杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌悬浮剂及应用的制作方法

本发明属于农药技术领域，具体涉及杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌悬浮剂及应用。

背景技术：

目前对植物有害的线虫约有3000多种，而在我国发现的有40多种，其中对作物危害最严重的线虫之一是根结线虫。根结线虫虫体微小，生活在植物体内或土壤中，会随着雨水、劳事操作及病株的转移而转移，防治极为困难。据不完全估计，线虫在全球造成的经济损失在1500亿美元左右，我国每年因线虫造成的损失大约35亿美元。在根结线虫病害严重的热带和亚热带地区，致使农作物减产90％以上。根结线虫病，必须严格实行以防为主、综合防治的植保方针，着重抓好农业、物理防治措施，配合化学及生物防治，才能有效地预防其危害。然而市场上可供选择的杀线剂产品种类较少，阿维菌素、噻唑膦等少数产品已经成为线虫防治的绝对主力，这些产品从上市到现在已经连续使用了几十年，因此很多线虫已经产生了严重的抗药性，急需新品种的更新替换。淡紫拟青霉、厚孢轮枝菌等生物杀线虫剂近几年才开始进入市场，但品种与化学杀线剂相比，数量过少，急需创新新型的生物杀线剂产品。

苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)为革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽胞杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽胞形成过程中会产生多种杀虫晶体蛋白，对鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目及线虫等多种害虫均具有较高的杀虫活性，目前是世界上应用最广泛的生物杀虫剂产品。

苏云金芽胞杆菌nbin-863为申请人公开过的具有专利权的菌株，保藏编号为cctccno：m2013612，所述的菌株可用于防治南方根结线虫。

本发明主要针对于nbin-863菌株进行了不同剂型的创制与应用，苏云金芽胞杆菌(bt)等功能微生物产品的市场容量及应用效果与剂型是密切相关的。迄今为止，国内bt剂型有可湿性粉剂，悬浮剂，油悬浮剂，水分散颗粒剂等，不同剂型适用于不同的植物、不同的用药方式或不同的害虫。悬浮剂是水基液体农药制剂，一般是将芽胞杆菌原药或发酵液，以水为介质，与分散剂等表面活性剂、黏度调节剂、防冻剂等，进行湿法超微粉碎而制成，外观是粘稠的可流动性液态。悬浮剂有效成分粒子很细，一般粒径为1-5微米，分散性和展着性都比较好，悬浮率高，粘附于植物表面比较牢固，耐雨水冲刷，药效较高。它兼有乳油和可湿性粉剂的一些特点，没有有机溶剂产生的易燃性和药害问题。悬浮剂可与水任意比例均匀混合分散，使用方便，加工过程未添加有机溶剂，生产过程中基本无三废排放，生产过程简单，不易污染环境，成品率高，安全性高，成为生物农药的主流剂型。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂，用于防治南方根结线虫，同时对人体及环境生物更加友好的生态效益。

本发明的另一个目的在于提供杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂，所述悬浮剂的组分按重量份配比包括：苏云金芽胞杆菌发酵原液93.5～96.2，山梨酸钾0.3～0.5，硅酸镁铝0.5～1.0，木质素磺酸钙3～5，ph值4.5～5.5；所述的苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)为苏云金芽胞杆菌nbin-863，保藏编号为cctccno：m2013612。

所述悬浮剂中苏云金芽胞杆菌的有效菌浓度为52～112×10⁸cfu/ml；

按照常规的苏云金芽胞杆菌的发酵方法即可获得苏云金芽胞杆菌发酵原液。

以上所述的悬浮剂，优选的，所述悬浮剂的组分按重量份配比包括：苏云金芽胞杆菌发酵原液93.75～95.85，山梨酸钾0.4～0.5，硅酸镁铝0.5～1.0，木质素磺酸钙3～5，ph值4.5～5.5；

以上所述的悬浮剂，优选的，所述悬浮剂的组分按重量份配比包括：苏云金芽胞杆菌发酵原液93.75～95.00，山梨酸钾0.4～0.5，硅酸镁铝0.5～1.0，木质素磺酸钙43～5，ph值4.5～5.5；

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂用于防治南方根结线虫的应用，包括利用该悬浮剂制备成南方根结线虫的杀虫剂，特别是番茄、黄瓜、莴苣、萝卜等根结线虫的田间杀灭；还可用于秀丽隐杆线虫的杀灭。

本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的悬浮剂是苏云金芽胞杆菌在生物杀线剂产品剂型上的首创，相对于常规的药剂，对靶标线虫防治效果更为显著，且对使用者和环境生物更为安全。本发明可达到更加有效地防治南方根结线虫，同时对人体及环境生物更加友好的生态效益。田间防效试验结果表明，本发明对南方根结线虫表现出优异的杀虫活性，可作为田间防治的有效药剂加以推广使用。

