一种利用组织培养技术繁殖芍药的方法

本发明属于植物的组培快繁方法技术领域，特别涉及一种利用组培技术诱导组培苗产生芽盘结构繁殖芍药的方法。

背景技术：

芍药是芍药科芍药属多年生草本植物，为我国传统名花，至今有3000多年的栽培历史，与牡丹并称为“花王”、“花相”。芍药花大色艳，花型多变，不仅可以园林和庭园栽培，还是高档切花。芍药根可药用，花可食用，种子含油率高，富含亚麻酸、亚油酸和油酸，可作食用油，应用前景广阔。

目前，芍药主要采用分株的方式繁殖，但仅在秋季进行，受时间限制，繁殖效率低。已经有芍药不同品种的组培技术文献，但多数研究集中在外植体的选择和培养基配方等内容，并且都是通过诱导不定芽形成的方式进行增殖，存在褐化、玻璃化严重等现象，玻化率高达40.91%（郑黎文等，芍药‘种生粉’离体芽培养及玻璃化苗复壮研究，林业科学研究，2011,24（3）:379-384）；组培苗生长势弱，生根率最高为28.15%，并且苗基部形成了大量愈伤组织，愈伤率高达44.4%（吴红娟等，观赏芍药‘大富贵’丛生芽诱导及生根技术，东北林业大学学报，2011（9）：20-22），严重影响了芍药试管苗的移栽，成为芍药组培快繁的技术瓶颈，制约了芍药产业化发展进程。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用组织培养技术繁殖芍药的方法，该方法针对芍药的生长繁殖特性而设计，简便易行，能够获得大量芽盘，芽盘上端形成休眠芽，在合适的培养条件下，休眠芽可以正常萌发，芽盘下端能形成不定根，生根率高，为芍药组培苗移栽提供健壮生根苗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种芍药组培用培养基组合物，该组合物在芍药组培过程中用于将外植体诱导形成芽盘结构；该组合物包括：外植体萌发培养基、潜伏芽形成培养基和芽盘诱导培养基；具体而言：

所述外植体萌发培养基组成为：1/2ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.1～2.0mg/l+0<iba≤1.0mg/l；

所述潜伏芽形成培养基组成为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+0<6-ba≤1mg/l+0≤naa≤0.1mg/l；

芽盘诱导培养基组成为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+0<6-ba≤0.8mg/l+0≤椰子汁≤200ml/l。

一种利用组织培养技术繁殖芍药的方法，其包括如下步骤：

1）芍药外植体灭菌：

以芍药地下鳞芽为外植体来源，清洗、灭菌后作为组培用外植体；

2）芍药外植体萌发：

将步骤1）中外植体，在外植体萌发培养基中培养20-40d，培育茎尖萌发成苗；

3）芍药组培苗潜伏芽形成：

将茎尖萌发形成的组培苗，转入潜伏芽形成培养基中培养50-100d，使叶柄基部、茎基部的潜伏芽形成并长大；

4）芍药芽盘诱导：

将得到的潜伏芽转入芽盘诱导培养基中培养30-60d，诱导形成芽盘。

所述芽盘主要结构特征为：是一种组织结构致密的类圆盘状结构，其上端分化形成有若干（一般为3~5个）休眠芽，在合适培养条件下，芽盘下部可以迅速长出不定根，同时上端的休眠芽可以快速萌发长出叶片。

进一步的，将步骤4）中的芽盘进一步转入生根萌芽培养基中，在12-25℃、黑暗条件下的培养箱内培养45-60d，促进芽盘生根萌芽（即芽盘下端生根，芽盘上端休眠芽萌发长叶），形成具有根、叶的组培苗。

优选的，步骤2）中，所述外植体萌发培养基组成为：1/2ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.1～2.0mg/l+0<iba≤1.0mg/l。

优选的，步骤3）中，所述潜伏芽形成培养基组成为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+0<6-ba≤1mg/l+0≤naa≤0.1mg/l。

优选的，步骤4）中，所述芽盘诱导培养基组成为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+0<6-ba≤0.8mg/l+0≤椰子汁≤200ml/l。

优选的，所述生根萌芽培养基组成为：ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l。

进一步的，上述利用组织技术繁殖芍药的方法还包括移栽：将组培苗取出，用50%多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液浸泡，栽入穴盘，移栽基质为质量比2:1:2的草炭、蛭石和珍珠岩组成的混合物；移栽初期的10～15天，保持温度20～25℃，相对湿度保持在90%以上。

本发明主要创新点在于：通过对芍药组培过程中相关激素用量及组培体系优化（芽盘诱导培养基20-40d的外植体萌发培养周期，50-100d的潜伏芽形成培养周期，30-60d的芽盘诱导培养周期），可将外植体诱导形成特定的芽盘结构，一方面该芽盘可较快速的诱导培育成苗，另一方面，将此芽盘结构作为“中继性”组培阶段，可以继代增殖，可较好克服现有直接诱导成苗时的玻璃化、苗弱等技术弊端，从而改善组培效果。

