一种富集培养海洋食细菌线虫的方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富集培养海洋食细菌线虫的方法。

背景技术：

自由生活线虫是滨海盐沼沉积物中最丰富的后生动物。线虫根据其食性可分为植食性线虫、食真菌线虫、食细菌线虫和杂食性线虫四大类群，其中食细菌线虫为最具优势的类群，它在盐沼湿地底泥中的数量达60%以上。食细菌线虫在生态系统中发挥着重要的功能。大量研究表明，它们可以通过捕食细菌改变沉积物微环境的ph值，影响沉积物微生物群落的丰度、活性和结构，直接或间接地影响盐沼凋落物的分解过程。diplolaimella是一种世界性分布的食细菌线虫属，尤其在海洋和滨海湿地中最具优势。它是滩涂湿地潮间带的重要分解者，也是盐沼植物凋落物中的关键属。诸多研究表明，该属线虫具有生长周期短、耐逆境的特点，可以作为毒理学研究的模式生物，对水体污染具有重要的指示作用。因此，对其进行更为深入的研究具有重要意义。但是，目前鲜有研究描述食细菌线虫尤其是单宫科diplolaimella属线虫在实验室的富集和培养方法，而且该属线虫在常规的线虫培养基（ngm）上无法生存，这一定程度上影响了利用其开展各类模拟实验研究。本发明提供了富集培养食细菌线虫diplolaimella的方法，为研究湿地生态学、水体污染监测、毒理学等提供了技术支持。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种富集培养海洋是细菌线虫的方法。该方法操作简便、容易执行、食细菌线虫个体的生长繁殖状况良好，成活率高，实现有效分离及大量纯培养，为食细菌线虫提供技术保障。

本发明通过以下技术方案加以实现：

一种富集培养海洋食细菌线虫的方法，具体包括如下步骤：

1）食细菌线虫的富集培养：从野外采集新鲜沉积物和芦苇叶片，采用20×30cm的芦苇凋落盒从沉积物中富集培养海洋食细菌线虫，凋落盒于20℃黑暗培养60天；

2）食细菌类线虫的分离与鉴定：用镊子夹取尼龙袋中的凋落物于500ml锥形瓶中，添加生境水至250ml，旋紧橡木塞，上下剧烈晃动20秒后，打开橡木塞，过10目和500目组合筛网，线虫保留在500目筛网上，将大孔径筛网上保留的凋落物放回到锥形瓶中，重复上述步骤两次；通过筛洗将500目筛网上的线虫冲洗到改良的贝尔曼漏斗中，24h后打开止水夹转入玻璃培养皿，然后根据该属单宫线虫的特征在解剖镜下用解剖针挑出线虫，制作玻片后用显微镜进行线虫的鉴定；

3）食细菌类线虫的扩大培养：将食细菌线虫接种到改良的灭菌营养培养基上，用封口膜封好口后将培养皿倒置放在恒温培养箱中，20℃黑暗培养，定期观察，一周后发现培养基上出现蠕虫型胚胎期的虫卵，线虫可以繁殖，重复以上步骤获得大量的食细菌线虫。改良的灭菌营养培养基如下：称取0.01g胆固醇和4gagar到500ml锥形瓶中，加入200ml过0.45μm滤膜的生境水，棉花塞堵住瓶口，超声破碎30min后待胆固醇完全溶解后，放入高压灭菌锅中121℃，20min，稍稍冷却后倒培养基，封口膜封好后倒置放入37℃培养箱静置过夜，第二天没有发现染菌便可以正常接种线虫。

进一步地，步骤1）中的富集培养，操作简便，线虫增殖显著：采用芦苇叶片凋落盒从沉积物中富集培养海洋线虫，凋落盒为20×30cm的塑料盒，底层铺一层1cm厚的底泥，平铺一个15×20cm的网孔为1mm的尼龙袋，尼龙袋中填充3g芦苇叶片，盖上一层1cm厚的底泥，添加生境水至刚好浸没表层，于20℃黑暗培养60天。尼龙袋中的芦苇叶片为富集海洋食细菌线虫的重要物料。

进一步地，步骤2）中改良的贝尔曼漏斗所需设备简单，操作易行，具体如下：将直径为10cm的玻璃漏斗置漏斗架上，下面接一段10cm左右的橡皮管，橡皮管上安装有止水夹，将定制的10目筛网嵌在玻璃漏斗上，在筛网上放置一层纸巾，然后用生境水打湿纸巾，用洗瓶将500目筛网上的线虫冲洗到玻璃漏斗中，保留的凋落物铺在漏斗中的纸巾上，漏斗上方30cm处安置一个加热的罩灯，使线虫向下游动，24h后打开止水夹收集线虫。

