小分子化合物ZK-PI-9在制备海藻糖酶抑制剂中的应用

本发明涉及昆虫防治
技术领域：
，特别是涉及小分子化合物zk-pi-9在制备海藻糖酶抑制剂中的应用。
背景技术：
：我国是一个在农业生产中生物灾害频繁发作的国家，平均每年由于虫害而损失数千万吨的粮食，虫害对农作物的危害不仅体现在降低农产品的产量上，还体现在削弱农场品质量方面。据估计，世界有害生物造成的潜在食物损失在45％左右。所以应用农药防治害虫在农业生产中是不可避免和重要的。然而，对农药的长期依赖，带来严重的3r问题(抗药性、残留和害虫再猖獗)，这不但没有达到害虫防控这一目的，还造成环境污染、生物多样性降低等一系列问题。通过调控害虫的生长发育将成为害虫绿色防控的重要手段，关键在于要找到能够起调控作用的靶标基因和开发出合适的生物农药。海藻糖是一种非还原性二糖，是昆虫血淋巴中最重要的糖类物质，其水解释放的能量是飞行、发育、蜕皮和应激反应所需的能量的主要来源。海藻糖除了可作为储能物质参与机体能量代谢外，还可作为信号分子调控糖酵解过程以及作为结构物质参与昆虫体壁的形成，调控昆虫的生长发育。并且在各种逆境条件下，海藻糖作为信号分子能源和细胞壁糖脂组分可保护生物体免受高温、寒冷、干燥、饥饿等环境胁迫，从而提高昆虫的生命力和活动能力。海藻糖酶是已知的所有生物中唯一分解海藻糖的酶，也是昆虫体内合成几丁质途径的第一个酶。研究发现抑制海藻糖酶会导致昆虫发育异常、生长受阻、飞行能力和繁殖力下降以及死亡率增加。并且由于海藻糖酶在昆虫中的不可缺少性和海藻糖酶抑制对高等哺乳动物无毒害作用，其已经成为害虫控制的重要靶标之一，具有实际农药意义的有效新型海藻糖酶抑制剂产品正在开发。小分子化合物zk-pi-9，中文名n-(4-氯-2-甲氧基-5-甲基苯基)-3-羟基-2-萘甲酰胺，分子式：c19h16clno3，相对分子质量：341.8，cas登录号5165-81-1，结构式如式ⅰ所示。技术实现要素：本发明目的是提供一种新型海藻糖酶抑制剂zk-pi-9(分子式：c19h16clno3，相对分子质量：341.8)，其对昆虫海藻糖代谢相关蛋白的调控作用，使昆虫海藻糖酶在mrna水平的表达下降，导致虫体发生生长缓慢、畸形甚至是死亡。小分子化合物zk-pi-9在制备海藻糖酶抑制剂中的应用。优选的，海藻糖酶为昆虫的可溶性海藻糖酶tre1或膜结合海藻糖酶tre2。本发明又提供了小分子化合物zk-pi-9在制备杀虫剂中的应用。优选的，所述杀虫剂杀灭的对象为昆虫。本发明还提供了一种杀虫剂，活性成分为小分子化合物zk-pi-9。优选的，小分子化合物zk-pi-9的浓度不小于2×10-3mmol/ml。优选的，杀虫剂的杀灭对象为昆虫，比如草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)。由于小分子化合物zk-pi-9作用于海藻糖酶，起到海藻糖酶抑制剂的作用，而海藻糖是昆虫血淋巴中最重要的糖类物质，具有重要作用，海藻糖酶在昆虫体内广泛存在，所以以小分子化合物zk-pi-9为活性成分的杀虫剂具有广谱的杀灭昆虫的作用。本发明的有益效果主要体现在：本发明海藻糖酶抑制剂zk-pi-9，能够导致昆虫生长缓慢、畸形甚至死亡，使昆虫海藻糖酶活下降，是有作为生物农药的潜力。本发明可以应用于研究以海藻糖酶为靶标的新型生物农药的研究和制备。附图说明图1草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-9后蛹重(a)和蛹长(b)的变化：*表示p<0.05，差异显著，**表示p<0.01，差异极显著，下同；图2草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-9后化蛹、羽化、死亡变化，其中，a：草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-9后化蛹率、羽化率和死亡率，b：化蛹失败死亡的形态。图3草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-948h葡萄糖含量的变化。