和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明方法针对芍药的生长繁殖特性而设计，简便易行，能够获得大量芽盘结构，芽盘上端的芽可以正常萌发，芽盘下端能形成不定根，为芍药组培苗移栽提供健壮生根苗。本发明方法中，芽盘结构诱导率高，达到90%以上，玻璃化现象很少，生根率高，达到85.1%，根系活力大，愈伤组织少或无，容易移栽，有利于芍药种苗的规模化生产。

附图说明

图1为芍药外植体；

图2为芍药外植体萌发；

图3为芍药组培苗潜伏芽形成；

图4为芍药芽盘结构；

图5为芽盘结构生根萌芽；

图6为芍药常规培养增殖苗；

图7为芍药常规培养生根苗；

图8为利用本发明方法获得的芍药移栽苗。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，如无特殊说明，培养均在以下常规培养条件进行：培养温度23±2℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12小时/天。

对比例1

一种芍药的常规组培方法，其包括如下步骤：

1）外植体灭菌：于1-2月份，采集芍药地下鳞芽为外植体，清洗、灭菌（（具体可以是：先用自来水冲洗，再用洗洁精刷洗鳞芽，最后用流水冲洗30分钟；拿到超净工作台上进行灭菌，体积浓度为75％的酒精灭菌30秒，质量浓度为0.1％的hgcl2灭菌10分钟，无菌水冲洗1遍，换一个无菌瓶，再用质量浓度为0.1%的hgcl2灭菌8分钟，无菌水冲洗3～4遍，最后用250mg/l的头孢无菌水冲洗1遍）；

2）芍药外植体萌发：将灭菌后的鳞芽，放置在无菌的滤纸上吸干水分，用无菌的镊子将外围鳞片剥掉，露出茎尖进行接种。在1/2ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.5mg/l+iba0.1mg/l的培养基中，培养30d，促使茎尖萌发成苗；

3）芍药无菌苗增殖：将获得的无菌苗接入增殖培养基中，增殖培养基为wpm+6-ba0.8mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，培养30d，可以得到增殖苗（见图6），接入22株无菌苗，转出35株，增殖系数1.59；

4）芍药组培苗生根：将增殖苗切成单株，选取生长健壮的单株进行生根诱导（生根培养基为：wpm+iba0.8mg/l+naa0.08mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l），获得生根苗（见图7）；共有89株单株进行生根诱导，生根47株，生根率为52.8%，有18株苗基部形成大量灰色愈伤组织，比例为20.2%；

5）芍药生根苗移栽：将上述芍药生根苗进行移栽，用的50%多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液浸泡3min，栽入穴盘，移栽基质为草炭、蛭石和珍珠岩质量比为:2:1:2的混合物；移栽初期的10～15天，保持温度20～25℃，相对湿度保持在90%以上。移栽半个月后，苗逐渐出现根茎处腐烂、死亡现象。

实施例1

一种利用组织培养技术繁殖芍药的方法，其包括如下步骤：

1）芍药外植体灭菌：于1-2月份，采集芍药地下鳞芽为外植体（见图1），清洗、灭菌（具体可以是：先用自来水冲洗，再用洗洁精刷洗鳞芽，最后用流水冲洗30分钟；拿到超净工作台上进行灭菌，体积浓度为75％的酒精灭菌30秒，质量浓度为0.1％的hgcl2灭菌10分钟，无菌水冲洗1遍，换一个无菌瓶，再用质量浓度为0.1%的hgcl2灭菌8分钟，无菌水冲洗3～4遍，最后用250mg/l的头孢无菌水冲洗1遍）；

2）芍药外植体萌发：将灭菌后的鳞芽，放置在无菌的滤纸上吸干水分，用无菌的镊子将外围鳞片剥掉，露出茎尖进行接种，在外植体萌发培养基中培养30d，促使茎尖萌发成苗（见图2）；

所述外植体萌发培养基组成为：1/2ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.5mg/l+iba0.1mg/l；

3）芍药组培苗潜伏芽形成：将茎尖萌发形成的组培苗，转入潜伏芽形成培养基中培养60d，使叶柄基部、茎基部的潜伏芽形成并长大（见图3），接入10株组培苗，有6株形成潜伏芽，诱导率为60%；

所述潜伏芽形成培养基组成为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.5mg/l+naa0mg/l；

4）芍药芽盘结构诱导：将得到的潜伏芽转入芽盘诱导培养基中培养60d，诱导形成芽盘（见图4），芽盘直径在0.3-1cm，上有1-3个休眠芽，当芽盘较大时，需要进行切割，分成2-3个小芽盘。共接入31个潜伏芽，有23个诱导出芽盘，诱导率74.1%；

