多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9的新用途

本申请属于微生物技术领域，具体涉及多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9的新用途。

背景技术：

植物病原菌物是引起植物病害的主要病原，如疫霉属(phytophthora)、镰刀菌属(fusarium)和丝核菌属(rhizoctonia)等是常见的植物病原菌，常给农林业生产造成严重损失。目前化学农药仍然是防治植物病害的主要方法，但化学农药的长期大规模滥用，不仅导致土壤中的有益微生物受到危害、生态环境遭到破坏，而且还严重影响人类健康。生物防治作为一种环境友好型的植物病害控制措施已成为国内外的研究热点。

植物根际促生细菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，pgpr)可通过产生氰化氢(hcn)、抗生素及真菌细胞壁水解酶等代谢物质来抑制植物病原真菌的生长和繁殖。芽孢杆菌(bacillusspp.)菌株可产生polymyxin、circulin和colistin等抗生素，对革兰氏阳性和阴性细菌以及一些致病性真菌具有拮抗活性。hill等研究发现由荧光假单孢(pseudomonasfluorescens)bl915菌株产生的硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)对引起棉花枯萎的立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)具有抑制作用。gao等报道了由瓦雷兹芽孢杆菌(b.velezensis)zsy-1产生的挥发性化合物对植物病原真菌具有抗真菌活性。除此之外，pgpr还可通过竞争和寄生作用及诱导抗性等机制来抑制植物病原菌。

洋葱伯克霍尔德氏菌群(burkholderiacepaciacomplex，简称bcc)是一组表型相近但基因型不同的复合物，许多bcc种类为植物根际促生菌，可产生不同的抗菌化合物来抑制植物病原菌，如产生抗生素和铁载体等代谢物质来抑制腐霉(pythiumspp.)、立枯丝核菌和镰刀菌(fusariumspp.)的孢子萌发和菌丝生长。deng等报道了菌株b.contaminansms14具有广谱的抗菌活性，并显示出其在生物农药开发方面的巨大潜力。

本申请人前期从松树根际筛选获得一株可促进林木生长的多噬伯克霍尔德氏菌(burkholderiamultivorans)ws-fj9[houl.studiesonscreeningofefficientphosphate-solubilizingbacteriaintherhizosphereofpinetreesandontheircharacteristics[d].nanjing：nanjingforestryuniversity，2012.]，研究表明，该菌株具有良好的溶磷特性，并可明显促进林木生长以及对松枯梢病原菌(sphaeropsissapinea)具有较强的拮抗活性(cn102604860a)。但关于该菌株对林木病原卵菌及其他病原真菌的拮抗活性如何未见报道，且该菌株发酵液抑菌作用的稳定性如何也未知。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本申请所要解决的技术问题是提供多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9在抑制林木病原菌樟疫霉和/或拟茎点霉中的应用，为植物病害生物防治中的开发和应用提供参考依据。

为解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：

多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9在抑制林木病原菌中的应用，所述的林木病原菌为樟疫霉和/或拟茎点霉。

多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9的发酵液在抑制林木病原菌中的应用，所述的林木病原菌为樟疫霉和/或拟茎点霉。

所述的发酵液为无菌发酵液。

所述的无菌发酵液的制备方法为：于固体lb平板上活化菌株ws-fj9；用接种环挑取菌株ws-fj9单菌落于20ml液体lb培养基中，在28℃、200r/min的摇床中振荡培养24h获得种子液；按照1％的接种量将种子液重新转接至lb液体培养基中，在28℃、200r/min的摇床中振荡培养72h后获得发酵液；将发酵液1000r/min离心20min后获取上清液，用0.22μm滤膜过滤，即获得无菌发酵滤液。

所述的无菌发酵液的使用温度范围为4～100℃。

所述的无菌发酵液具有紫外线稳定性。

所述的无菌发酵液的ph应用范围为2～12，优选ph为8.0-9.0。

本申请对多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9的抑菌活性进行检测，发现菌株ws-fj9的菌体对病原卵菌樟疫霉和真菌拟茎点霉的拮抗效果显著。进一步检测菌株ws-fj9的无菌发酵滤液对病原菌菌丝生长的影响，发现无菌滤液对拟茎点霉的菌丝生长的抑制率和对樟疫霉的菌丝生长抑制率不同，表明ws-fj9菌株对卵菌和真菌的拮抗机制存在差异。菌株ws-fj9的无菌发酵滤液对拟茎点霉的拮抗效果较好；对于樟疫霉而言，对峙培养的抑制效果要优于无菌滤液，说明ws-fj9菌株除了分泌抑菌物质外，在与病原菌共培养时还存在某些诱导作用以及空间位点和营养的竞争，这些拮抗机制综合提高了拮抗菌株的抑制效率。研究ws-fj9菌株发酵液的稳定性发现，该菌株在4-100℃温度范围内其抑菌活性几乎没有变化，ph2.0-12.0酸碱处理以及蛋白酶处理后也仍能保持较高的抑菌活性。农林业上施用的生物防治菌剂和常规有机合成农药一样，都要受到环境的影响，多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9的无菌发酵滤液具有很好的热和酸碱等稳定性，表明该菌株能更好的适应多种生境，能有效抑制林木病原菌樟疫霉和/或拟茎点霉，本发明为该菌株在植物病害生物防治中的开发和应用提供了参考依据。