图4草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-948h总糖原含量的变化。图5草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-948h海藻糖含量的变化。图6草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-948h海藻糖酶酶活性变化：海藻糖酶包括可溶性海藻糖酶(a)和膜结合海藻糖酶(b)。图7为草地贪夜蛾tre1、tre2氨基酸序列与其他昆虫tre构建的进化发育树。图8草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/ml海藻糖酶抑制剂zk-pi-948h海藻糖酶基因的表达量：海藻糖酶包括可溶性海藻糖酶(a)和膜结合海藻糖酶(b)；以rpl10为内参基因。具体实施方式草地贪夜蛾是一种原产于美洲的重要的毁灭性农业害虫，被《2017世界植物现状》年度报告列入世界十大植物害虫“黑名单”。草地贪夜蛾近两年经云南跨境入侵我国，其食性杂、繁殖及迁飞能力强、适生区域广，对我国玉米种植业发展造成重大威胁。在下述实施例中以草地贪夜蛾为例对本发明进行了详细说明。海藻糖酶抑制剂zk-pi-9有效浓度为2×10-3mmol/ml，用2％dmso作为溶剂，海藻糖酶抑制剂由中国农业大学pmdd实验室所提供。实施例1草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/mlzk-pi-948h后表型、发育历期的变化。1、实验材料：草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)来自本实验室饲养种群，供试虫源来自浙江农科院杭州种群。草地贪夜蛾的饲养条件为：温度26±1℃，光照比16l∶8d，相对湿度为60±10％。幼虫放入饲料盒中单头用人工饲料(表1)喂养，成虫以10％蜂蜜水模拟花蜜获取营养。表1草地贪夜蛾幼饲料配方原料用量斑豆111.0g酵母提取物33.8g小麦胚芽52.8g抗坏血酸3.4g山梨酸(已二烯酸)1.1g对羟基苯甲酸甲酯2.1ml10％甲醛8.4ml水(搅拌机)490.0ml水(琼脂溶液)338.0ml琼脂糖13.5g2、草地贪夜蛾显微注射：以2％dmso作为溶剂配置浓度为2×10-3mmol/ml的zk-pi-9，注射前首先用标准毛细管定量每次注射器泵出的井冈霉素注射液的体积，并通过调整氮气压来调整井冈霉素注射液的体积使其符合注射量。选取3龄第1天的草地贪夜蛾幼虫作为注射对象。冰上麻痹草地贪夜蛾幼虫，用尖头小毛笔将草地贪夜蛾放置于显微注射仪载物台的滤纸上，使其腹部朝上，注射草地贪夜蛾幼虫胸部第二对足和第三对足间的胸部(表皮较薄，容易扎入)，注射量为300nl/头，注射后将其放置于饲料盒中。3、草地贪夜蛾注射48h后，其表型、和发育历程的观察：自注射海藻糖酶抑制剂后第三天起，每天记录幼虫的龄期，统计其生活周期，结果由表2显示。用直尺作为虫体体长的测量工具，度量注射后草地贪夜蛾幼虫每日体长，与对照组进行比较，结果由表3显示。处理观察30～60头虫子，每天检查幼虫的蜕皮情况，并记录正常、畸形和死亡的幼虫数量，对畸形、死亡幼虫进行拍照。表2、表3的结果显示，注射海藻糖酶抑制剂zk-pi-9后，草地贪夜蛾的4l、5l生活周期长于对照组的生活周期，其他龄期平均体长与对照朱相近，表明海藻糖酶抑制剂zk-pi-9能够影响草地贪夜蛾的发育历程。表2注射2×10-3mmol/mlzk-pi-9草地贪夜蛾发育历期表3注射2×10-3mmol/mlzk-pi-9草地贪夜蛾各龄期幼虫长度单位：cm4l5l6lck1.64±0.0312.24±0.0262.73±0.039zk-pi-91.65±0.0152.27±0.0342.75±0.0874、草地贪夜蛾注射后在幼虫6l时称量幼虫虫重，成蛹时称量蛹重和蛹长，结果如图1所示，并同时记录化蛹率。待成虫羽化时记录羽化率，羽化时如果成虫不能脱出或没有正常的翅膀则被认为是畸形的，若成虫15天后仍未出现，则认为已死亡，所有畸形个体利用相机拍照记录。最后统计注射后草地贪夜蛾的化蛹率、羽化率和死亡率，结果见图2所示。