一种花药培养获得百脉根再生植株的方法与流程

本发明属于植物组织技术领域，尤其涉及一种花药培养获得百脉根再生植株的方法。

背景技术：

目前：百脉根原产于欧、亚温暖地带，是豆科百脉根属多年生牧草。具有产草量高、绿期长、蛋白含量高、营养丰富、适口性好且家畜采食后不发生鼓胀等优点。百脉根具有耐热、耐水淹、耐瘠薄、耐酸等特点，是我国温暖湿润地区极有希望的优良牧草。因此，开展百脉根的育种研究工作对于南方草地畜牧业的发展具有十分重要的意义。

栽培百脉根为同源四倍体，自交不亲和，具有高度的杂合性，采用常规育种进程缓慢、效率差。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：栽培百脉根为同源四倍体，自交不亲和，具有高度的杂合性，采用常规育种进程缓慢、效率差。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种花药培养获得百脉根再生植株的方法。

本发明是这样实现的，一种花药培养获得百脉根再生植株的方法，所述花药培养获得百脉根再生植株的方法包括以下步骤：

步骤一，进行外植体花药的准备；将外植体花药置于诱导组织培养基上进行培养，得到愈伤组织；

步骤二，分批挑选大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到胚诱导培养基中培养得到胚性愈伤组织；

步骤三，将培养得到的胚性愈伤组织转入愈伤组织继代培养基暗培养，培养出继代胚性愈伤组织；

步骤四，将继代胚性愈伤组织进行胚状体诱导培养，并将得到的胚状体转接到无激素的再生培养基上，进行培养得到百脉根再生植株。

进一步，步骤一中，所述外植体花药的准备包括：

(1)选取生长至适宜时期的百脉根花序装于塑料袋内置于冰箱进行低温预处理；

(2)对低温处理后的百脉根花序置于无菌操作台中进行消毒，用滤纸吸干表面水分后，剥取花药。

进一步，所述百脉根花序为经显微镜镜检，选取小孢子处于单核中期或单核靠边期的百脉根花序。

进一步，所述将花序置于冰箱进行低温预处理包括：将花药放置于3-5℃的冰箱处理6-12小时。

进一步，所述花序的消毒处理包括：

首先，将花序经流水冲洗20-30min后，于无菌操作台中用无菌水冲洗3-5遍；

其次，采用70％-75％的乙醇消毒15-20s，无菌水冲洗3-5遍，重复1次；

最后，用添加有0.5-1.0％tween的0.1％的升汞消毒60-120s，用无菌水再冲洗5-8遍。

进一步，步骤一中，所述将外植体花药置于诱导组织培养基上进行培养，得到愈伤组织包括：

将花药外植体置于45mg/l的ba溶液中浸泡8-15min，在光照强度为1500～2000lx，光照时间为8～12小时/天，温度为20～28℃条件下，培养10～20天，取出，放入诱导培养基上，反复培养至花药上长出愈伤组织。

进一步，所述诱导培养基为添加有0.6-3.0mg/ltdz和0.6-3.0mg/liaa的dkw、1.5g/l天门冬氨酸，15g/l蔗糖，ph为5.5-6的培养基。

进一步，步骤二中，所述分批挑选大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到胚诱导培养基中培养得到胚性愈伤组织包括：

1)分批挑选大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织；

2)将挑选的花药愈伤组织转接胚诱导培养基上进行培养，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚；

3)将子叶型胚切成2╳2～5mm的小块，接入增殖培养基上，在温度28-30℃，光照时间13-15h/d，光照强度10-15μmol·m·s下培养40天；得到胚性愈伤组织。

进一步，步骤2)中，所述将挑选的花药愈伤组织转接胚诱导培养基上进行培养包括：

培养条件：温度28-30℃，光照时间13-15h/d，光照强度10-15μmol·m·s；培养60～90天。

进一步，步骤三中，所述暗培养包括：于培养温度为32-35℃，暗培养8-10天。

进一步，步骤四中，所述将得到的胚状体转接到无激素的再生培养基上，进行培养包括：

培养温度为24～26℃，光照度为8000～10000lux，每天的光照时间为18h，培养至生出根和芽，得到再生植株。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明以百脉根的花药为外植体，进行离体培养，不仅加快了育种进程还提高了选择效率，具有重要的实用意义。

