饲料中添加姜黄素对鲟鱼消化性能和抗菌性能的影响研究的制作方法

1.本发明涉及一种天然化合物对鲟鱼生长性能和抗菌性能的研究，具体为一种饲料中添加姜黄素对鲟鱼消化性能和抗菌性能的影响研究，属于淡水渔业养殖应用领域。


背景技术：

2.姜黄素是一种天然化合物，具有良好的抗炎和抗癌特性。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，化学式为c
21
h
20
o6，在食品生产中主要用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色。
3.姜黄素最早是在1870年从姜黄curcumalonga l.中首次分离出来一种低相对分子质量多酚类化合物，1910年阐明了其双阿魏酰甲烷的化学结构，随后有关其生理、药理作用的研究便取得了明显的进展。随着对姜黄素研究的日益深入，已发现其具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小。姜黄素目前是世界上销量最大的天然食用色素之一，是世界卫生组织和美国食品药品管理局以及多国准许使用的食品添加剂。吸引研究人员的不仅是姜黄素作为一种非甾体类抗炎药物，而因为其所具有的化学预防特性，姜黄素对疾病具有广泛的预防特性。鉴于现代医学研究发现人体众多疾病的发生与自由基形成、炎症反应的参与有关，姜黄素抗氧化活性和抗炎作用已引起国内外学者的广泛关注。
4.鲟鱼因其营养价值非常高，肉质鲜美，且没有刺，所以非常适合老人和小孩吃，随着人类生活水平的逐渐提高，鲟鱼也成为了大家最喜欢的食物，为了满足市场的需求，养殖鲟鱼也成为了一个比较热门的项目。为了提高鲟鱼养殖过程中的生长性能，提高饲料利用率，同时降低鲟鱼因被细菌感染而引起的患病率，养殖人员会在饲料中添加抗生素，但抗生素过量添加不仅会污染水源，且不利于人体健康。
5.鉴于姜黄素具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染等性能，本技术将姜黄素作为饲料添加剂加入到鲟鱼的基础饲料中，研究饲料中添加姜黄素对鲟鱼生长性能和抗菌性能的影响，并得出饲料中姜黄素的最适添加量，以期可以利用姜黄素代替抗生素使用，为鲟鱼的生产养殖提供理论依据。


技术实现要素：

6.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种饲料中添加姜黄素对鲟鱼消化性能和抗菌性能的影响研究。
7.本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种饲料中添加姜黄素对鲟鱼消化性能和抗菌性能的影响研究，包括饲料中添加姜黄素对鲟生长性能、肌肉品质和消化酶活性的研究以及饲料中添加姜黄素对鲟鱼侵染细菌后的保护作用研究，具体步骤如下，
8.a、试验设计
9.在基础饲料中分别添加0、20、40、80、160和320mg/kg的姜黄素连续饲喂初始体重为12.56
±
3g的鲟鱼60d，每组3个重复，每个重复35尾鱼；
10.养殖结束后，每箱随机取6尾鱼进行解剖采样，研究姜黄素对鲟鱼生长性能、消化酶活性、肌肉品质的影响及饲料中姜黄素的适宜添加水平；同时对水箱中剩余的试验鱼进行嗜水气单胞菌注射攻毒实验，每尾鱼胸鳍基部注射0.1ml嗜水气单胞菌菌悬液，其中单胞菌菌悬液中活菌数为2.09
×
107cfu/ml，攻毒后24、48和72小时分别取鱼血浆，检测鲟抗氧化能力指标与肝脏组织中免疫相关的基因hep1 mrna和hep2 mrna表达水平；
11.b、试验管理
12.每天分别于8:30和16:30饱食投喂两次，每次投喂持续30min以上，且24h连续充气增氧，整个养殖实验期间水质条件为：水温24.5～30.5℃、溶解氧在6mg/l以上、氨氮在0.1mg/l以下、亚硝酸盐在0.1mg/l以下、ph6.8～7.5；
13.c、采样与处理
14.养殖实验结束后禁食24h采样，称取每箱鲟鱼的总体质量，计数尾数；每箱随机取6尾鱼，采用浓度为100mg/l的ms
‑
222快速深度麻醉，并迅速分离内脏、肝脏，并称取，分离胃、幽门盲囊、肠，取侧线以上肌肉，将所得肝脏、胃、肠、肌肉样本
‑
80℃冻存备用；
15.攻毒后24、48和72小时后，分别从每个水箱随机取6尾鱼，采用浓度为100mg/l的ms
‑
222快速深度麻醉，尾静脉采血1.0～1.5ml，将血样收集在edta
