一种冷冻保护剂及其制备方法和应用

1.本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种冷冻保护剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.冷冻保存技术是一种利用极低温使活细胞、器官和组织保存结构完整性的有效途径，该方法能够使长期储存于低温环境下(通常是在液氮或液氮蒸汽中)的细胞、组织和器官，从其新陈代谢极低甚至停止的状态后恢复正常功能。迄今为止，冷冻保存技术在辅助生殖医学、干细胞技术、细胞治疗、组织工程、抗癌药物开发和体外筛选、药理学、基础科学研究等生物医学领域取得了突破性进展。其中，间充质干细胞(mscs)是细胞治疗领域的宝贵资产。人骨髓来源的间充质干细胞(hbm-mscs)是临床试验中最常用的细胞类型之一。从而引发了大量学者对其进行研究和测试，以期为各种各样的疾病和病症的治疗提供有效途径。然而在冷冻保存过程中，冰的结晶及其重结晶会造成细胞、组织和器官在损伤及死亡的主要原因之一。玻璃化冷冻保存方法(抑制冰晶成核)是一种利用超快速冷冻与高浓度的冷冻保护剂相结合，以实现溶液快速穿越水的结晶区达到溶液玻璃态的冷冻保存方法，该方法被认为是一种很有前途的冷冻方法，已被广泛地应用于细胞、组织和器官的冷冻保存领域。然而在复温解冻的阶段，退玻化导致的冰晶的成核及重结晶依旧会发生。这种不受控制的冰重结晶/生长将会对细胞带来致命损伤，会导致细胞功能的减弱甚至丧失，如会导致干细胞失去自发分化能力，使冷冻保存的干细胞丧失在细胞药物中的应用。为了避免冰的结晶及其重结晶给细胞带来风险，常常采用高浓度的有机溶剂(如二甲基亚砜(dmso)等(10-15％)，以在冷冻保存过程中实现低温保存介质的玻璃化和无冰凝固。然而，dmso具有细胞毒性和表观遗传毒性，美国fda规定，非特殊、非不可替代情况禁止其使用。综上，目前采用的冷冻保护剂不具备冷冻过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。
3.为了突破细胞冷冻保存的瓶颈，并消除dmso毒性造成的临床风险，因此，开发新型高效、安全、具有生物兼容性的可抑制/控制冰晶生长以及再结晶的抑冰/控冰材料，以期能够改善现有技术冷冻保存存在的上述技术问题，并得到能够用于间充质干细胞、尤其是人骨髓来源的间充质干细胞的冷冻保护剂，成为本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为了改善上述技术问题，本发明提供一种冷冻保护剂，其包含式(i)所示结构的两亲性化合物：
[0005][0006]
根据本发明的实施方案，所述两亲性化合物可以采用葡萄糖酸内酯与缬氨酸反应制备得到。
[0007]
根据本发明的实施方案，所述冷冻保护剂还包含缓冲液。其中，所述缓冲液可以选自本领域已知的细胞培养缓冲液，例如pbs缓冲液、dpbs缓冲液、mem缓冲液、dmem缓冲液、hepes-buffered htf缓冲液或其他细胞培养缓冲液中的任一种，优选pbs缓冲液。在本发明的一个实施方案中，所述pbs缓冲液的ph为7.0-7.4。
[0008]
根据本发明的实施方案，所述冷冻保护剂还可以包含水溶性糖和/或多元醇。
[0009]
优选地，所述水溶性糖可以选自蔗糖、海藻糖、半乳糖、聚蔗糖和葡聚糖等中的至少一种，优选为蔗糖和/或海藻糖。
[0010]
优选地，所述多元醇可以选自乙二醇、β-巯基乙醇、甘油、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇和2,3-丁二醇等中的至少一种，优选为乙二醇。
[0011]
根据本发明的实施方案，所述冷冻保护剂中，两亲性化合物的浓度可以为0.5-350mm，优选为10-300mm，更优选为20-200mm，示例性为0.5mm、10mm、15mm、20mm、30mm、35mm、50mm、80mm、100mm、150mm、170mm、200mm。
