五味子果实提取物及其制备方法与在抗烟草花叶病毒中的应用

1.本发明涉及一种五味子果实提取物及其制备方法与在抗烟草花叶病毒中的应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.植物源农药是将植物中含有的生物活性成分分离并制成药剂，其主要针对植物病虫害。其优点是，植物源农药来源于自然，可以降解为无毒无污染的物质，不会对环境产生破坏。另一方面与化学农药相比，不易使病虫产生抗药性，提高了使用周期。植物源农药的出现解决了化学药剂使用过程中产生的一系列问题。
3.目前市场上的植物源农药针对目标不同主要分为杀虫、除草、杀菌、抗病毒四类。植物抗病诱导剂是通过激发植物自身系统产生抗性为基本原理，抗病诱导剂最大的特点就是本身不会直接对病原菌产生抑制效果，而是通过对植物进行诱导，激发植物体内所具有的潜力，从而以间接的方式达到抗病的效果，这类药剂不但可以提高植物抗病虫害的能力，同时也能起到促进生长的作用。施用方法简单、用药安全等特点，也使得植物源抗病诱导剂发展迅速，在市场中占据了一定的优势地位。目前植物源诱抗剂中水杨酸(sa)、苯并噻二唑(bth)以及2,6
‑
异烟酸(ina)的效果较为显著，这些药剂虽然具有不错的效果，但由于成本高、易降解等原因，使得目前开发的植物源农药不能满足人们在生产中的需求。研发抗病诱导剂，提高药效，增加药剂丰富度是目前应着手解决的问题。关于抗病诱导剂的作用方法主要是提高自身免疫力，即抗病能力或抗逆境能力。通过改变研究对象，研究植物体在受到处理后，激发体内抗病基因表达以提高抗病能力，使自身启动植物防卫反应机制，从而达到抗病抗逆的效果。
4.因此如何筛选出具有诱导活性的植物提取物，选择合适的浓度进行更有效的科学防治，从而达到防治烟草花叶病毒的目的，是研究植物源诱导剂迫切需要解决的问题。
5.烟草花叶病毒是最为常见的rna病毒，引起烟草花叶病。植株在受到烟草花叶病毒(简称tmv)侵染后，其叶片与叶脉组织明显发生变化，叶片也呈现出“花叶”，从而导致叶绿素的减少，进而导致光合作用的减弱，影响植株发育。目前是影响全球烟草产业中最严重的一类病害，其发生分布广，危害严重，化学药剂很难对其产生很好的作用。早在1966年，thornberry就发现烟草花叶病毒可以侵染350多种植物。因其病毒粒子结构稳定，不易失活的特点导致每年会给全球造成大量经济损失，限制烟草生产行业的发展。据统计，全世界每年由tmv导致的农作物经济损失超过了1亿美元，目前此类病毒很难通过药物进行控制。因此，找到具有高效控制烟草花叶病毒的能力的研究，是当下生产实践中最急需解决的问题之一。
6.目前关于烟草花叶病毒的防治，都无法直接对病毒进行作用，而是间接通过隔绝毒源，培育抗病品种，田间栽培种植管理来实现的。但只能是达到规避预防的效果，无法从根源上直接对烟草花叶病毒进行处理。尽管化学农药可以起到一定抑制病毒扩散的作用，
但是化学农药的使用，违背绿色生产的初衷，这也就更加凸显研发植物源农药诱导烟草抗tmv的重要性。
7.五味子科schisandraceae隶属于双子叶植物门木兰亚纲magnoliidae、八角目illiciales，是多年生的落叶、藤本植物，一直作为药用以及园林观赏植物，包括两个属：南五味子属kadsura kaemp f.ex juss.和五味子属schisandra michx.。我国主要产自于中南与西南两个地区。本草纲目曾经有所记载，李时珍将以南北区分五味子。在药典i部中通过测定五味子中五味子醇甲含量来作为判断北五味子与南五味子的依据。
8.北五味子在医学研究中有详细的记载：五味子为木兰科植物五味子的成熟果实，习称“北五味子”，主要产地为我国的东北、华北等地。对咳喘，盗汗，内热，失眠等问题具有一定的疗效。五味子果肉内部散发香气，并略带苦味。研究五味子化合物表明，其种类复杂多样，主要成分有木脂素、黄酮、多糖等，其中总黄酮类的含量可高达6.37％。关于五味子中的主要成分已有大部分学者进行研究，但其中关于活性成分的研究有待深入挖掘。
9.关于五味子的研究，主要集中在医药学领域，该领域对五味子的功能进行了诸多动物、细胞学研究，挖掘出较多对生物有益的价值。也发现了五味子果实提取物对人类病原细菌的抑制作用。在前人的研究中，还发现五味子果实提取物对植物病原真菌细菌都具有一定的抑制效果，尤其对储藏期梨黑斑病具有良好的防治效果。目前并没有利用五味子果实提取出可以诱导植物抗病毒的天然产物。