‑
k2抗凝管中，在4℃条件下3000r/min冷冻离心10min取上清血浆；同时快速分离肝脏，将所得血浆、肝脏样本
‑
80℃冻存备用；
16.d、各指标测定
17.包括生长与形体指标、常规营养成分测定、肌肉氨基酸和脂肪酸测定、蛋白质营养学评价、消化酶活性测定、血浆生化指标测定和肝脏组织免疫相关的基因hep1 mrna和hep2 mrna表达水平测定；
18.e、数据统计与分析
19.据采用spss17.0软件进行单因素方差分析，数据差异显著，采用duncan’s检验法进行多重比较，差异水平定为p<0.05，实验数据以mean
±
sd表示。
20.优选地，所述生长与形体指标的测定包括增重率、特定生长率、饲料系数、肥满度、内脏比、肝体比的计算，具体计算方法如下，
21.增重率(weight gain,wg/％)＝(w
t
‑
w0)
÷
w0×
100％
22.特定生长率(specific growth rate,sgr/(％/d))＝(lnw
t
‑
lnw0)
÷
t
×
100％
23.饵料系数(feed conversion ratio,fcr)＝f
÷
(w
t
‑
w0)
24.脏体比(viserosomatic index,vsi/％)＝w
v
÷
w
t
×
100％
25.肝体比(hepatosomatic index,hsi/％)＝w
h
÷
w
t
×
100％
26.肥满度(condition factor,cf/％)＝w
t
÷
l3×
100％
27.式中，w0为实验开始时鱼的体质量(g)；w
t
为实验结束时鱼的体质量(g)；l为实验结束时鱼的体长(cm)；t为鱼的养殖天数(d)；f为摄食的饲料量(g)；w
v
为实验结束时鱼的内脏质量(g)；w
h
为实验结束时鱼的肝脏质量(g)。
28.优选地，所述常规营养成分测定包括水分、灰分、蛋白质和粗脂肪的测定，其中水分测定采用105℃烘箱干燥法，灰分测定采用550℃干法灰化法，蛋白质测定采用凯氏定氮法，粗脂肪测定采用索氏抽提法。
29.优选地，所述肌肉氨基酸的测定依据《gb 5009.124
‑
2016食品安全国家标准食品
中氨基酸的测定》检测，肌肉脂肪酸测定依据《gb 5009.168
‑
2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》检测。
30.优选地，所述蛋白质营养学评价参照1973年联合国粮农组织/世界卫生组织"fao/who)专家委员会建议的每克氮氨基酸评分标准模式和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所提出的鸡蛋蛋白模式进行，具体如下，
31.氨基酸质量分数"mg/gn)＝"样品某种氨基酸质量
÷
样品粗蛋白质量)
×
6.25
×
1000$
32.蛋白质的氨基酸评分"aas)＝"样品某种氨基酸质量分数
÷
fao/who标准模式中同种氨基酸质量分数)
×
100；
33.蛋白质的化学评分"cs)＝"样品某种氨基酸质量分数
÷
全鸡蛋蛋白质中同种氨基酸质量分数)
×
100。
34.优选地，所述消化酶的测定包括对鲟鱼胃中的蛋白酶、肝脏和中的胰蛋白酶、肠中的脂肪酶活性的测定，检测过程中所使用的试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
35.优选地，所述血浆生化指标测定包括检测总抗氧化能力(t
‑
aoc)、超氧化物歧化酶(sod)、碱性磷酸酶(akp)、丙二醛(mda)活性，检测过程中所使用的试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
36.优选地，所述试验用鲟鱼由山东省淡水渔业研究院良种场提供，挑选大小、规格、体质量基本一致的鱼630尾，平均初始体质量(12.56
±
3)g。
37.优选地，所述基础饲料选用鱼粉、豆粕、次粉、啤酒酵母、鱼油、豆油、预混料进行科学配伍，饲料原料由山东升索渔用饲料研究中心提供，饲料中添加的姜黄素纯度>95％，由西安飞达生物技术有限公司提供。
38.优选地，所述养殖实验于18个室内自制循环水系统箱内进行，水箱规格为60cm
×
80cm
×
70cm，每组试验所用水箱在空间位置上随机分散排布。
39.本发明的有益效果是：
40.1、试验研究结果表明，饲料中姜黄素的添加量不宜超过80mg/kg，过量添加姜黄素会造成生长抑制；