有益效果：与现有技术相比，采用平板对峙法检测菌株ws-fj9对林木病原真菌和卵菌的抑制效果；并通过菌丝生长抑制速率法对其无菌发酵滤液的抑菌活性和稳定性进行测定。结果表明菌株ws-fj9菌悬液对卵菌樟疫霉(phytophthoracinnamomi)的抑制作用最好，抑菌带宽度为(14.82±0.20)mm；无菌发酵滤液对真菌拟茎点霉(phomopsismacrospore)的抑制效果显著，抑菌率为62.22％；经无菌发酵滤液处理后的病原菌菌丝内的丙二醛(mda)含量增高，可溶性糖和蛋白含量显著降低。同时，该无菌发酵液在4～100℃、ph2～12范围内性能稳定，且具有优良的紫外线稳定性。可见多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9对林木病原菌物具有很好的生防潜力。

附图说明

图1是多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9与5种不同植物病原菌的对峙培养结果图；

图2是多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9无菌发酵滤液对林木病原菌的拮抗作用结果图；

图3是多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9无菌发酵滤液对林木病原菌菌丝代谢的影响结果图；图中，a：丙二醛含量；b：还原糖含量；c：可溶性蛋白含量；

图4是不同温度条件下多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9无菌发酵滤液的稳定性结果图；图中，小写字母表示差异显著(p＜0.05)；

图5是不同紫外线条件下多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9无菌发酵滤液的稳定性结果图；图中，小写字母表示差异显著(p＜0.05)；

图6是不同ph条件下多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9无菌发酵滤液的稳定性结果图；图中，小写字母表示差异显著(p＜0.05)。

具体实施例

下面结合具体实施例对本申请做进一步的说明。

以下实施例中所使用的材料与方法，具体如下：

1、菌株：多噬伯克霍尔德氏菌(burkholderiamultivorans)ws-fj9，同cn102604860a公开的多噬伯克霍尔德氏菌ws-fj9，现保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为no：m2011435。

植物病原菌：金黄壳囊孢(cytosporachrysosperma)、樟疫霉(phytophthoracinnamomi)、拟茎点霉(phomopsismacrospore)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)，均保存于南京林业大学森林病理实验室。

2、培养基

lb培养基和pda培养基的配制方法见参考文献[黄玉琴，负建民，张紊玮，艾对元，漆倩涯，姚博.bacilluspumilushn-10对trichotheciumroseum的拮抗作用及菌体结构的影响[j].食品与生物技术学报.2019，38(06)：25-33.]；

3、测定方法

还原糖含量的测定、丙二醛含量的测定：参考[梁军，王媛，贾秀贞，张星耀.溃疡病菌对杨树愈伤组织细胞膜透性、可溶性糖及mda含量的影响[j].林业科学.2008(08)：72-77.]的方法进行测定。

可溶性蛋白含量的测定：参考[chouc.wavelet-basedmulti-scaleentropyanalysisofcomplexrainfalltimeseries[j].entropy.2011，13(1)：241-253.]的方法进行测定。

实施例1ws-fj9抑菌谱的测定

采用平板对峙法：用无菌打孔器(直径5mm)在已活化好的立枯丝核菌、樟疫霉、金黄壳囊孢和拟茎点霉平板上打孔，将菌碟接入pda平板中央。取一环细菌，在距离平板中央圆心左右各3cm处分别划线接种ws-fj9，于28℃恒温培养3-4d，待空白对照长满整个培养皿时，用游标卡尺测量抑菌圈宽度，判断拮抗效果。每个处理3个重复。抑菌带宽度为病原菌菌落边缘到细菌菌苔边缘之间的距离(mm)。

如图1所示，菌株ws-fj9对4种林木病原菌均有不同程度的拮抗作用，其中菌株ws-fj9对樟疫霉的抑制效果最好，与对照组相比，在接种ws-fj9的平板上可以看出樟疫霉的菌丝生长受到抑制，靠近细菌一侧的菌丝逐渐萎缩，形成明显的抑菌带，抑菌带宽度达到了(14.82±0.20)mm。对拟茎点霉的抑制效果次之，抑菌带宽度达到了(9.31±0.20)mm。对金黄壳囊孢和立枯丝核菌的抑制效果则较弱。