进一步地，步骤2）中该属线虫的主要鉴定特征如下：①脱水完成后，雌虫虫体体直呈直线或腹弯呈括弧形，雄虫通常尾部会向腹部弯成钩状，整个虫体呈“j”形；活体线虫游动时呈“s”形，摆动频率很高，不游动时呈一条细直线状；②体长通常为0.5-1.1mm，体表光滑无刚毛，仅头部通常具一圈6-12根刚毛；③口腔长约4μm，双口腔，周围环绕着咽部组织，后腔呈圆形且强烈角质化，无后部食道球；④侧器圆形；⑤尾长，前端圆锥形，后端骤然变细呈线形，雄虫常具生殖乳突，但不具交合伞。

进一步地，步骤3）中接种到改良的灭菌营养培养基是将培养液在高压灭菌锅中，121℃下灭菌20min得到。其富集培养后得到的该属海洋食细菌线虫的保存方法如下：每隔3-4个月，对食细菌线虫进行继代培养，时间过长则培养基的水分蒸发以及食物资源的匮乏，线虫会死亡。其具体操作过程为，配置新鲜的营养培养基，从有线虫活动的培养基上挑出一小块，放在新配置的营养培养基上，将培养皿封口后放入20℃恒温培养箱中黑暗培养，并定期观察生长状况。

本发明具有以下有益效果：方法操作简便，容易执行，改良的营养培养基使得该属食细菌线虫的生长和繁殖状况良好，线虫个体质量好且具有很高的成活率，能够有效地得到大量纯培养的该属食细菌线虫，为研究土壤中食细菌线虫的生活史、取食行为以及整个微食物网提供技术支持。此外，食细菌线虫在盐沼植物凋落物中占优势，可以通过研究其与细菌的相互作用，进一步揭示线虫对凋落物分解和养分释放动态的影响。再者，由于diplolaimella属食细菌线虫具有生命周期短、耐逆性的特点，可将其应用于毒理学研究和水体环境监测。

附图说明

图1为食细菌线虫在营养培养基中的生存照片。

具体实施方式

以下结合说明书附图及对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。

实施例1：线虫的富集培养方法

从浙江省宁波市杭州湾湿地潮间地带采集新鲜沉积物和芦苇叶片。采用改良的凋落盒法从沉积物中富集培养线虫。具体方法描述如下：

首先将采集到的底泥样品均匀地铺在在20×30cm的塑料盒底层中，高度约为1cm，然后再将3g芦苇叶片填充至一个15×20cm的网孔大小为1mm的尼龙袋中，将该尼龙袋平铺至覆盖过1cm厚底泥的塑料盒中，再往尼龙袋上均匀地盖一层1cm厚的底泥，最后添加生境水至刚好浸没表层，用锡箔纸将塑料盒上方封住以构造一个避光的条件，在锡箔纸上扎40×60个直径为1mm的小孔透气，将其放在20-25℃温度下培养两个月，期间定期向塑料盒中补充生境水以保持底泥处于湿润的状态。

实施例2：食细菌单宫线虫的分离与鉴定

采用改良的贝尔曼漏斗法从芦苇叶片和底泥的混合物中分离线虫，以下将描述两种具体实施方法：

用铁架台固定好玻璃漏斗，玻璃漏斗下方接有一根长为10cm直径为1cm的橡皮管，橡皮管用止水夹夹紧。将定制的10目的不锈钢筛网放入配套的漏斗上口中，在筛网上铺上一层纸巾，并用水湿润使其紧贴于筛网内侧。用镊子夹取尼龙袋中的凋落物于500ml锥形瓶中，添加生境水至250ml，旋紧橡木塞，上下剧烈晃动20秒后，打开橡木塞，过10目和500目组合筛网，线虫保留在500目筛网上，将大孔径筛网上保留的凋落物放回到锥形瓶中，重复上述步骤两次。通过筛洗将500目筛网上的线虫冲洗到改良的贝尔曼漏斗中，然后把筛洗后的凋落物铺在筛网表层，往筛网中加入生境水至恰好浸没凋落物。在整个漏斗装置上方添加一个罩灯。由于重力作用且线虫本身具备趋水性，线虫能够脱离凋落物，并且穿过面巾纸和筛网的孔隙进入漏斗下方橡胶管的水中，加之罩灯加热能够促使线虫更快速地向下游动。24h后打开止水夹收集线虫于培养皿中。根据单宫属线虫的形态特征，用解剖针挑取食细菌线虫，此时便分离出了食细菌线虫（diplolaimella）。