41.2、试验研究结果表明，饲料中姜黄素的添加量为20mg/kg时，生长性能、消化酶活性均未出现不良影响，且肌肉中dha含量显著升高，肌肉品质显著提升；
42.3、试验研究结果表明，饲料中添加适量的姜黄素具有减少嗜水气单胞菌侵染对机体的损伤作用，发挥抗氧化作用和提高肝脏组织免疫相关基因表达的最佳剂量为40mg/kg。
附图说明
43.图1a为本发明嗜血气单胞菌注射攻毒后不同水平姜黄素对肝脏组织中基因hep1 mrna的表达水平影响图。
44.图1b为本发明嗜血气单胞菌注射攻毒后不同水平姜黄素对肝脏组织中基因hep2 mrna的表达水平影响图。
具体实施方式
45.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.本研究中试验数据采用spss17.0软件进行单因素方差分析，数据差异显著，采用duncan’s检验法进行多重比较，差异水平定为p<0.05，实验数据以mean
±
sd表示。
47.实施例一饲料中添加姜黄素对鲟生长性能、肌肉品质和消化酶活性的研究
48.1、材料与方法
49.1.1试验材料
50.实验用鲟鱼由山东省淡水渔业研究院良种场提供。挑选大小、规格、体质量基本一致的鱼630尾，平均初始体质量(12.56
±
3)g。
51.基础饲料选用鱼粉、豆粕、次粉、啤酒酵母、鱼油、豆油等进行了科学配伍，具体配方及营养水平见表1。饲料原料由山东升索渔用饲料研究中心提供，姜黄素(纯度>95％)由西安飞达生物技术有限公司提供。
52.基础饲料和实验饲料的制备：将饲料原料粉碎并过40目筛，采用逐级混匀的方法使用搅拌机将原料充分混匀，加水后用小型软颗粒机(slp
‑
45，购自中国水产科学研究院渔业机械研究所)制成直径为1.5mm和2.5mm的颗粒饲料风干备用。
53.表1实验饲料组成及营养水平
[0054][0055]
注:a、每千克维生素预混料包含以下维生素:va 900000iu；vd 200000iu；ve 4500mg；vk3 220mg；vb1 320mg；vb2 1090mg；烟酸2800mg；vb5 2000mg；vb6 500mg；vb12 1.6mg；vc 5000mg；泛酸1000mg；叶酸165mg；胆碱60000mg；
[0056]
b、每千克矿物质预混料包含以下矿物质:feso4
·
7h2o 25g；cuso4
·
5h2o 2.0g；znso4
·
7h2o 22g；na2seo3 0.04g；ki 0.026g；mnso4
·
4h2o 7g；cocl2
·
6h2o 0.1g。
[0057]
1.2试验设计
[0058]
在基础饲料中分别添加0、20、40、80、160和320mg/kg的姜黄素连续饲喂初始体质量12.56
±
3g的鲟60d，每组3个重复，每个重复35尾鱼；
[0059]
养殖实验于18个室内自制循环水系统箱(60cm
×
80cm
×
70cm)内进行，每组实验所用水箱在空间位置上随机分散排布，减少实验组之间因光线、循环水质等因素造成的误差。
[0060]
1.3试验管理
[0061]
每天分别于8:30和16:30投喂2次，表观饱食投喂，每次投喂持续30min以上；
[0062]
每天吸污换水(换水量不超过水体1/3)确保水质，24h连续充气增氧；
[0063]
整个养殖实验期间水质条件为:水温24.5～30.5℃、溶解氧在6mg/l以上、氨氮在0.1mg/l以下、亚硝酸盐在0.1mg/l以下、ph 6.8～7.5。
[0064]
1.4采样与处理
[0065]
养殖实验结束禁食24h采样，称取每箱鲟幼鱼的总体质量，计数尾数；每箱随机取6尾鱼，ms
‑
222(100mg/l)快速深度麻醉，测定体质量、体长；迅速分离内脏、肝脏，并称取，分离胃、幽门盲囊、肠，取侧线以上肌肉，将所得肝脏、胃、肠、肌肉样本
‑
80℃冻存备用。
[0066]
2、指标的测定与分析
[0067]
2.1.1生长与形体指标的测定
[0068]
根据采样时获得的生长与形体数据，计算增重率、特定生长率、饲料系数、肥满度、内脏比、肝体比的计算，鱼体生长及饲料利用率等指标的计算方法如下：
[0069]
增重率(weight gain,wg/％)＝(w
t
‑
w0)
÷
w0×
100％
[0070]
特定生长率(specific growth rate,sgr/(％/d))＝(lnw