[0012]
根据本发明的实施方案，所述冷冻保护剂中，水溶性糖的浓度可以为0.1-4.0m，如0.1-1.0m，1.0-4.0m；示例性为0.1m、0.25m、0.5m、1.0m、2.0m、4.0m。
[0013]
根据本发明的实施方案，所述冷冻保护剂中，多元醇的含量为0.1-40v/v％，例如为1-20v/v％；示例性为0.1v/v％、1v/v％、5v/v％、10v/v％、15v/v％、20v/v％、40v/v％。
[0014]
其中，“v/v％”指多元醇与冷冻保护剂的体积百分比，例如100ml冷冻保护剂中含有多元醇的量为0.1-40ml。
[0015]
根据本发明的实施方案，所述两亲性化合物由如下方法制备得到：葡萄糖酸内酯与缬氨酸反应制备得到所述两亲性化合物。
[0016]
根据本发明的实施方案，所述反应在有机溶剂中进行。优选地，所述有机溶剂可以为甲醇。
[0017]
根据本发明的实施方案，所述葡萄糖酸内酯与缬氨酸的摩尔比为1:(1-5)，示例性为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。
[0018]
根据本发明的实施方案，所述葡萄糖酸内酯与缬氨酸反应的温度为30-70℃，示例性为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。进一步地，所述葡萄糖酸内酯与缬氨酸反应的时间可以为24-48h，示例性为24h、30h、36h、42h、48h。
[0019]
根据本发明的实施方案，所述葡萄糖酸内酯与有机溶剂的摩尔体积比为1mmol:(20-40)ml，例如1mmol:30ml。
[0020]
根据本发明的实施方案，所述两亲性化合物的制备方法还包括待反应结束后，对反应液进行冷却、固液分离(例如过滤)、干燥(例如旋干溶剂)，制备得到所述两亲性化合
物。
[0021]
根据本发明的实施方案，所述冷却为冰水浴冷却。例如，所述冷却的时间为3-8h，优选为5h。
[0022]
根据本发明示例性的实施方案，所述冷冻保护剂包含：式(i)所示结构的两亲性化合物、水溶性糖、多元醇、缓冲液；
[0023][0024]
其中，所述两亲性化合物的浓度为0.5-350mm，所述水溶性糖的浓度为0.1-4.0m，所述多元醇的含量为0.1-40v/v％；
[0025]
优选地，所述水溶性糖选自蔗糖和/或海藻糖，所述多元醇为乙二醇。
[0026]
本发明还提供上述两亲性化合物作为抑制冰生长材料(简称“抑冰材料”)和/或控制冰生长材料(简称“控冰材料”)的应用。
[0027]
本发明还提供上述两亲性化合物在细胞冷冻保存中的应用；例如，用于制备上述细胞冷冻保护剂。
[0028]
本发明还提供一种抑冰材料和/或控冰材料，含有上述两亲性化合物。
[0029]
本发明还提供上述冷冻保护剂的制备方法，以含所述式(i)所示结构的两亲性化合物的组分为原料制备得到所述冷冻保护剂。
[0030]
优选地，所述制备方法包括将式(i)所示的两亲性化合物、缓冲液以及水溶性糖和/或多元醇混合，制备得到所述冷冻保护剂。优选地，各组分按上述用量比混合。
[0031]
优选地，所述水溶性糖、多元醇和缓冲液具有如上文所示的选择。
[0032]
本发明还提供上述冷冻保护剂在细胞、组织或器官冷冻保存中的应用，例如用作细胞、组织或器官的冷冻保护剂。例如，上述冷冻保护剂可用于细胞、组织或器官的控冰冻存保护剂。
[0033]
根据本发明的实施方案，所述细胞、组织和器官为任何适宜冷冻冻存的细胞、组织和器官，包括但不限于人或动物的以下细胞、组织或器官：体细胞、各类干细胞、生殖细胞，卵巢组织/器官、睾丸组织、脐带组织、胎盘组织、胰岛组织、肝组织、脂肪组织、结缔组织、心脏组织、神经组织、牙髓组织、肺脏、肝脏、肾脏、心脏、卵巢、胰腺等。
[0034]
其中，所述体细胞包括各种组织或器官的细胞，例如红细胞、软骨细胞、肝细胞等；