本发明提供了专门适配于苏云金芽胞杆菌nbin-863及其用于南方根结线虫、秀丽隐杆线虫生物防治的悬浮剂配方。

附图说明

图1是番茄根结线虫生物防治效果图；

其中，a.清水对照组；b.nbin-863生物组；c.阿维.噻唑膦化学组；d.清水对照组的植物根部情况；e.nbin-863生物组的植物根部情况；f.阿维.噻唑膦化学组的植物根部情况。

图2是黄瓜根结线虫生物防治效果图；

其中，a.清水对照组；b.nbin-863生物组；c.噻唑膦化学组。

图3是萝卜根结线虫生物防治效果图。

图4是莴苣根结线虫生物防治效果图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如无特别说明，均为本领域的常规操作方法，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

本发明实施例所述的苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)为苏云金芽胞杆菌nbin-863，保藏编号为cctccno：m2013612，已在申请号为201410137036.4的专利文件中公开。

本发明所用的苏云金芽胞杆菌发酵原液的制备方法包括：

发酵培养基采用下列重量百分比的各组分配制而成，淀粉3.52％、豆粕3.47％，酵母粉0.4％，工业蛋白胨0.3％，ph7.0，其余为水。

在200l发酵罐中进行发酵，(装罐体积120l)每分钟通气量与发酵罐容积比为1.5：1，培养温度30℃，苏云金芽胞杆菌nbin-863种子液接种量1％，转速300r/min，发酵时间36h。

发酵完毕后，发酵原液中的有效菌浓度是79×10⁸cfu/ml，用于以下实施例。

实施例1：

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂的制备：

863悬浮剂1：

苏云金芽胞杆菌发酵原液94.7g，山梨酸钾0.3g，硅酸镁铝为1.0g，木质素磺酸钙4.0g，用稀盐酸调ph值至4.5。

将各组分加入苏云金芽胞杆菌发酵原液中，搅拌均匀即可。

863悬浮剂2：

苏云金芽胞杆菌发酵原液94.95g，山梨酸钾0.3g，硅酸镁铝为0.75g，木质素磺酸钙4.0g，用稀盐酸调ph值至5.0。

863悬浮剂3：

苏云金芽胞杆菌发酵原液93.7g，山梨酸钾0.3g，硅酸镁铝为1.0g，木质素磺酸钙5.0g，用稀盐酸调ph值至5.5。

863悬浮剂4：

苏云金芽胞杆菌发酵原液94.1g，山梨酸钾0.4g，硅酸镁铝为0.5g，木质素磺酸钙5.0g，用稀盐酸调ph值至5.0。

863悬浮剂5：

苏云金芽胞杆菌发酵原液95.85g，山梨酸钾0.4g，硅酸镁铝为0.75g，木质素磺酸钙3.0g，用稀盐酸调ph值至5.5。

863悬浮剂6：

苏云金芽胞杆菌发酵原液94.6g，山梨酸钾0.4g，硅酸镁铝为1.0g，木质素磺酸钙4.0g，用稀盐酸调ph值至4.5。

863悬浮剂7：

苏云金芽胞杆菌发酵原液95.0g，山梨酸钾0.5g，硅酸镁铝为0.5g，木质素磺酸钙4.0g，用稀盐酸调ph值至5.5。

863悬浮剂8：

苏云金芽胞杆菌发酵原液93.75g，山梨酸钾0.5g，硅酸镁铝为0.75g，木质素磺酸钙5.0g，用稀盐酸调ph值至4.5。

863悬浮剂9：

苏云金芽胞杆菌发酵原液95.5g，山梨酸钾0.5g，硅酸镁铝为1.0g，木质素磺酸钙3.0g，用稀盐酸调ph值至5.0。

实施例2：

对照组悬浮剂的制备：

1)发酵原液水稀释液：直接用水稀释苏云金芽胞杆菌发酵原液，使其有效菌浓度与863悬浮剂6相同；

2)助剂替换对照1：

苏云金芽胞杆菌发酵原液94.6g，苯甲酸钠0.4g，硅酸镁铝为1.0g，木质素磺酸钙4.0g，用稀盐酸调ph值至4.5。

3)助剂替换对照2：

苏云金芽胞杆菌发酵原液94.6g，山梨酸钾0.4g，黄原胶为1.0g，木质素磺酸钙4.0g，用稀盐酸调ph值至4.5。

实施例3：

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂对秀丽隐杆线虫的室内活性测定：

lc50(mg/l)计算的操作步骤：在96孔板中按照5个不同浓度梯度(1000mg/l、100mg/l、10mg/l、1mg/l、0.1mg/l)加入苏云金芽胞杆菌悬浮剂(实施例1制备)及对照(实施例2制备)，每孔加入40头左右线虫，生测总体系为200μl，纯净水做对照，每组3次重复，16℃条件下作用1天，在奥林巴斯倒置显微镜下观察计数，统计每孔死亡虫数。利用ld50数据处理软件(c)蓝宙工作室version1.01计算lc50，结果见表1。