t
‑
lnw0)
÷
t
×
100％
[0071]
饵料系数(feed conversion ratio,fcr)＝f
÷
(w
t
‑
w0)
[0072]
脏体比(viserosomatic index,vsi/％)＝w
v
÷
w
t
×
100％
[0073]
肝体比(hepatosomatic index,hsi/％)＝w
h
÷
w
t
×
100％
[0074]
肥满度(condition factor,cf/％)＝w
t
÷
l3×
100％
[0075]
式中，w0为实验开始时鱼的体质量(g)；w
t
为实验结束时鱼的体质量(g)；l为实验结束时鱼的体长(cm)；t为鱼的养殖天数(d)；f为摄食的饲料量(g)；w
v
为实验结束时鱼的内脏质量(g)；w
h
为实验结束时鱼的肝脏质量(g)。
[0076]
2.1.2饲料中添加姜黄素对鲟鱼生长性能的影响分析
[0077]
饲料中添加姜黄素对鲟生长性能的影响见表2，饲料中添加20mg/kg、40mg/kg姜黄素对鲟末均重、增重率、特定生长率的影响不显著(p>0.05)，添加80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg姜黄素鲟末均重、增重率、特定生长率显著降低(p<0.05)；饲料中添加320mg/kg姜黄素显著增高了鲟的饵料系数(p<0.05)，其余各组饵料系数与对照组差异不显著(p>0.05)；姜黄素的添加对鲟存活率影响不显著(p>0.05)；饲料中添加320mg/kg姜黄素显著降低了鲟的脏体比(p<0.05)，其余各组脏体比与对照组差异不显著(p>0.05)；饲料中添加160mg/kg、320mg/kg姜黄素显著降低了鲟的肝体比、肥满度(p<0.05)，其余各组肝体比和肥满度与对照组差异不显著(p>0.05)。
[0078]
表2饲料中添加姜黄素对鲟生长性能的影响
[0079][0080][0081]
注:同行数据肩标不含相同字母的两组平均值之间差异显著(p<0.05)。
[0082]
2.2.1常规营养成分测定
[0083]
取50g左右
‑
80℃冻存备用的肌肉，4℃冰箱解冻，用于检测水分、灰分、蛋白质、脂肪含量。
[0084]
其中水分测定采用105℃烘箱干燥法；灰分测定采用550℃干法灰化法；蛋白质测定采用凯氏定氮法；粗脂肪测定采用索氏抽提法。
[0085]
2.2.2肌肉氨基酸、脂肪酸测定
[0086]
分别取5g、10g左右的
‑
80℃冻存备用肌肉，4℃冰箱解冻，用于检测氨基酸、脂肪酸。
[0087]
氨基酸测定：依据《gb 5009.124
‑
2016食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》检测，其中色氨酸因酸法水解破坏未检测；
[0088]
脂肪酸测定：依据《gb 5009.168
‑
2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》检测。
[0089]
2.2.3蛋白质营养学评价
[0090]
蛋白质营养学评价参照1973年联合国粮农组织/世界卫生组织"fao/who)专家委员会建议的每克氮氨基酸评分标准模式和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所提出的鸡蛋蛋白模式进行，具体如下，
[0091]
氨基酸质量分数"mg/gn)＝"样品某种氨基酸质量
÷
样品粗蛋白质量)
×
6.25
×
1000；
[0092]
蛋白质的氨基酸评分"aas)＝"样品某种氨基酸质量分数
÷
fao/who标准模式中同种氨基酸质量分数)
×
100；
[0093]
蛋白质的化学评分"cs)＝"样品某种氨基酸质量分数
÷
全鸡蛋蛋白质中同种氨基酸质量分数)
×
100@
[0094]
2.2.4饲料中添加姜黄素对鲟肌肉品质的影响分析
[0095]
饲料中添加姜黄素对鲟肌肉氨基酸组成及含量的影响见表3。饲料中添加0～320mg/kg姜黄素对鲟肌肉中氨基酸种类、eaa/taa、eaa/neaa、uaa/taa影响不显著；添加80mg/kg姜黄素显著提高鲟肌肉中taa、eaa、neaa、uaa，其他各组间差异不显著。
[0096]
表3饲料中添加姜黄素对鲟肌肉氨基酸组成及含量的影响
[0097]
[0098][0099]
注：1.