实施例2菌株ws-fj9无菌发酵滤液的抑菌谱测定

1)无菌发酵滤液的制备

于固体lb平板上活化菌株ws-fj9。用接种环挑取菌株ws-fj9单菌落于20ml液体lb培养基中，在28℃、200r/min的摇床中振荡培养24h获得种子液。按照1％的接种量将种子液重新转接至lb液体培养基中，在28℃、200r/min的摇床中振荡培养72h后获得发酵液。将发酵液1000r/min离心20min后获取上清液，用0.22μm滤膜过滤，即获得无菌发酵滤液。

2)无菌发酵滤液的抑菌活性检测

按照10％的比例将无菌发酵滤液加入pda培养基中，摇匀后倒入培养皿中制成带毒平板。将病原菌菌碟接种至带毒平板的中央，以加入等量的液体lb培养基为对照，每个处理重复3次，置于28℃条件下培养3d。用十字交叉法测量病原菌的直径大小。抑菌率的测定公式为：抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。

菌株ws-fj9的无菌发酵滤液对2株林木病原菌的抑菌效果如图2所示，菌株ws-fj9对拟茎点霉的菌丝生长抑制效果明显，与对照组相比，在含有菌株ws-fj9发酵液的培养基上，病原菌生长缓慢，抑菌率为62.22％。菌株ws-fj9的无菌发酵滤液对樟疫霉的菌丝生长抑制作用次之，抑菌率为22.78％。

实施例3无菌发酵滤液对林木病原菌代谢的影响

1、酶液的制备：挑取植物病原菌菌块于20ml液体pda中，25℃条件下摇培4d后加入菌株ws-fj9的无菌发酵滤液，摇培48h后将病原菌菌丝取出，用无菌水进行反复清洗后用滤纸将菌丝吸干，称重并记录。将菌丝移至研钵中，加入tris-hcl提取液(0.05mol/l，ph＝7.8)，冰浴下研磨至糊状。将研磨液于4℃、12000r/min离心15min，取上清液备用。

2种林木病原菌经ws-fj9菌株的无菌发酵滤液处理后，其菌丝内丙二醛含量均明显高于对照组(图3a)，说明这些病原菌的细胞膜均受到影响；同时，2种病原菌菌丝内的可溶性糖和蛋白含量均要低于对照组(图3b和图3c)，表明菌株ws-fj9的无菌滤液可影响病原菌菌体的代谢合成，从而导致菌丝细胞壁水解受损，使得菌体生长受到影响。

实施例4无菌发酵滤液抑菌作用的稳定性检测

1、温度对无菌发酵滤液抑菌稳定性的影响

无菌发酵滤液置入4、40、60、80、100℃不同温度的水浴锅中处理1h，处理完毕之后将之冷却至室温，根据上述方法测定无菌发酵滤液对3株病原菌的抑菌作用，对照组为未经过处理的28℃无菌发酵滤液，每个处理3个重复。

将菌株ws-fj9的无菌发酵滤液进行4℃低温处理以及40-100℃高温处理，其处理后的抑菌效果如图4所示。与对照组(t＝28℃)相比，经过5种不同温度处理的无菌滤液对樟疫霉抑菌活性无影响；当对无菌滤液进行60-100℃高温处理时，随着温度的逐渐升高，对拟茎点霉的抑菌率逐渐降低，但抗菌物质在100℃时仍保持40％左右的抑菌率，表明无菌滤液中的抗菌物质具有良好的热稳定性。

2、紫外光对无菌发酵滤液抑菌稳定性的影响

取0.5ml的无菌发酵滤液于直径为9cm的无菌培养皿中，揭开皿盖放置于距30w紫外灯30cm处，分别照射15、30、60、180、360min后，检测无菌发酵滤液对2株病原菌的抑菌作用，对照组为未经紫外线照射的无菌发酵滤液，每个处理3个重复。

菌株ws-fj9的无菌发酵滤液经紫外线照射后，对植物病原菌的抑菌活性如图5所示。可以看出无菌滤液经不同时长的紫外线照射后，与对照组相比，病原菌的抑菌率没有发生明显的变化，这表明菌株ws-fj9具有良好的紫外线稳定性。

3、ph对无菌发酵滤液抑菌稳定性的影响

用1mol/l的hcl溶液和1mol/l的naoh溶液调节无菌发酵滤液的ph为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，静置24h后调回至无菌滤液的原始值(ph＝8.67)，分别测定无菌发酵滤液对病原菌的抑菌作用，对照组为未经酸碱溶液处理的无菌发酵滤液，每个处理3个重复。

菌株ws-fj9的无菌发酵滤液在不同ph值条件下，对植物病原菌的抑菌活性如图6所示。与对照组(原始ph＝8.67)相比，当无菌滤液在ph为2.0-12.0时，对拟茎点霉、樟疫霉抑菌活性均较稳定，表明菌株ws-fj9的无菌滤液中的抑菌活性物质具有较强的酸碱稳定性。