一种桑黄的快速育种方法

本发明涉及桑黄育种技术领域，尤其是一种桑黄的快速育种方法。

背景技术：

桑黄（pellinusigniarius），又名桑耳，为担子菌亚门（basidio-mycotina）层菌纲（hymenomycetes）非褶菌目（aphyllophorales）多孔菌科（polyporaceae）木层孔菌属（pellinus）。在我国，运用桑黄治病已经有两千多年的历史。最早的药用记载可以追溯到汉代中医经典《神农本草经》，明代《本草纲目》中有桑黄“利五脏，宣肠胃气，排毒气”等药用描述。《中药大辞典》、《中华本草》和《中国药典》等对桑黄进行了收录，并详细记录了其成分、药理和复方。桑黄是一种珍稀的药用真菌，其抗癌效果比灵芝和巴西蘑菇等好，被称为“森林黄金”。目前，桑黄是国际上公认的生物治癌领域中效率最高的一种真菌，现已成为国内外保健食品和医药领域研究与开发的热点。

桑黄具有很高的药用价值，其在癌症治疗中的应用也越来越受重视。桑黄含有多糖类、黄酮类、多酚类、萜类以及甾醇类等具有药用活性成分，其性甘、辛、平、无毒。《圣惠方》中叙述了桑黄可治疗女子漏下赤白、血病腹内结块、肿痛、阴阳寒热、不孕、月经不调。现代研究表明，桑黄还具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗炎作用，另外还具有保肝抗肝硬化、治疗痛风、止血、活血、抗病毒、抗衰老及增强机体免疫力等作用。桑黄作为一种有效治疗癌症的药材，在日本和韩国很早就有研究，并作为一种抗癌药物列入该国药典。二战时，长崎地区居民因服用岛上盛产的桑黄大大降低了罹癌病例，此后桑黄开始慢慢在日本、韩国和中国台湾等地盛行起来。ikekawat是最早开启现代医学研究桑黄学者，认为一些担子菌的抗肿瘤作用，特别是sanghuang（桑黄）。1968年，日本国立肿瘤研究所的化疗部，针对桑黄进行抗肿瘤的临床实验发现桑黄的肿瘤抑制率高达96.7%，且长期食用无副作用。有学者通过对akt信号的抑制研究，发现桑黄抑制了乳腺癌细胞的生长、血管生成和侵入性行为。实验结果还表明桑黄能使免疫细胞活化程度提高2-129倍。除此之外桑黄还是一种营养丰富的真菌，含有多糖、氨基酸、落叶松酸、藜芦碱、蘑菇酸、间位二甲氧苯二甲酸等多种营养成分。

但由于桑黄类群真菌受其生理生态的特殊性和复杂性制约，在自然界中形成的天然子实体生长缓慢且存活率低，因此本发明拟在研究一种快速培育高产桑黄的方法，从而可以大大提高桑黄的供应量。

技术实现要素：

本发明公开了一种桑黄的快速育种方法，以低产高药效的桑树桑黄与高产的树舌灵芝作为两个杂交亲本，使得树舌灵芝中优势性状在桑黄中得到整合表达。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种桑黄的快速育种方法，以桑树桑黄与树舌灵芝作为两个杂交亲本进行培育。

进一步的，本发明提供了桑树桑黄与树舌灵芝作为两个杂交亲本进行培育的具体步骤，具体包括以下步骤：

s1.清洗桑黄和树舌灵芝子实体，在超净工作台中用灭菌刀分别切取两种菌肉放到菌肉培养基中进行培养；

s2.挑取步骤s1培养好的菌丝到菌丝培养基内进行共培养，桑黄菌丝和树舌灵芝菌丝接种的距离为1.2~2.5cm；室温培养22~25h后依次加入0.2~0.4mg/ml氯化钙溶液和0.8~1.2mol/l的转移因子提取液，其中，每100ml的培养基加1~5滴氯化钙溶液和0.8~1.5ml转移因子提取液，并转移到36~40℃的恒温环境中培养32~38h，再转入10~14℃的恒温环境中继续培养3~6h，最后在室温下培养10~14h，挑取融合后的菌丝接种到灭菌的培养物料包中进行新种桑黄子实体的生产。

优选的，所述菌肉培养基由以下重量份的组分组成：马铃薯180~250份、桃木木屑粉8~20份、桑枝木屑粉8~20份、葡萄糖18~22份、琼脂15~20份、水800~1000份；所述菌肉培养基的制备方法包括以下步骤：马铃薯、桃木木屑粉、桑枝木屑粉加入水，煮10~20min，过滤掉桃木木屑粉和桑枝木屑粉，再用滤液与葡萄糖、琼脂一起加热至溶解，最后调节ph为6.2~7.0。更优选的，所述菌肉培养基由以下重量份的组分组成：马铃薯200份、桃木木屑粉10份、桑枝木屑粉10份、葡萄糖20份、琼脂18份、水1000份，调节ph6.5。