综合各指标，863悬浮剂6效果最好，不仅流动性、分散性较好，而且较耐贮存。在本实施例中，54℃热储前的悬浮剂为新配悬浮剂。

表1杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂对秀丽隐杆线虫的室内活性测定结果

表2各药剂室温(20℃±5℃)保存6个月后的各项指标

实施例4：

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂对番茄根结线虫的田间活性测定：

试验于2017年在湖北省利川建始县土壤中番茄根结线虫严重的大棚进行。健康的番茄苗移栽至含有根结线虫的虫卵的大棚中后1个星期开始进行各处理。

设置3个处理组：btnbin-863生物防治组、21％噻唑膦·阿维菌素化学防治组以及清水对照组。

生物组：番茄菌株全部存活且生长旺盛，根瘤几乎没有看见，能正常收获到番茄，病情为1级，病情指数为17.13％，防效为81.46％。化学组：番茄植株尚存活，但根瘤又大又多，产量减少40％，病情为3级，病情指数为59.88，防效为35.18％。

对照组：对照组及其他十余个未做任何处理的大棚均为绝收，植株大部分死亡，病情为4级，病情指数为92.38％。

按照下面的公式计算病情指数和防治效果(杨立军等，2017)：

病情指数＝[∑(每个病级植株数×该级代表数值)/(总株数×7)]×100％

防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

药剂持效期与用量上，生物组持效期75天，1.5kg/亩，成本80元/亩，化学组持效期60天，2kg/亩，成本120元/亩。

以上所用的药剂均为新配制，btnbin-863生物防治组用的配方是863悬浮剂6。

表3各处理组对番茄根结线虫防效结果

实施例5：

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂对黄瓜根结线虫的田间活性测定：

试验于2019年在湖北省荆州市虎渡河土壤中黄瓜根结线虫严重的大棚进行。健康的黄瓜苗移栽至含有根结线虫的虫卵的大棚中后1个星期开始进行各处理。

设置3个处理组：btnbin-863生物防治组、20％噻唑膦化学防治组以及清水对照组。黄瓜收获后查看结果，生物组防效达70.01％，化学组防效达61.31％。

防效的计算方式同实施例4。

以上所用的药剂均为新配制，btnbin-863生物防治组用的配方是863悬浮剂6。

表4各处理组对黄瓜根结线虫防效结果

实施例6：

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂对萝卜根结线虫的田间活性测定：

试验于2016年在湖北省荆门市沙洋土壤中萝卜根结线虫严重的大棚进行。萝卜播种至至含有根结线虫的虫卵的大棚中后2周长至苗期，然后进行各处理。

设置3个处理组：btnbin-863生物防治组、1.8％阿维菌素乳油化学防治组以及清水对照组。

以上所用的药剂均为新配制，btnbin-863生物防治组用的配方是863悬浮剂6。

萝卜收获后查看结果，生物组防效达68.23％，1.8％阿维菌素乳油化学组防效39.36％，化学农药使用量减少50％以上，提高了萝卜商品性。

防效的计算方式同实施例4。

表5各处理组对萝卜根结线虫防效结果

实施例7：

杀南方根结线虫苏云金芽胞杆菌悬浮剂对莴苣根结线虫的田间活性测定：

试验于2020年在湖北省荆州市虎渡河土壤中莴苣根结线虫严重的大棚进行。健康的莴苣苗移栽至含有根结线虫的虫卵的大棚中后1个星期开始进行各处理。

设置5个处理组：棉隆防治组、btnbin-863微生物土壤处理剂生物防治组、棉隆+btnbin-863微生物土壤处理剂防治组(先用棉隆进行土壤消毒，再进行863灌根处理)、噻唑膦化学防治组以及清水对照组。

以上所用的药剂均为新配制，btnbin-863生物防治组用的配方是863悬浮剂6。

棉隆防治组防效55.35％，棉隆+微生物土壤处理剂防治组防效64％，btnbin-863微生物土壤处理剂防效达46.45％，噻唑膦化学组防效达42.3％。

防效的计算方式同实施例4。

表6各处理组对莴苣根结线虫防效结果