1)
必需氨基酸eaa；
2)
半必需氨基酸heaa；
3)
非必需氨基酸neaa；
4)
鲜味氨基酸uaa；总氨基酸taa；
[0100]
2.同行数据肩标不含相同字母的两组平均值之间差异显著(p<0.05)。
[0101]
饲料中添加姜黄素对鲟肌肉的必需氨基酸质量分数的影响见表4。饲料中添加80mg/kg、160mg/kg姜黄素提高了鲟肌肉中蛋氨酸+半胱氨酸的氨基酸质量分数，这是因为80mg/kg组、160mg/kg组肌肉中蛋氨酸和半胱氨酸含量较其他组高(详见表3)。
[0102]
表4饲料中添加姜黄素对鲟肌肉的必需氨基酸质量分数的影响
[0103]
(mg/gn)
[0104]
[0105][0106]
饲料中添加姜黄素对鲟肌肉蛋白质的氨基酸评分影响见表5，饲料中添加姜黄素对鲟肌肉蛋白质的化学评分影响见表6。饲料中添加80mg/kg、160mg/kg姜黄素提高了鲟肌肉中蛋氨酸+半胱氨酸的氨基酸评分和化学评分，其他组间必需氨基酸的氨基酸评分和化学评分差异不显著。
[0107]
表5饲料中添加姜黄素对鲟肌肉蛋白质的氨基酸评分的影响
[0108][0109]
表6饲料中添加姜黄素对鲟肌肉蛋白质的化学评分的影响
[0110][0111]
饲料中添加姜黄素对鲟肌肉脂肪酸组成及含量的影响见表7。鲟肌肉中含量较为丰富的脂肪酸分别为c
18:0
、c
18:1
、c
18:2
、c
22:6
(含量≥6％)。饲料中添加0～320mg/kg姜黄素对鲟肌肉脂肪酸种类、饱和脂肪酸总量、不饱和脂肪酸总量影响不显著(p>0.05)；饲料中添加20mg/kg姜黄素显著降低了鲟肌肉中c
18:1
、c
18:2
的含量(p<0.05)，显著提高了c
20:4
、c
20:5
、c
22:6
的含量(p<0.05)；40mg/kg组鲟肌肉中c
20:4
含量显著低于20mg/kg组，但显著高于其他组(p<0.05)。
[0112]
表7饲料中添加姜黄素对鲟肌肉脂肪酸组成及含量的影响
[0113]
[0114][0115]
注:同行数据肩标不含相同字母的两组平均值之间差异显著(p<0.05)@
[0116]
2.3.1鲟鱼消化酶活性的测定
[0117]
胰蛋白酶活性测定采用紫外比色法；胃蛋白酶活性测定采用比色法；脂肪酶活性测定采用微板法。消化酶测定过程中所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
[0118]
2.3.2饲料中添加姜黄素对鲟消化酶活性的影响分析
[0119]
饲料中添加姜黄素对鲟消化酶活性的影响见表8。饲料中添加0～320mg/kg姜黄素对鲟胃中的蛋白酶、肝脏和中的胰蛋白酶、肠中的脂肪酶活性影响不显著(p>0.05)；与对照组相比，饲料中添加20～320mg/kg姜黄素对鲟胃中的脂肪酶活性影响不显著(p>0.05)，但320mg/kg组胃中脂肪酶活性显著高于160mg/kg组(p<0.05)，与其他组差异不显著(p>0.05)；与对照组相比，饲料中添加40～320mg/kg姜黄素后鲟肠中胰蛋白酶活性显著升高(p<0.05)，但添加20mg/kg姜黄素对肠中胰蛋白酶活性影响不显著(p>0.05)；与对照组相比，饲料中添加40mg/kg姜黄素显著降低了肝脏中脂肪酶活性(p<0.05)；与对照组比较，饲料中添加20mg/kg、80mg/kg姜黄素显著提高了中脂肪酶活性，但添加40mg/kg姜黄素显著降低中脂肪酶活性(p<0.05)。
[0120]
表8饲料中添加姜黄素对鲟消化酶活性的影响
[0121]
[0122][0123]
