组织，避免产生遗传变异，遗传稳定性好，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达99％以上。
具体实施方式
24.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
25.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
26.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
27.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
28.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
29.实施例1
30.一种三叶青试管苗离体保存的方法，包括以下步骤：
31.(1)选取三叶青茎尖作为外植体，在质量浓度75％酒精中浸泡，无菌水冲洗2次，滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗8次后，再滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗8次后，剪成0.5cm长接种在第一培养基中，培养；所述第一培养基包括500mg/l nh4no3、700mg/l kno3、150mg/l mgso4·
7h2o、70mg/l kh2po4、0.1mg/l ba、22g/l蔗糖、8g/l琼脂；20
±
2℃，光照强度为1500lx，光照时间16h/d，每280d继代1次；
32.(2)在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小1mm的离体茎尖为材料，将离体茎尖置入第二培养基，培养，所述第二培养基为含0.3mg/l蔗糖的ms固体培养基，所述第二培养基的培养温度为25
±
2℃，光照强度为1800lx，光照时间为16h/d；
33.(3)将在第二培养基中培养后的茎尖置于25g/l海藻酸钠+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的无钙ms培养液中,用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙ms培养液滴至含0.1mol/l氯化钙+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的培养液中,并于25℃保持15min使之成包埋球，每个包埋球大小5mm，含有一个茎尖；
34.(4)将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上,在无菌空气流中干燥2h；
35.(5)无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装15个包埋球；
36.(6)将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架后投入液氮进行
‑
196℃保存。
37.本实施例试管苗保存15个月后存活率仍为100％，且植株生长正常，植株再生率可达99％。
38.实施例2
39.一种三叶青试管苗离体保存的方法，包括以下步骤：
40.(1)选取三叶青茎尖作为外植体，在质量浓度75％酒精中浸泡，无菌水冲洗2次，滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗7次后，再滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗8次后，
剪成0.8cm长接种在第一培养基中，培养；所述第一培养基包括650mg/l nh4no3、600mg/l kno3、120mg/l mgso4·
7h2o、100mg/l kh2po4、0.1mg/l ba、20g/l蔗糖、10g/l琼脂；20
±
2℃，光照强度为1800lx，光照时间16h/d，每280d继代1次；
41.(2)在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小1mm的离体茎尖为材料，将离体茎尖置入第二培养基，培养，所述第二培养基为含0.3mg/l蔗糖的ms固体培养基，所述第二培养基的培养温度为25
±
2℃，光照强度为2000lx，光照时间为16h/d；
42.(3)将在第二培养基中培养后的茎尖置于25g/l海藻酸钠+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的无钙ms培养液中,用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙ms培养液滴至含0.1mol/l氯化钙+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的培养液中,并于25℃保持15min使之成包埋球，每个包埋球大小4mm，含有一个茎尖；
43.(4)将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上,在无菌空气流中干燥2h；
44.(5)无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装15个包埋球；
45.(6)将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架后投入液氮进行
‑
196℃保存。
46.本实施例试管苗保存15个月后存活率仍为100％，且植株生长正常，植株再生率可达100％。
47.实施例3
48.一种三叶青试管苗离体保存的方法，包括以下步骤：
49.(1)选取三叶青茎尖作为外植体，在质量浓度75％酒精中浸泡，无菌水冲洗2次，滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗6次后，再滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗6次后，剪成1.0cm长接种在第一培养基中，培养；所述第一培养基包括600mg/l nh4no3、700mg/l kno3、150mg/l mgso4·
7h2o、60mg/l kh2po4、0.1mg/l ba、20g/l蔗糖、5g/l琼脂；20
±
2℃，光照强度为1800lx，光照时间16h/d，每300d继代1次；
50.(2)在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小1mm的离体茎尖为材料，将离体茎尖置入第二培养基，培养，所述第二培养基为含0.3mg/l蔗糖的ms固体培养基，所述第二培养基的培养温度为25
±
2℃，光照强度为1500lx，光照时间为16h/d；
51.(3)将在第二培养基中培养后的茎尖置于25g/l海藻酸钠+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的无钙ms培养液中,用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙ms培养液滴至含0.1mol/l氯化钙+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的培养液中,并于25℃保持15min使之成包埋球，每个包埋球大小5mm，含有一个茎尖；
52.(4)将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上,在无菌空气流中干燥2h；
53.(5)无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装20个包埋球；
54.(6)将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架后投入液氮进行
‑
196℃保存。
55.本实施例试管苗保存15个月后存活率仍为100％，且植株生长正常，植株再生率可达100％。
56.实施例4
57.一种三叶青试管苗离体保存的方法，包括以下步骤：
58.(1)选取三叶青茎尖作为外植体，在质量浓度75％酒精中浸泡，无菌水冲洗2次，滴
加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗7次后，再滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗8次后，剪成1.0cm长接种在第一培养基中，培养；所述第一培养基包括500mg/l nh4no3、650mg/l kno3、100mg/l mgso4·
7h2o、70mg/l kh2po4、0.1mg/l ba、20g/l蔗糖、7g/l琼脂；20
±
2℃，光照强度为1900lx，光照时间16h/d，每300d继代1次；
59.(2)在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小1mm的离体茎尖为材料，将离体茎尖置入第二培养基，培养，所述第二培养基为含0.3mg/l蔗糖的ms固体培养基，所述第二培养基的培养温度为25
±
2℃，光照强度为1800lx，光照时间为16h/d；
60.(3)将在第二培养基中培养后的茎尖置于25g/l海藻酸钠+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的无钙ms培养液中,用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙ms培养液滴至含0.1mol/l氯化钙+2mol/l甘油+0.8mol/l蔗糖的培养液中,并于25℃保持15min使之成包埋球，每个包埋球大小4mm，含有一个茎尖；
61.(4)将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上,在无菌空气流中干燥2h；
62.(5)无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10个包埋球；
63.(6)将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架后投入液氮进行
‑
196℃保存。
64.本实施例试管苗保存14个月后存活率仍为100％，且植株生长正常，植株再生率可达99％。
65.对比例1
66.同实施例3，不同之处仅在于第一培养基中各组分添加量减半。
67.本对比例试管苗保存5个月后存活率为98％，且植株生长正常，植株再生率为90％。
68.对比例2
69.同实施例3，不同之处仅在于未进行包埋。
70.本实施例试管苗保存4个月后存活率为95％，且植株生长正常，植株再生率为85％。
71.对比例3
72.同实施例3，不同之处仅在于每个包埋球中含2个茎尖。本对比例试管苗保存6个月后存活率为90％，且植株生长正常，植株再生率为80％。
73.对比例4
74.同实施例3，不同之处仅在于第二培养基中不含钙或钙离子。本实施例试管苗保存5个月后存活率为75％，且植株生长正常，植株再生率为65％。
75.本发明实施例和对比例的存活率和植株再生率按以下方法计算:从液氮中取出实施例和对比例冷冻管，在38℃水浴中化冻3min，化冻后的包埋球在950mg/l kno3和825mg/l nh4no3的ms+0.1mg/lba+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂，ph5.8的培养基中进行恢复培养,先在黑暗条件或弱光下培养8－10天后,再转入与第二培养基相同的条件下培养。
76.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。