[0035]
其中，所述干细胞为本领域已知的具有分化功能的各种干细胞，例如全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞等；优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞(例如人骨髓间充质干细胞)等；优选地，所述神经干细胞为多巴胺能神经元前体细胞；
[0036]
其中，所述生殖细胞为卵母细胞或精子细胞。
[0037]
上述细胞可为分离形式，或不分离的形式，例如在含有细胞的体液、组织或器官的
形式。
[0038]
本发明中，所述人骨髓间充质干细胞来源于人骨髓。所述人骨髓间充质干细胞可经本领域已知的临床应用方法从人骨髓中进行分离而得到。
[0039]
优选地，所述冷冻保护剂用于干细胞冷冻保存，示例性用于人骨髓间充质干细胞的冷冻保存。
[0040]
本发明还提供一种细胞、组织或器官的冻存方法，所述冻存方法使用上述冷冻保护剂对细胞、组织或器官进行冻存。
[0041]
优选地，所述细胞、组织和器官均具有如上文所示的含义。
[0042]
根据本发明的实施方案，所述冻存方法包括以下步骤：将待冻存的细胞、组织或器官置于上述冷冻保护剂中混匀渗透，而后置于液氮环境中冷冻保存。
[0043]
根据本发明的实施方案，所述冷冻保存可采用慢速降温和/或快速降温(直接投入到液氮中)两种方法。
[0044]
根据本发明的实施方案，所述冻存方法还包括解冻：将已冻存物从液氮环境中快速取出并放入37℃的水浴中解冻；进一步将解冻后的细胞、组织或器官转移至合适的培养环境中。
[0045]
根据本发明示例性的实施方式，细胞的冻存方法包括如下步骤：将上述冷冻保护剂加入含有细胞悬液的冻存管中，吹打混匀后，将所述冻存管放入程序降温盒中，置于-80℃的冰箱过夜后，转移到液氮中(-196℃)保存。
[0046]
本发明中，“两亲性”是指式(i)所示的两亲性化合物同时具有亲水性和亲冰性。其中：所述亲水性为该化合物可与水分子形成非共价作用，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用和/或π-π作用等；亲冰性是指该化合物可与冰形成非共价作用，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用和/或π-π作用等。
[0047]
本发明中的单位“mm”代表“mmol/l”，单位“m”代表“mol/l”。
[0048]
本发明的有益效果：
[0049]
(1)本发明的冷冻保护剂以两亲性化合物作为人骨髓来源的间充质干细胞的冷冻保护剂活性组分，基于两亲性化合物良好的水溶性及两亲性(亲冰性和亲水性)，因而可以在冷冻细胞、组织或器官复苏过程中有效地抑制冰的结晶和/或重结晶，以避免细胞、组织或器官因冰晶生长过快而导致的损伤，而摒弃dmso的使用。
[0050]
(2)本发明的两亲性化合物具有多羟基结构，亲水性和亲冰性良好，具有良好的抑制冰晶生长(ice recrystallization inhibition，iri)以及再结晶的性能(图2)，能够作为一种新型、高效地抑制冰晶生长的材料。
[0051]
(3)本发明的两亲性化合物用于细胞、组织或器官冷冻保存时，具有较高的抑制冰晶生长活性，在细胞、组织或器官冷冻保存过程的复温过程中能够有效地抑制/控制冰晶的生长及重结晶，达到降低因冰的再结晶造成的细胞、组织或器官损伤，提升冻存细胞、组织或器官复苏的存活率的目的，特别是对冷冻保存的人骨髓来源的间充质干细胞具有良好的效果：人骨髓来源的间充质干细胞在含有本发明两亲性化合物的冷冻保护剂中冷冻保存后可以达到80-90％的细胞恢复率。
[0052]
(4)本发明提供的人骨髓来源的间充质干细胞的冷冻保护剂的制备方法简单，原材料丰富，细胞相容性好，具有良好的冷冻保存效果。
附图说明
[0053]