将分离出的食细菌线虫（diplolaimella）移入4%福尔马林中固定，将固定后的食细菌线虫转移至直径为2.5cm的培养皿中，在培养皿中加入1.5ml脱水剂，加盖，置于干燥器中脱水2周以上。将载玻片置于温度为60℃的载片恒温烘干器上预热，将蜡置于载玻片上进行融化，用与5ml移液枪匹配的枪头底端蘸取融化的蜡，然后在一张新的已经预热的载玻片上进行按压，按压时注意力度，使蜡圈均匀。将按压后的载玻片置于常温的桌面上使蜡圈凝固。然后滴放一滴纯甘油至蜡圈中，用解剖针挑取脱水完成后的食细菌线虫到甘油中，盖上盖玻片。将整个玻片放到70℃的载片恒温烘干器加热，石蜡融解，将玻片置于常温的桌面上，待蜡圈冷却凝固后，封片完成，用显微镜进行线虫的鉴定。

鉴定diplolaimella属食细菌线虫时依据的主要特征如下：①脱水完成后，雌虫虫体体直呈直线或腹弯呈括弧形，雄虫通常尾部会向腹部弯成钩状，整个虫体呈“j”形；活体线虫游动时呈“s”形，摆动频率很高，不游动时呈一条细直线状；②体长通常为0.5-1.1mm，体表光滑无刚毛，仅头部通常具一圈6-12根刚毛；③口腔长约4μm，双口腔，周围环绕着咽部组织，后腔呈圆形且强烈角质化，无后部食道球；④侧器圆形；⑤尾长，前端圆锥形，后端骤然变细呈线形，雄虫常具生殖乳突，但不具交合伞。

实施例3：食细菌线虫的扩大培养

食细菌线虫是指以细菌为主要食物来源的线虫，因此在富集培养过程中要提供合适的食物来源，这对培养基的类型和配方要求较高，如培养基中的agar浓度过低会导致食细菌线虫钻洞且生长缓慢、繁殖力低下；过高则含水量不足，会导致食细菌线虫脱水而死。发明人对培养基的类型和配方、培养条件等进行了不断地摸索，最终确定的方法如下：

改良的营养培养基的配方为：每200ml过0.45μm滤膜的生境水中，0.01g胆固醇，4gagar，再超声破碎30min，放入高压灭菌锅中121℃灭菌20min，稍稍冷却后倒入直径为9cm的培养基中，厚度为0.6-1.0cm。用解剖针挑取10条该属食细菌线虫接种到改良的灭菌营养培养基上，用封口膜封口后将培养皿倒置放在恒温培养箱中，20℃-25℃黑暗培养，定期观察，一周后发现培养基上出现蠕虫型胚胎期的虫卵，线虫可以繁殖。

在解剖镜下观察，找出一块线虫数量多且培养基未被污染的区域，在培养皿底部用油性记号笔进行标记。将已标记的培养皿和未接种线虫的含有改良的灭菌营养培养基的培养皿的外壁消毒后放入超净工作台中，取一个解剖刀，用酒精消毒后用酒精灯进行灼烧灭菌，待其稍稍冷却后，打开培养皿的封口膜，将其连接处稍稍靠近酒精灯外焰，旋转一周以降低培养基被污染的风险。在做标记处切下1cm×1cm的厚为0.1-0.3mm的培养基，将其倒扣于未接种的含有改良的灭菌营养培养基的培养皿中央，将新的培养皿连接处稍稍靠近酒精灯外焰，旋转一周后封上封口膜。将新的培养皿置于解剖镜下观察可见：小方块底部的diplolaimella属食细菌线虫均已爬出，再将培养皿倒置放在恒温培养箱中，20℃-25℃黑暗培养，便完成了对diplolaimella属食细菌线虫的扩大培养，重复以上步骤获得大量的diplolaimella属食细菌线虫。

图1为食细菌线虫（diplolaimellasp.）在营养培养基中的生存照片，由图1可知，培养10天后食细菌线虫（diplolaimellasp.）在改良的营养培养基中的生存良好，证明本实验方法实现了食细菌线虫（diplolaimellasp.）在室内的可控可持续培养。