图1结果表明，注射海藻糖酶抑制剂zk-pi-9的草地贪夜蛾的蛹长极显著短于对照组ck的蛹长，蛹重小于对照组ck的蛹重。图2的结果表明，注射海藻糖酶抑制剂zk-pi-9的草地贪夜蛾的化蛹率和羽化率都低于对照组ck，死亡率高于对照组ck。表明海藻糖酶抑制剂zk-pi-9能够影响草地贪夜蛾的表型变化。实施例2草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/mlzk-pi-948h后草地贪夜蛾糖含量。1、用2×10-3mmol/ml的zk-pi-9注射3龄第1天的草地贪夜蛾幼虫，方法同实施例1，随机取注射后48h的草地贪夜蛾幼虫21头，分为3个平行，每个平行7头，用于检测海藻糖酶活性及糖含量的变化。取样时将所需草地贪夜蛾幼虫用蒸馏水洗净，并用滤纸吸干虫体上的水分后再放进ep管中，放入-80℃冰箱冻存。进行后续定量实验。2、草地贪夜蛾2×10-3mmol/ml的zk-pi-9注射48h后的葡萄糖含量的测定：取7头草地贪夜蛾幼虫于离心管中，加入2颗灭菌的小钢珠，放入组织破碎仪中破碎，程序为：55hz，120s；破碎完后将小钢珠倒出，加入200μlpbs超声破碎30min；破碎后加800μlpbs，4℃，1000×g，离心20min。分别取150μl20800×g离心的上清液、20800×g沉淀悬浮液至ep管中，制成样品。按表4的体系配置葡萄糖标曲。标曲和样品利用葡萄糖分析试剂盒(sigma)，用酶标仪测540nm吸光度，进行葡萄糖含量测定，葡萄糖含量单位为nmol/μgprotein，结果如图3所示。表4注葡萄糖标曲配制葡萄糖标准液(μl)pbs(μl)0501492483474465453、草地贪夜蛾2×10-3mmol/ml的zk-pi-9注射48h后的总糖原含量的测定：取160μl1000×g上清样品加入32μl0.1u/l的淀粉转葡萄糖苷酶，40℃水浴4h，取水浴后样品150μl至新的ep管中，加入300μl葡萄糖分析试剂，混匀，制成样品。按表4的体系配置葡萄糖标曲。利用葡萄糖分析试剂盒，用酶标仪测540nm吸光度，进行总糖原含量测定，总糖原含量单位为nmol/μgprotein，结果如图4所示。4、草地贪夜蛾2×10-3mmol/ml的zk-pi-9注射48h后的海藻糖含量的测定：分别取30μl的1000×g上清、20800×g上清液、20800×g沉淀悬浮液至ep管中，制成样品。以1.6mm海藻糖标准液进行2×梯度稀释配制0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.05mm用于制作标准曲线。利用蒽酮法处理样品与标曲，用酶标仪测630nm吸光度，进行海藻糖含量测定，总糖原含量单位为nmol/μgprotein，结果如图5所示。根据图3、图4和图5所示，注射2×10-3mmol/ml的zk-pi-9的草地贪夜蛾其体内的葡萄糖含量、海藻糖含量高于对照组ck，其体内总糖原含量显著高于对照组ck。表明海藻糖酶抑制剂zk-pi-9对草地贪夜蛾体内糖含量有影响。实施例3草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/mlzk-pi-948h后海藻糖酶活性变化。对实施例2方法得到注射2×10-3mmol/mlzk-pi-9和对照组的草地贪夜蛾1000×g上清、20800×g超离心上清、20800×g沉淀悬浮液。利用葡萄糖分析试剂盒(sigma)进行海藻糖酶浓度的测定，利用bca蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)进行蛋白浓度的测定，酶活性单位为nmolglucose/protein/minute，结果如图6所示。图6显示注射2×10-3mmol/ml的zk-pi-9的草地贪夜蛾其体内可溶性海藻糖酶活性低于对照组ck，膜结合型海藻糖酶的活性极显著低于对照组ck。表明2×10-3mmol/ml的海藻糖酶抑制的zk-pi-9能有效抑制褐飞虱海藻糖酶活性。实施例4草地贪夜蛾注射2×10-3mmol/mlzk-pi-948h溶性海藻糖酶基因tre1、膜结合型海藻糖基因tre2的表达量。