一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基及培养方法与流程

本发明涉及植物繁殖
技术领域：
，更具体的说是涉及一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基及培养方法。
背景技术：
：紫椴(tiliaamurensis)属椴树科(tiliaceae)椴树属(tilial.)，为我国ii级珍贵保护树种，主产中国东北、内蒙古东部及黑龙江与乌苏里江流域，向南至朝鲜半岛。紫椴木材质轻软，纹理致密通直，是市场上优良的胶合板用板及细木工板的重要材料；其生态价值也较高，因树形美观，花朵芳香，是较好的城市和庭院绿化树种。同时，紫椴也是著名的蜜源植物，为我国的特等优质蜜源。紫椴花、根等还可药用。因紫椴具有的工业、食用和药用等多种价值，其需求量逐渐增加。然而，紫椴种播繁育发芽率低、周期长，扦插繁育较难生根、成活率低，因此，需要研究一种周期短、成活率高的紫椴繁育方法。有研究人员采用紫椴芽为外植体，不经愈伤组织直接诱导芽分化，可以缩短培养周期，然而采用该方法繁育紫椴会影响后续生根速度、生根率以及移栽成活率，繁育效率较低。愈伤组织的形成对于芽、根的生长具有十分重要的作用，因此，亟待提供一种能够提高愈伤组织诱导效率的培养基及方法，保证紫椴繁育质量的同时提高繁育速度。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基及培养方法，可快速诱导紫椴愈伤组织形成，进而促进后续芽、根的良好发育，提高移栽成活率。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基，包括：(1)诱导培养基1：在ms培养基的基础上添加2，4-d1-2mg/l，玉米素0.3-1.2mg/l，kt0.1-0.2mg/l，脯氨酸15-25mg/l，亮氨酸0.5-1mg/l，壳聚糖0.2-0.5g/l；和(2)诱导培养基2：在ms培养基的基础上添加2，4-d2-3mg/l，玉米素0.8-1.8mg/l，kt0.1-0.2mg/l，硫代硫酸钠0.1-0.2g/l，脯氨酸30-40mg/l，酪氨酸20-30mg/l，壳聚糖0.8-1.2g/l，活性炭粉0.3-0.6g/l。本发明采用两种诱导培养基对紫椴外植体进行诱导，可促进愈伤组织快速形成；其中，诱导培养基1中添加脯氨酸、亮氨酸、壳聚糖，可刺激外植体改变原有分化方向和代谢方式，加强代谢活动，并且降低外植体污染几率；诱导培养基2中添加硫代硫酸钠、脯氨酸、酪氨酸、壳聚糖、活性炭粉，可促进植物组织脱分化，并且避免褐化，提高出愈率。优选地，活性炭粉粒度为200-300目。适当粒度的活性炭粉可保证在培养基内分布的均匀性，与硫代硫酸钠、壳聚糖相配合，在不影响植物组织营养吸收的同时减少创伤处有害物质的积累。一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养方法，包括如下步骤：1)取2-3年生紫椴具有腋芽的嫩枝段，消毒，剪至2.5-3.5cm长，作为外植体；2)将外植体接种于诱导培养基1上，20±2℃暗培养3-5d；3)将步骤2)暗培养后的外植体转移到诱导培养基2上，25±2℃继续暗培养10-14d。外植体的选择可保证愈伤组织快速形成；先在诱导培养基1中进行短时间低温培养，再转入诱导培养基2中进行诱导培养，可缩短诱导时间，改善愈伤组织质量，避免诱导过程中防褐化成分对前期植物组织营养吸收造成影响。优选地，步骤1)中的消毒为：流水冲洗2-5min，使用洗衣粉漂洗2-3min，再用流水冲洗2-5min，于质量分数75％的酒精中浸泡30-50s，转入质量分数0.1％氯化汞中浸泡8-12min，无菌水洗涤3-5次。上述提高紫椴愈伤组织诱导率的培养方法在紫椴无性繁殖中的应用。优选地，将上述方法获得的愈伤组织转接于分化培养基中，25±2℃培养10-14d；再转接到生根培养基中，生根后进行移栽。优选地，分化培养基组成如下：在ms培养基的基础上添加6-ba1.0-2.0mg/l，naa0.5-1.0mg/l。优选地，分化培养基中培养时，光照强度1000-1500lx，光照时间8-10h/d。优选地，生根培养基组成如下：在ms培养基的基础上添加naa0.3-0.5mg/l。优选地，生根培养基中培养时，光照强度1500-2000lx，光照时间10-12h/d。由上述技术方案可知，本发明公开一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基及培养方法，通过使用两种诱导培养基先后对紫椴外植体进行诱导，可提高愈伤组织形成的速度和质量，进而为后续出芽、生根、移栽提供基础，保证繁育效率。附图说明图1所示为接种于诱导培养基1上的外植体。图2所示为外植体转接于诱导培养基2上腋芽萌发状态。图3所示为实验组形成愈伤组织的外植体。图4所示为对照组1愈伤组织停止生长状态。图5所示为对照组4严重褐化的外植体。图6所示为对照组5未形成愈伤组织的外植体。图7所示为实验组分化培养获得的分化苗。