优选的，所述菌丝培养基与所述菌肉培养基组分和制备方法相同。

优选的，所述培养物料包由以下重量份的组分组成：桃木木屑粉1~3份、桑枝木屑粉1~5份、甘蔗渣1~3份、麦麸1~2份、玉米粉1~2份、琼脂1~2份，混合后加水搅拌至有湿润感，装袋灭菌。更优选的，所述培养物料包由以下重量份的组分组成：桃木木屑粉2份、桑枝木屑粉3份、甘蔗渣2份、麦麸1份、玉米粉1份、琼脂1份，混合后加水搅拌至有湿润感，装袋灭菌。

优选的，所述步骤s2中，接种的距离为2cm。

优选的，所述步骤s2中，培养的具体过程包括：室温培养24h后依次加入0.3mg/ml氯化钙溶液和1.0mol/l的转移因子提取液，其中，每100ml的培养基加2滴氯化钙溶液和1ml转移因子提取液，并转移到38℃的恒温环境中培养36h，再转入12℃的恒温环境中中继续培养4h，最后在室温下培养12h。

优选的，所述36~40℃的恒温环境为恒温培养箱；所述10~14℃的恒温环境为冷柜。

所述转移因子提取液，采用健康动物脾脏为原料，制成的含多肽、氨基酸和多核苷酸混合物的溶液，按标准号为ws1-(x-451)-2003z提取获得。

以上所述的桑黄的快速育种方法，以低产高药效的桑树桑黄与高产的树舌灵芝作为两个杂交亲本，使得树舌灵芝中优势性状在桑黄中得到整合表达，从而提高桑树桑黄的产量。同时，本发明进一步采用菌丝融合法进行新种培育，可以大大缩短了大型真菌育种的时间。

进一步的，本发明在菌丝培养的过程中，通过加入适当浓度钙离子，同时匹配一定的温差，从而促进细胞的快速融合。且本发明在菌肉培养基中加入适宜桑黄和树舌灵芝生长的寄主木屑成分，使这两种真菌能够在培养基中更好的生长。

通过液相色谱-串联三重四级杆飞行时间高分辨质谱法检测桑黄-树舌真菌的非靶代谢物，其中由富集作用分析结果表明：相比于桑黄子实体，碳代谢有关物质中有10种物质活跃度明显提高，atp结合盒转运蛋白家族中有25种物质活跃度明显提高，类黄酮的生物合成中有13种物质活跃度明显提高，表明经过创新培育的桑黄-树舌的代谢活跃，生长旺盛，有利于碳水化合物及黄酮类物质的积累。而碳水化合物积累是提高产量的一个重要而关键的指标，类黄酮是桑黄药效体现的一个重要类别，综合桑黄-树舌真菌新种与桑黄原种的子实体、菌丝及其代谢产物的综合检测结果分析，均表明该新育品种产量和品质得到了提高。

附图说明

图1是树舌灵芝培养菌丝显微形态。

图2是桑黄培养菌丝显微形态。

图3是桑黄-树舌灵芝共培养体菌丝显微形态。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

材料获取方式：从十万大山野生桑树上收获桑黄子实体后，装入野外采样箱中低温（4℃左右）保存带回；从南宁某机关大院人工栽培毛桃树上收获树舌灵芝子实体后，装入野外采样箱中低温（4℃左右）保存带回。

实施例1

一种桑黄的快速育种方法，包括以下步骤：

s1.取桑黄和树舌灵芝子实体进行清洗表面尘土等杂质后，用75%的酒精洗两次，在超净工作台中用灭菌刀分别切取两种真菌绿豆大小的菌肉放到菌肉培养基中进行培养；

菌肉培养基的主要成分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000g、桃木木屑粉10g、桑枝木屑粉10g，调节ph6.5。制备过程包括：先将马铃薯洗净去皮，切成小块，加入桃木木屑粉、桑枝木屑粉，加水将马铃薯煮烂（煮沸后大火煮3min，再小火煮10min），用八层纱布过滤，过滤掉桃木木屑粉和桑枝木屑粉，滤液加琼脂和葡萄糖，继续加热搅拌混匀，最后调节ph至6.5，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（115℃）灭菌30分钟左右后，冷却后贮存备用。

s2.挑取步骤s1培养好的菌丝到菌丝培养基内进行共培养，桑黄菌丝和树舌灵芝菌丝接种的距离为2cm；培养24h后，每100ml培养基加入2滴0.3mg/ml氯化钙溶液和1ml浓度为1mol/l的转移因子提取液，并转移到38℃的恒温培养箱中培养36h，再转入12℃的冷柜中继续培养4h，最后在室温下培养12h，挑取融合后的菌丝接种到灭菌的培养物料包中进行新种桑黄子实体的生产。