1、用2×10-3mmol/ml的zk-pi-9注射3龄第1天的草地贪夜蛾幼虫，方法同实施例1。以实施例2方法随机取样注射后48h的草地贪夜蛾幼虫9头，分为3个平行，每个平行3头，用于检测海藻糖代谢关键基因tre1、tre2的表达量。2、对取样的草地贪夜蛾利用trizol法提取rna，取总量1μg的rna根据rtreagentkitwithgdnaeraser反转录试剂盒进行cdna单链合成。取反转录产物1μl用于qrt-pcr的模板。qrt-pcr反应体系为20μl，具体如下：正、反向引物各1μl，cdna1μl，sybrpremixextaq(tbgreen)10μl，灭菌超纯水补至20μl，引物序列如下：sftre1-f：5’-tcagatgaaggtgaactcgaaga-3’，sftre1-r：5’-ggaatgatgaatccgtgggta-3’，sftre2-f：5’-ctgctgctgtcggagatga-3’，sftre2-r：5’-taggaggggaggctgtgat-3’，qrt-rpl10-f：5’-gatgacatggaatggatg-3’，qrt-rpl10-r：5’-gatgacatggaatggatg-3’。草地贪夜蛾海藻糖酶酶基因tre1(genbank号：abe27189.1)、tre2(genbank号：acf94698.1)序列rpl序列为公知序列。sf-tre1(abe27189.1)与sf-tre2(acf94698.1)基于氨基酸序列与其他昆虫tre构建的进化发育树，结果如图7所示，其中，各tre蛋白物种来源及其登录号：斜纹夜蛾spodopteralitura：sl-tre1(ada63846.1)、sl-tre2(ada63845.1)；甜菜夜蛾spodopteraexigua：se-tre1(aby86218.1)、se-tre2(abu95354.1)；黄野螟heortiavitessoides：hv-tre1(azm68711.1)、hv-tre2(ayo46921.1)；竹虫omphisafuscidentalis：of-tre1(abo20846.1)；of-tre2(abo20845.1)；柞蚕antheraeapernyi：ap-tre1a(ard05073.1)、ap-tre2(ard05075.1)。具体的pcr程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性5s，再是55℃～62.5℃退火延伸25s(循环40次)；最后是65℃～95℃溶解曲线的绘制。采用2-△△t方法和statistica6.0中的anova进行数据分析，结果见图8所示。图8显示注射2×10-3mmol/ml的zk-pi-9的草地贪夜蛾可溶性海藻糖酶基因tre1、膜结合型海藻糖酶基因tre2的表达量没有降低，表明zk-pi-9对草地贪夜蛾的海藻糖基因没有显著影响。序列表<110>杭州师范大学<120>小分子化合物zk-pi-9在制备海藻糖酶抑制剂中的应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tcagatgaaggtgaactcgaaga23<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggaatgatgaatccgtgggta21<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgctgctgtcggagatga19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4taggaggggaggctgtgat19<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gatgacatggaatggatg18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gatgacatggaatggatg18当前第1页12