图1为实施例1制备的化合物g-v的核磁氢谱(上)和碳谱(下)(溶剂：重水)。
[0054]
图2为实施例1中pbs缓冲液和g-v的pbs缓冲液抑制重结晶的光学图片(尺寸：100μm)。
[0055]
图3为实施例4所述的含g-v的冷冻保护剂冷冻保存干细胞的绝对存活率。
[0056]
图4为实施例4所述的含g-v的冷冻保护剂冷冻保存干细胞的相对存活率。
[0057]
图5为实施例4所述的含g-v的冷冻保护剂冷冻保存干细胞复苏后不同时间(24h、48h、72h)的增殖效率。
具体实施方式
[0058]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0059]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0060]
以下实施例中，所采用的pbs缓冲液组成为：nacl(136.9mmol l-1
)，kcl(2.7mmol l-1
)，na2hpo4(10.0mmol l-1
)，kh2po4(2.0mmol l-1
)，ph 7.4。
[0061]
实施例1 式(i)所示的两亲性化合物的制备
[0062]
将1mmol的葡萄糖酸内酯溶解在30ml甲醇中，充分搅拌溶解，然后加入5mmol的缬氨酸，并于60℃下搅拌反应48h，然后将反应液在冰水浴中冷却5h，过滤，将滤液旋蒸后得到产物，即为式(i)所示的两亲性化合物，记为化合物g-v。
[0063][0064]
本实施例所得产物的核磁氢谱和碳谱(avanceⅱ400m nmr)如图1所示，根据图1可以确定本实施例所制备的产物具有如式(i)所示结构。
[0065]
将所得到的产物进行iri活性分析评估其抑冰性能。iri活性分析是通过splat-cooling方法进行的。用于研究iri活性的实验装置为尼康偏振光学显微镜(az100)和linkman(lts420)冷台。所有样品以所需的浓度溶解在pbs溶液中。
[0066]
具体实验方法如下：
[0067]
将10μl浓度为170mmol/l g-v的pbs缓冲溶液、35mmol/l g-v的pbs缓冲溶液、纯pbs缓冲溶液分别从1.5米处滴到预先降温到-60℃的冷台上。液滴瞬间结成一层薄冰。然后将冷台以10℃/分钟的升温速率升到-6℃。然后，将上述结冰的样品在此温度下退火30分钟。之后通过显微镜上的相机对冰晶进行拍照，图像的处理是使用image j软件。每张照片中选取25个粒径最大的冰晶，并统计其中最大轴的长度。此过程重复三次，分别计算出170mmol/l g-v的pbs缓冲溶液、35mmol/l g-v的pbs缓冲溶液、纯pbs缓冲溶液中最大冰晶尺寸的平均值。然后分别用170mmol/l的g-v的pbs缓冲溶液、35mmol/l的g-v的pbs缓冲溶液
的最大冰晶尺寸平均值比上pbs缓冲溶液中最大冰晶尺寸的平均值，即为各自对应的平均最大冰晶尺寸占比pbs(％)。
[0068]
如图2所示，35mmol/l和170mmol/l化合物g-v的pbs缓冲溶液的平均最大冰晶尺寸分别约为纯pbs缓冲溶液的平均最大冰晶尺寸的40％和20％。由此表明化合物g-v在浓度为35mmol/l和170mmol/l时均显著降低了pbs缓冲液中冰晶的生长尺寸，即可显著抑制溶液中冰晶的生长。由此表明本发明的g-v化合物具备优异的抑冰效果。
[0069]
实施例2 冷冻保护剂的制备
[0070]
将实施例1所制得的化合物(g-v)溶解于水中，充分搅拌溶解之后冷冻干燥。将干燥后的产物溶解于pbs缓冲液(nacl(136.9mmol l-1
),kcl(2.7mmol l-1
),na2hpo4(10.0mmol l-1
)，kh2po4(2.0mmol l-1
)，ph7.4)中备用。
[0071]
实施例3
[0072]
配制100ml冷冻保护剂一，由如下组分混合得到：
[0073][0074]