注:同行数据肩标不含相同字母的两组平均值之间差异显著(p<0.05)。
[0124]
以上结果表明，饲料中添加20mg/kg、40mg/kg姜黄素对鲟生长性能影响不显著，添加80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg姜黄素鲟生长性能显著降低；添加80mg/kg姜黄素显著提高鲟肌肉中taa、eaa、neaa、uaa，饲料中添加80mg/kg、160mg/kg姜黄素提高了鲟肌肉中蛋氨酸+半胱氨酸的氨基酸质量分数、氨基酸评分和化学评分，饲料中添加20mg/kg姜黄素显著降低了鲟肌肉中c
18:1
、c
18:2
的含量，显著提高了c
20:4
、c
20:5
、c
22:6
的含量；饲料中添加20～320mg/kg姜黄素对鲟胃中的蛋白酶和脂肪酶、肝脏和中的胰蛋白酶、肠中的脂肪酶活性影响不显著，添加40～320mg/kg姜黄素后鲟肠中胰蛋白酶活性显著升高，添加20mg/kg、80mg/kg姜黄素显著提高了中脂肪酶活性，但添加40mg/kg姜黄素显著降低中脂肪酶活性。
[0125]
综上所述，饲料中姜黄素的添加量不宜超过80mg/kg，过量添加姜黄素会造成生长抑制。上述实施例中，饲料中姜黄素的添加量为20mg/kg时，生长性能、消化酶活性均未出现不良影响，且肌肉中dha含量显著升高，肌肉品质显著提升。
[0126]
实施例二饲料中添加姜黄素对鲟鱼侵染细菌后的保护作用研究
[0127]
1、材料与方法
[0128]
1.1试验设计
[0129]
实施例一中养殖试验结束后，每箱随机取6尾鱼进行解剖采样，用于实施一的研究分析，同时对水箱中剩余的试验鱼进行嗜水气单胞菌注射攻毒实验，攻毒后24、48和72小时分别取鱼血浆，检测鲟抗氧化能力指标与肝脏组织中免疫相关的基因hep1和hep2 mrna表
达水平。
[0130]
1.2采样与处理
[0131]
攻毒后24、48和72小时后，分别从每个水箱随机取6尾鱼，采用浓度为100mg/l的ms
‑
222快速深度麻醉，尾静脉采血，将血样收集在edta
‑
k2抗凝管中，在4℃条件下3000r/min冷冻离心10min取上清血浆；同时快速分离肝脏，将所得血浆、肝脏样本
‑
80℃冻存备用。
[0132]
2、指标的测定与分析
[0133]
2.1.1血浆生化指标测定
[0134]
取
‑
80℃冻存备用的血浆，4℃冰箱解冻。检测总抗氧化能力(t
‑
aoc)、超氧化物歧化酶(sod)、碱性磷酸酶(akp)、丙二醛(mda)活性。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0135]
2.1.2嗜血气单胞菌注射攻毒后不同水平姜黄素对血清抗氧化能力指标的影响分析
[0136]
嗜血气单胞菌注射攻毒后不同水平姜黄素对血清抗氧化能力指标的影响见表9。与0h对照组相比，24h时80mg/kg组血浆t
‑
aoc明显高于其他组；48h时，与0mg/kg相比，各组姜黄素处理血浆t
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aoc显著降低；攻毒48h后，160mg/kg姜黄素干预组血浆sod明显低于其他组；攻毒72h后，320mg/kg组血浆akp明显高于其他各组；攻毒24h时，320mg/kg姜黄素组血浆mda明显高于其他各组，而攻毒72h时，与0mg/kg相比，各组鱼血浆mda明显升高。
[0137]
表9嗜血气单胞菌注射攻毒后不同水平姜黄素对血清抗氧化能力指标的影响
[0138]
[0139][0140]
注：
“‑”