图8所示为实验组经生根培养后组培瓶底根系观察(根系生长状态良好)。图9所示为对照组4经生根培养后组培瓶底根系观察(未生根)。图10所示为实验组移栽苗生长状态。图11所示为对照组4移栽苗生长状态。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基，包括：(1)诱导培养基1：在ms培养基的基础上添加2，4-d1.5mg/l，玉米素1.0mg/l，kt0.15mg/l，脯氨酸20mg/l，亮氨酸0.8mg/l，壳聚糖0.4g/l；和(2)诱导培养基2：在ms培养基的基础上添加2，4-d2.5mg/l，玉米素1.5mg/l，kt0.2mg/l，硫代硫酸钠0.15g/l，脯氨酸35mg/l，酪氨酸25mg/l，壳聚糖1.0g/l，活性炭粉(200-300目)0.5g/l。其中，ms培养基如表1所示。表1实施例2一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基，包括：(1)诱导培养基1：在ms培养基的基础上添加2，4-d1mg/l，玉米素0.5mg/l，kt0.2mg/l，脯氨酸15mg/l，亮氨酸0.5mg/l，壳聚糖0.2g/l；和(2)诱导培养基2：在ms培养基的基础上添加2，4-d2mg/l，玉米素1mg/l，kt0.2mg/l，硫代硫酸钠0.1g/l，脯氨酸30mg/l，酪氨酸20mg/l，壳聚糖0.8g/l，活性炭粉(200-300目)0.5g/l。实施例3一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养基，包括：(1)诱导培养基1：在ms培养基的基础上添加2，4-d2mg/l，玉米素1.2mg/l，kt0.1mg/l，脯氨酸25mg/l，亮氨酸1mg/l，壳聚糖0.5g/l；和(2)诱导培养基2：在ms培养基的基础上添加2，4-d3mg/l，玉米素1.8mg/l，kt0.1mg/l，硫代硫酸钠0.2g/l，脯氨酸40mg/l，酪氨酸30mg/l，壳聚糖1.2g/l，活性炭粉(200-300目)0.6g/l。实施例4一种提高紫椴愈伤组织诱导率的培养方法，包括如下步骤：1)取2年生紫椴具有腋芽的嫩枝段，流水冲洗3min，使用洗衣粉漂洗3min，再用流水冲洗3min，于质量分数75％的酒精中浸泡40s，转入质量分数0.1％氯化汞中浸泡10min，无菌水洗涤3次；剪至2.5-3.5cm长，作为外植体；采用不同培养方法对外植体进行培养：实验组：如图1-2，将外植体接种于实施例1诱导培养基1上，20±2℃暗培养4d；培养结束后再将外植体转移到实施例1诱导培养基2上，25±2℃继续暗培养12d。对照组1：将外植体接种于实施例1诱导培养基1上，25±2℃暗培养16d。对照组2：将外植体接种于实施例1诱导培养基2上，25±2℃暗培养16d。对照组3：将外植体接种于实施例1诱导培养基1上，25±2℃暗培养4d；培养结束后再将外植体转移到实施例1诱导培养基2上，25±2℃继续暗培养12d。对照组4：在实验组的基础上，将诱导培养基1替换为：在ms培养基的基础上添加2，4-d1.5mg/l，玉米素1.0mg/l；诱导培养基2替换为：在ms培养基的基础上添加2，4-d2.5mg/l，玉米素1.5mg/l。对照组5：在实验组的基础上，将诱导培养基1替换为：在ms培养基的基础上添加2，4-d1.5mg/l，6-ba1.0mg/l；诱导培养基2替换为：在ms培养基的基础上添加2，4-d2.5mg/l，6-ba1.5mg/l。培养结束后，分别计算各组出愈率及褐化率：出愈率(％)＝形成愈伤组织的外植体数量/外植体总数×100％；褐化率(％)＝褐化外植体数量/外植体总数×100％。结果如表2及图3-6所示，实验组可正常形成愈伤组织，出愈率高，褐化率低；对照组1虽然形成了愈伤组织，但一部分愈伤组织很快停止生长，并且随着愈伤组织停止生长，叶片也逐渐变黄枯死；对照组4褐化严重，出愈率低；对照组5出愈率低，外植体茎基部普遍膨大但未形成愈伤组织。表2实施例5将实施例4中各组获得愈伤组织转接于分化培养基(ms培养基+6-ba1.5mg/l+naa1.0mg/l)中，光照强度1200lx、光照时间8h/d、25±2℃培养14d；再转接到生根培养基(ms培养基+naa0.4mg/l)中，光照强度2000lx，光照时间12h/d，20天后统计生根生根状况，对生根苗进行移栽，移栽后30d统计成活率。其中，生根率(％)＝生根苗数/生根培养接种总数×100％；移栽成活率(％)＝成活数/移栽总数×100％；实验结果如表3及图7-11所示，实验组经分化培养基培养长势较好，并且经生根培养基培养后生根率较高，移栽后成活率高；对照组1、2、4虽然在诱导过程中茎基部膨大形成愈伤组织，但愈伤组织生根率较低。表3组别生根率(％)移栽成活率(％)实验组97.0095.87对照组165.7968.00对照组255.8170.83对照组389.8690.32对照组446.1558.33对照组50-表中“-”为未进行实验。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12