冷冻保护剂二：与冷冻保护剂一的不同之处在于：化合物g-v的浓度为170mm。
[0075]
实施例4 人骨髓来源的间充质干细胞冷冻保存实验
[0076]
本次实验所用细胞为人骨髓来源的间充质干细胞(msc)，购自于赛百慷公司；
[0077]
使用实施例3中的冷冻保护剂一、冷冻保护剂二分别对msc细胞进行冻存。
[0078]
具体操作方法为：将10cm培养皿中的msc细胞用0.25％胰酶37℃消化1min，当细胞分散成单细胞、部分脱离培养皿后，加入4倍体积完全培养基(a-mem+10％fbs)中和，吹打至细胞完全脱离培养皿后，将其转移到15ml的离心管中，并于1200rpm下离心5min。弃上清，使用1ml dpbs将msc细胞重悬。使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测。每个离心管中冻存细胞数量为5*105个。按细胞数量将细胞悬液转移至冻存管中(约200μl)，分别加入冷冻保护剂一、冷冻保存剂二至总体积为500μl。吹打混匀，将冻存管放入程序降温盒内，并于-80℃的冰箱内冷冻过夜。次日取出冻存管，转入液氮罐中。
[0079]
解冻干细胞：
[0080]
将上述冷冻保存的人骨髓来源的间充质干细胞(msc)从液氮罐中取出，立刻投入37℃水浴中，并在水浴中摇动，使细胞在1min内快速解冻。然后将解冻后的细胞悬液加入4倍体积完全培养基(a-mem+10％fbs)中，随后转移到15ml离心管中，并于1200rpm下离心5min。弃上清，使用500μl的pbs将细胞重悬。使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测。之后将细胞接种至96孔板中，每个孔接种10000个细胞(每种浓度的冷冻保护剂冷冻保存的人骨髓来源的间充质干细胞样品平行接种6组)；并做一个正常传代、没有经历冻存复苏的新鲜细胞组。
[0081]
细胞增殖检测：
[0082]
使用cck-8试剂盒进行细胞增殖检测。分别在细胞复苏24h、48h、72h三个时间点进
行检测。将完全培养基和cck-8试剂按照10:1的体积比混匀。将96孔板中的细胞培养基弃掉，每孔加入100μl含cck-8试剂的培养基，并做一组不含细胞的空白孔。37℃孵育1h。取出96孔板，使用酶标仪在450nm处检测吸光度。
[0083]
图3为实施例4所述的含g-v的冷冻保护剂冷冻保存干细胞的绝对存活率。从图中可以看出：基于上述人骨髓来源的间充质干细胞的冷冻保存方法冷冻保存后解冻的干细胞，在浓度为35mmol/l和170mmol/l的g-v冷冻保护剂中冷冻保存后解冻后的干细胞平均存活率的分别为83.3％和91.4％。由此表明本发明的两亲性化合物在细胞、组织或器官冷冻保存过程的复温过程中能够有效地抑制/控制冰晶的生长及重结晶，达到降低因冰的再结晶造成的细胞、组织或器官损伤，以提升冻存细胞、组织或器官复苏的存活率，特别是对冷冻保存的人骨髓来源的间充质干细胞具有良好的iri活性，而无需加入有机溶剂。
[0084]
图4为实施例4所述的含g-v的冷冻保护剂冷冻保存干细胞的相对存活率。从图中可以看出：基于上述人骨髓来源的间充质干细胞的冷冻保存方法冷冻保存后解冻的干细胞，在浓度为35mmol/l和170mmol/l的g-v冷冻保护剂中冷冻保存后解冻后的干细胞的平均相对存活率分别为89.3％和98％(新鲜细胞的存活率93.2％)。干细胞存活率测试实验重复三次求取平均值。
[0085]
图5为实施例4所述的含g-v的冷冻保护剂冷冻保存干细胞复苏后不同时间(24h、48h、72h)的增殖效率。纵作标代表复苏后干细胞的增殖速度(即450nm处的吸光度)。在浓度为170mmol/l的g-v冷冻保护剂中的干细胞的增值速率甚至高于商用冷冻保存液(stemcell生产的cs10)。
[0086]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。