本发明通过愈伤组织继代培养，使愈伤组织更契合其发育过程，从而有效提高了胚状体的诱导率。本发明通过继代培养基对百脉根花药愈伤组织继代，使其更利于胚性表达，经继代培养基继代后，体胚分化率大幅提高，使得基于花药再生体系的研究和生产效率大大提高。

本发明工艺流程简单，生产成本低，所采用的培养基成分易于获取，具有很大的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的花药培养获得百脉根再生植株的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的外植体花药的准备方法流程图。

图3是本发明实施例提供的花序的消毒处理方法流程图。

图4是本发明实施例提供的将外植体花药置于诱导组织培养基上进行培养，得到愈伤组织的方法流程图。

图5是本发明实施例提供的分批挑选大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到胚诱导培养基中培养得到胚性愈伤组织的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种花药培养获得百脉根再生植株的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的花药培养获得百脉根再生植株的方法包括以下步骤：

s101，进行外植体花药的准备；将外植体花药置于诱导组织培养基上进行培养，得到愈伤组织；

s102，分批挑选大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到胚诱导培养基中培养得到胚性愈伤组织；

s103，将培养得到的胚性愈伤组织转入愈伤组织继代培养基暗培养，培养出继代胚性愈伤组织；

s104，将继代胚性愈伤组织进行胚状体诱导培养，并将得到的胚状体转接到无激素的再生培养基上，进行培养得到百脉根再生植株。

如图2所示，步骤s101中，本发明实施例提供的外植体花药的准备包括：

s201，选取生长至适宜时期的百脉根花序装于塑料袋内置于冰箱进行低温预处理；

s202，对低温处理后的百脉根花序置于无菌操作台中进行消毒，用滤纸吸干表面水分后，剥取花药。

本发明实施例提供的百脉根花序为经显微镜镜检，选取小孢子处于单核中期或单核靠边期的百脉根花序。

本发明实施例提供的将花序置于冰箱进行低温预处理包括：将花药放置于3-5℃的冰箱处理6-12小时。

如图3所示，本发明实施例提供的花序的消毒处理包括：

s301，将花序经流水冲洗20-30min后，于无菌操作台中用无菌水冲洗3-5遍；

s302，采用70％-75％的乙醇消毒15-20s，无菌水冲洗3-5遍，重复1次；

s303，用添加有0.5-1.0％tween的0.1％的升汞消毒60-120s，用无菌水再冲洗5-8遍。

如图4所示，步骤s101中，本发明实施例提供的将外植体花药置于诱导组织培养基上进行培养，得到愈伤组织包括：

s401，将花药外植体置于45mg/l的ba溶液中浸泡8-15min；

s402，在光照强度为1500～2000lx，光照时间为8～12小时/天，温度为20～28℃条件下，培养10～20天，取出；

s403，放入诱导培养基上，反复培养至花药上长出愈伤组织。

本发明实施例提供的诱导培养基为添加有0.6-3.0mg/ltdz和0.6-3.0mg/liaa的dkw、1.5g/l天门冬氨酸，15g/l蔗糖，ph为5.5-6的培养基。

如图5所示，步骤s102中，本发明实施例提供的分批挑选大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织转移到胚诱导培养基中培养得到胚性愈伤组织包括：

s501，分批挑选大小、颜色、质地一致的花药愈伤组织；

s502，将挑选的花药愈伤组织转接胚诱导培养基上进行培养，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚；

s503，将子叶型胚切成2╳2～5mm的小块，接入增殖培养基上，在温度28-30℃，光照时间13-15h/d，光照强度10-15μmol·m·s下培养40天；得到胚性愈伤组织。

步骤s502中，本发明实施例提供的将挑选的花药愈伤组织转接胚诱导培养基上进行培养包括：

培养条件：温度28-30℃，光照时间13-15h/d，光照强度10-15μmol·m·s；培养60～90天。

步骤s103中，本发明实施例提供的暗培养包括：于培养温度为32-35℃，暗培养8-10天。

步骤s104中，本发明实施例提供的将得到的胚状体转接到无激素的再生培养基上，进行培养包括：

培养温度为24～26℃，光照度为8000～10000lux，每天的光照时间为18h，培养至生出根和芽，得到再生植株。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。