培养物料包的主要成分：桃木木屑粉20g、桑枝木屑粉30g、甘蔗渣20g、麦麸10g、玉米粉10g、琼脂10g，制备方法为混合后加水搅拌至有湿润感，装袋灭菌备用。

实施例2

一种桑黄的快速育种方法，包括以下步骤：

s1.取桑黄和树舌灵芝子实体进行清洗表面尘土等杂质后，用75%的酒精洗两次，在超净工作台中用灭菌刀分别切取两种真菌绿豆大小的菌肉放到菌肉培养基中进行培养；

菌肉培养基的主要成分：马铃薯220g、葡萄糖22g、琼脂20g、水1000g、桃木木屑粉20g、桑枝木屑粉20g，调节ph6.5。制备过程包括：先将马铃薯洗净去皮，切成小块，加入桃木木屑粉、桑枝木屑粉，加水将马铃薯煮烂（煮沸后大火煮3min，再小火煮15min），用八层纱布过滤，过滤掉桃木木屑粉和桑枝木屑粉，滤液加琼脂和葡萄糖，继续加热搅拌混匀，最后调节ph至6.8，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（115℃）灭菌30分钟左右后，冷却后贮存备用。

s2.挑取步骤s1培养好的菌丝到菌丝培养基内进行共培养，桑黄菌丝和树舌灵芝菌丝接种的距离为2.3cm；培养24h后，每100ml培养基加入3滴0.2mg/ml氯化钙溶液和1.2ml浓度为0.9mol/l的转移因子提取液，并转移到36℃的恒温培养箱中培养37h，再转入10℃的冷柜中继续培养5h，最后在室温下培养10h，挑取融合后的菌丝接种到灭菌的培养物料包中进行新种桑黄子实体的生产。

培养物料包的主要成分：桃木木屑粉10g、桑枝木屑粉35g、甘蔗渣25g、麦麸12g、玉米粉12g、琼脂20g，制备方法为混合后加水搅拌至有湿润感，装袋灭菌备用。

实施例3

一种桑黄的快速育种方法，包括以下步骤：

s1.取桑黄和树舌灵芝子实体进行清洗表面尘土等杂质后，用75%的酒精洗两次，在超净工作台中用灭菌刀分别切取两种真菌绿豆大小的菌肉放到菌肉培养基中进行培养；

菌肉培养基的主要成分：马铃薯180g、葡萄糖18g、琼脂20g、水950g、桃木木屑粉12g、桑枝木屑粉15g，调节ph6.5。制备过程包括：先将马铃薯洗净去皮，切成小块，加入桃木木屑粉、桑枝木屑粉，加水将马铃薯煮烂（煮沸后大火煮3min，再小火煮10min），用八层纱布过滤，过滤掉桃木木屑粉和桑枝木屑粉，滤液加琼脂和葡萄糖，继续加热搅拌混匀，最后调节ph至6.3，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（115℃）灭菌30分钟左右后，冷却后贮存备用。

s2.挑取步骤s1培养好的菌丝到菌丝培养基内进行共培养，桑黄菌丝和树舌灵芝菌丝接种的距离为2cm；培养24h后，每100ml培养基加入2滴0.3mg/ml氯化钙溶液和1ml浓度为1mol/l的转移因子提取液，并转移到38℃的恒温培养箱中培养36h，再转入12℃的冷柜中继续培养4h，最后在室温下培养12h，挑取融合后的菌丝接种到灭菌的培养物料包中进行新种桑黄子实体的生产。

培养物料包的主要成分：桃木木屑粉30g、桑枝木屑粉10g、甘蔗渣20g、麦麸10g、玉米粉10g、琼脂20g，制备方法为混合后加水搅拌至有湿润感，装袋灭菌备用。

对比例1

一种桑黄的育种方法，包括以下步骤：

s1.取桑黄进行清洗表面尘土等杂质后，用75%的酒精洗两次，在超净工作台中用灭菌刀分别切取绿豆大小的菌肉放到菌肉培养基中进行培养；

菌肉培养基的主要成分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水、桃木木屑粉10g、桑枝木屑粉10g，调节ph6.5。制备过程包括：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳散即可），用八层纱布过滤，加热，加18g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g及桃木木屑粉、桑枝木屑粉各10g搅拌均匀，稍冷却后加蒸馏水补足水分至1100g，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（115℃）灭菌30分钟左右后，冷却后贮存备用。

s2.挑取步骤s1培养好的菌丝到菌丝培养基内进行培养，培养24h后，每100ml培养基加入2滴0.3mg/ml氯化钙溶液和1ml浓度为1mol/l的转移因子提取液，并转移到38℃的恒温培养箱中培养36h，再转入12℃的冷柜中继续培养4h，最后在室温下培养12h，挑取融合后的菌丝接种到灭菌的培养物料包中进行桑黄子实体的生产。