所述芽盘诱导培养基组成为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.8mg/l+椰子汁150ml/l；

5）芽盘生根萌芽：将芽盘结构转入芽盘生根萌芽培养基中，在12℃、黑暗条件下的培养箱内培养50天，芽盘下端生根，芽盘上端休眠芽萌发，形成具有根、叶的组培苗（见图5），每瓶接入8-10个芽盘，每个芽盘上有1-3个休眠芽，共12瓶，随机取6瓶统计生根萌芽率，生根萌芽率达到85.1%；所述芽盘生根萌芽培养基组成为：ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l；

6）移栽：将上述步骤5）所得组培苗取出，用50%多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液浸泡，栽入穴盘，移栽基质为质量比2:1:2的草炭、蛭石和珍珠岩组成的混合物；移栽初期的10～15天，保持温度20～25℃，相对湿度保持在90%以上。移栽15天后，叶片逐渐展开。

实施例2

以下给出了不同培养基组成带来的培养效果差异试验。

1.外植体萌发培养基筛选

将灭过菌的芍药茎尖接入外植体萌发培养基，放在培养间培养，培养温度23±2℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12小时/天。外植体萌发培养基以ms培养基为基本培养基，其中大量元素减半，即1/2ms培养基，添加蔗糖30g/l、琼脂6g/l，同时附加不同种类和浓度的植物生长调节物质（具体见表1），观察其对芍药外植体萌发的影响，接后40d统计萌发率并转接，进入到潜伏芽诱导环节，萌发率=萌发叶片植株数/该处理未污染的植株总数*100%。结果见下表1。

表1植物生长调节物质对外植体萌发的影响

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2.潜伏芽形成培养基筛选

将上述芍药茎尖萌发形成的无菌组培苗，全部随机接入潜伏芽形成培养基，在培养温度23±2℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12小时/天的培养条件下，诱导无菌苗叶柄基部和茎基部出现潜伏芽并长大。潜伏芽形成培养基分别以wpm和1/2ms为基本培养基，添加蔗糖30g/l、琼脂6g/l，并且附加不同种类和浓度的植物生长调节物质（详见下表2），接种70d后统计诱导率并进行转接，诱导率=诱导出潜伏芽的植株数/该处理接种植株总数*100。结果见表2。

表2不同培养基对芍药潜伏芽诱导的影响

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3.芽盘诱导培养基筛选

将获得的潜伏芽，去掉原有叶片，不进行切割，随机转接入芽盘诱导培养基继续进行培养，以诱导芽盘产生。芽盘诱导培养基以wpm为基本培养基，添加蔗糖30g/l、琼脂6g/l，并且附加不同浓度的植物生长调节物质和椰汁（详见下表3），观察其对芽盘诱导的影响。培养条件为培养温度23±2℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12小时/天，培养40d时统计芽盘诱导率并进行转接，诱导率=形成芽盘的植株数量/该处理接种植株总数量*100%。具体结果见下表3。

4.芽盘生根萌芽条件筛选

将处理1和2（即培养基编号1和2）中获得的芽盘转入芽盘生根萌芽培养基（ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l）中，分别在培养间（培养温度23±2℃）和培养箱（培养温度12±0.1℃）进行黑暗培养，一段时间后，芽盘在两种条件下的生长表现有异同，相同的是芽盘均是先生根，但是25℃下根数少，芽盘上端休眠芽顶部微张开，无叶柄伸长；在12℃下，芽盘根数较多，少数有须根；上端休眠芽颜色变浅，伸长，长出叶片，培养60d后统计生根结果，如下表4所示。

由表4看出：在较低温度12℃下的生根萌芽效果明显优于常温23℃，这也与芍药的生长特性相一致（自然条件下，芍药主要在秋季长根，冬季低温休眠，其种子和芽的萌发、生长均须经过一定的低温处理过程后才能打破休眠。正是基于此生长特点，本申请主要技术构思为：先诱导形成芽盘，然后再经合适低温处理以促进根系生长，从而克服现有技术中直接诱导成苗时的相关技术缺陷）。

表3不同处理培养基对芽盘诱导的影响

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表4不同温度对芽盘生根萌芽的影响

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5、芽盘生根萌芽后移栽

将12℃条件下生根萌芽的芍药组培苗进行移栽，用50%多菌灵可湿性粉剂1000倍溶液浸泡植株1min，然后将植株栽入穴盘，移栽基质为质量比2:1:2的草炭、蛭石和珍珠岩组成的混合物；移栽初期的10～15天，保持温度20～25℃，相对湿度保持在90%以上。移栽3d，叶片和叶柄颜色逐渐转绿，移栽25d，叶片开始逐渐展开（见图8）。