为样本缺失，未检测
[0141]
2.2.1肝脏组织免疫相关的基因hep1 mrna和hep 2mrna表达水平测定
[0142]
取
‑
80℃冻存备用的肝脏，采用trizol法提取嗜水气单胞菌攻毒前后各时间段的肝组织总rna，测定总rna纯度，使od260/od280为1.8～2.0，并凝胶电泳检测总rna质量；反转录为cdna；根据hep1 mrna和hep2 mrna的基因全序列用primer 5设计引物(如表10所示)进行实时荧光定量pcr反应，反应条件：95t 15min；94t 15s，60t 60s，循环40次。sybergreen法检测目的基因的扩增，β
‑
actin为内参基因，所有反应均设3个重复。hep1 mrna和hep2 mrna水平采用2
‑
δδct
法计算。所用试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0143]
表10 hep1和hep2基因荧光定量pcr引物
[0144][0145]
2.2.2嗜血气单胞菌注射攻毒后不同水平姜黄素对鲟肝脏组织免疫相关基因表达的影响分析
[0146]
利用荧光定量pcr技术分析了嗜血气单胞菌攻毒前后不同时间肝脏组织中免疫相关的基因hep1 mrna和hep2 mrna表达水平，结果显示hep1 mrna在攻毒后48h和72h出现明显升高，升高幅度达到10～15倍左右，特别地，20与40mg/kg姜黄素干预会极大促进hep1的表达，如图1a所示，提示姜黄素具有提高鲟免疫的能力；hep2 mrna在攻毒后24小时显著升高，但随后在48h和72h迅速下降，如图1b所示，提示hep2 mrna可能是一种应激反应基因，在感染早期发挥重要作用。
[0147]
以上结果表明，日粮中40～320mg/kg姜黄素营养强化60d，未攻毒前血浆t
‑
aoc较0、20mg/kg组显著降低，但攻毒24h时t
‑
aoc活性较攻毒前显著升高，48h、72h时t
‑
aoc活性降低；血浆sod活性表明，姜黄素添加量0、80、160、320mg/kg组攻毒48h时，鱼体sod免疫应答才显著提升，而20、40mg/kg组攻毒24h时sod免疫系统即开始发挥作用；血浆akp活性表明，对照组鱼体akp免疫应答48h时显著提升，但姜黄素添加量20、40、80、160mg/kg组攻毒24h时akp活性已显著升高，最高浓度320mg/kg组akp活性无显著变化；氧化反应产物mda含量表明，0、20、40、80、160mg/kg组攻毒24h后，鲟机体抗氧化体系发挥作用，血浆中mda含量均显著下降，但20、80、160mg/kg组72h时mda含量又显著升高，而最高浓度320mg/kg组攻毒后mda含量持续升高。肝脏组织免疫相关基因表达结果显示，鲟肝脏hep1 mrna在攻毒后48h和72h出现明显升高，20、40mg/kg姜黄素干预会极大促进hep1基因的表达；而hep2 mrna在攻毒后24小时显著升高，但随后在48h和72h迅速下降，40、160mg/kg姜黄素干预会极大促进hep2基因的表达。
[0148]
综上所述，本实施例条件下，鲟饲料中添加适量的姜黄素具有减少嗜水气单胞菌
侵染对机体的损伤作用，发挥抗氧化作用和提高肝脏组织免疫相关基因表达的最佳剂量为40mg/kg。
[0149]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0150]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。