培养物料包的主要成分：桃木木屑粉20g、桑枝木屑粉30g、甘蔗渣20g、麦麸10g、玉米粉10g、琼脂10g，制备方法为混合后加水搅拌至有湿润感，装袋灭菌备用。

对比例2

一种树舌灵芝的育种方法，包括以下步骤：

s1.取树舌灵芝进行清洗表面尘土等杂质后，用75%的酒精洗两次，在超净工作台中用灭菌刀分别切取绿豆大小的菌肉放到菌肉培养基中进行培养；

菌肉培养基的主要成分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水、桃木木屑粉10g、桑枝木屑粉10g，调节ph6.5。制备过程包括：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳散即可），用八层纱布过滤，加热，加18g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g及桃木木屑粉、桑枝木屑粉各10g搅拌均匀，稍冷却后加蒸馏水补足水分至1100g，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（115℃）灭菌30分钟左右后，冷却后贮存备用。

s2.挑取步骤s1培养好的菌丝到菌丝培养基内进行培养，培养24h后，每100ml培养基加入2滴0.3mg/ml氯化钙溶液和1ml浓度为1mol/l的转移因子提取液，并转移到38℃的恒温培养箱中培养36h，再转入12℃的冷柜中继续培养4h，最后在室温下培养12h，挑取融合后的菌丝接种到灭菌的培养物料包中进行树舌灵芝子实体的生产。

培养物料包的主要成分：桃木木屑粉20g、桑枝木屑粉30g、甘蔗渣20g、麦麸10g、玉米粉10g、琼脂10g，制备方法为混合后加水搅拌至有湿润感，装袋灭菌备用。

对比例3

对比例3与实施例1基本相同，但实施例2中：

培养24h后，每100ml培养基加入2滴0.3mg/ml氯化钙溶液和1ml浓度为1mol/l的转移因子提取液，并转移到38℃的恒温培养箱中培养36h，再转入12℃的冷柜中继续培养4h，最后在室温下培养12h，

替换为：培养24h后加入3滴0.2mg/ml氯化钙溶液，再常温培养52h。

对比例4

对比例4与实施例1基本相同，但本实施例中未滴加氯化钙溶液及转移因子提取液。

对比例5

对比例5与实施例1基本相同，但本实施例中，菌肉培养基的主要成分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水，调节ph6.5。制备过程包括：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳散即可），用八层纱布过滤，加热，加18g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g搅拌均匀，稍冷却后加蒸馏水补足水分至1080g，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（115℃）灭菌30分钟左右后，冷却后贮存备用。

实施例1~3及对比例1~5的菌丝生长情况以及子实体产量和品质结果如表1和表2所示，其中：子实体中总黄酮的提取及纯化方法为：取桑黄50g，置摇摆式粉碎机中粉碎成中粉，混合均匀，取20g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入70%乙醇400ml，室温下浸泡24h，过滤，残渣重复上述操作一次，合并两次浸提液，浓缩回收乙醇至无醇味，加70%乙醇定容至500ml，摇匀，备用。总黄酮含量的测定:采用亚硝酸-硝酸铝法测定桑黄中总黄酮含量，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml0.307mg/ml芦丁标准液于10.0ml的量瓶中，加入0.3ml5%nano2，摇匀，静置5min；0.3ml5%al(no3)3，摇匀，静置5min；4.0ml4%naoh，用水定容至10.0ml摇匀，静置10min，于504nm处测吸光度a，以芦丁的质量浓度（c，mg/ml）为横坐标，吸光度（a）为纵坐标，平行测定3次，制作标准曲线。

于504nm处测定样品溶液吸光度，由芦丁标准曲线的回归方程求出反应体系中的芦丁质量浓度（c，mg/ml)。

黄酮含量=样品中黄酮浓度/样品纯化物黄酮浓度×100%。

菌丝干重的测试方法：取200ml的菌丝培养基，将培养基清洗干净，取菌丝烘干，称重得重量g，重量g/2即得菌丝干重。

菌丝生长速度的测量方法：将步骤2中培养的菌丝用无菌打孔器取边缘的菌落接入到新的培养皿里培养，再培养3天记录新培养皿里的菌落直径，然后算出菌落半径每天增加的长度。

表1菌丝生长情况

表2子实体的产量与品质