技术实现要素：

10.本发明的目的是提供一种五味子果实提取物及其制备方法与在抗烟草花叶病毒中的应用，具体提供一种五味子果实提取物及其制备方法与在制备抗烟草花叶病毒产品中的应用。
11.本发明利用有机溶剂提取得到的不同浓度五味子果实提取物，通过诱导烟草抗tmv实验证明五味子果实提取物可调控烟草体内相关代谢及防御酶活性，提高烟草抗tmv能力，说明五味子果实提取物中的有效成分具备诱导烟草植株提高其抗病能力的作用。
12.本发明提供的一种五味子果实提取物的制备方法，包括如下步骤：
13.用体积百分含量95％乙醇水溶液浸泡五味子果实，得到提取液和残渣，然后除去所述提取液中的乙醇，即得到五味子果实提取物。
14.上述的制备方法中，所述的制备方法中还包括将所述残渣重复进行至少一次如下处理的步骤：所述残渣用体积百分含量95％乙醇水溶液浸泡得到续滤液，然后与所述提取液合并。
15.上述的制备方法中，所述浸泡的温度可为28℃，时间可为24h～48h，具体可为24h。
16.上述的制备方法中，所述残渣重复进行处理的次数可为1～5次，具体为3次。
17.本发明还提供了上述的制备方法制备得到的五味子果实提取物。
18.本发明所述的五味子果实提取物应用于抗烟草花叶病毒中。
19.本发明所述的五味子果实提取物应用于制备抗烟草花叶病毒产品中。
20.本发明所述的五味子果实提取物应用于诱导烟草植株产生抗病毒抗性中。
21.本发明所述的五味子果实提取物应用于制备诱导烟草植株产生抗病毒抗性的产品中。
22.上述的应用中，所述病毒为烟草花叶病毒。
23.本发明进一步提供了一种抗烟草花叶病毒产品或诱导烟草植株产生抗病毒抗性的产品，其活性成分为五味子果实提取物。
24.上述的产品中，所述产品中五味子果实提取物的浓度为200μg/ml～100mg/ml。
25.具体的，所述产品用于烟草tmv直接侵染时，所述产品中五味子果实提取物的浓度可为50～100mg/ml；
26.所述产品用于烟草茎时，所述产品中五味子果实提取物的浓度可为200μg/ml～100mg/ml；
27.所述产品用于烟草新生叶时，所述产品中五味子果实提取物的浓度可为50mg/ml～100mg/ml，具体可为50mg/ml或100mg/ml；所述新生叶定义为选取植物为6
‑
8叶期健康植株，上部刚长出叶片。
28.本发明具有以下优点：
29.本发明五味子果实提取物具有诱导烟草植株产生诱导烟草抗tmv的能力，能抑制tmv在烟草中增殖和移动，并摸索了不同浓度的五味子果实提取诱导烟草抗烟草花叶病毒的效果，证明五味子果实经过95％乙醇提取后，对烟草花叶病毒呈现出不同程度的抑制作用；通过紫外灯观察100mg/ml五味子乙醇提取物对tmv抑制效果显著，抑制率为53.46％。qrt
‑
pcr实验中100mg/ml的乙醇提取物病毒抑制率为66.19％。western blot实验进一步印证五味子乙醇提取物随着浓度升高，抑制gfp蛋白表达能力也逐渐增强，其中100mg/ml五味子乙醇提取物对tmv抑制效果最显著，诱导烟草抑制tmv增殖的能力随着浓度的减少而减弱；本发明对进一步开发绿色环保型的病毒诱抗剂提供了依据。
附图说明
30.图1为本发明五味子果实提取物对烟草中注射叶tmv抑制情况(注射后第七天)；其中，图1中a表示空白对照，b表示清水阴性对照(ck)，c表示宁南霉素(200μg/ml)，d表示五味子果实提取物(100mg/ml)，e表示五味子果实提取物(50mg/ml)，f表示五味子果实提取物(5mg/ml)。
31.图2为本发明五味子果实提取物对烟草中茎tmv抑制情况图；其中，图2中a表示空白对照，b表示宁南霉素(200μg/ml)，c表示清水处理组，d表示五味子果实提取物(100mg/ml)。
32.图3为本发明五味子果实提取物对烟草中新生叶tmv抑制情况图；其中，图3中a表示空白对照，b表示清水对照，c表示宁南霉素处理(200μg/ml)，d表示五味子果实提取物(100mg/ml)，e表示五味子果实提取物(50mg/ml)，f表示五味子果实提取物(5mg/ml)。
33.图4为本发明五味子果实提取物对烟草中单片新生叶tmv抑制情况图；其中，图4中a表示清水处理对照，b表示阳性对照
‑
宁南霉素(200μg/ml)，c表示五味子果实提取物(100mg/ml)，d表示五味子果实提取物(50mg/ml)，e表示五味子果实提取物(25mg/ml)，f表示五味子果实提取物(5mg/ml)。
34.图5为本发明通过western
‑
blot检测五味子果实提取物对烟草叶片中绿色荧光蛋白(简称gfp蛋白)表达的抑制；其中，图5中a表示健康植株，b表示阴性对照，c表示宁南霉素(200μg/ml)，d表示五味子果实提取物(100mg/ml)，e表示五味子果实提取物(25mg/ml)。
具体实施方式
35.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
36.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
37.实施例1、五味子果实提取物对烟草花叶病毒(tmv)增殖及运动的抑制效果一、实验材料和方法
38.1寄主植株
39.烟草花叶病毒系统侵染寄主：本氏烟(nicotiana benthamiana)
40.2供试毒源
41.tmv表达载体p35s
‑
30b:gfp农杆菌(p35s
‑
30b：gfp质粒导入农杆菌eha105后得到。参考文献为贾洪革，庞永奇，方荣祥.农杆菌接种法作为一种简便的植物病毒载体的侵染方法；英文：[j].acta botanica sinica,2003(07):770
‑
773)，由中国科学院微生物所馈赠。.
[0042]
3农杆菌液的诱导
[0043]
向50ml培养管中倒入15ml lb液体培养液，再加入15μl卡那霉素(kana+)和15μl利福平(rif)随后向50ml培养管中加入30μl含有tmv表达载体p35s
‑
30b：gfp质粒的农杆菌，摇匀后放入至条件为28℃、200rpm/min的摇床上培养12h。通过高速离心机(4000rpm/min离心5min)使菌悬液中的农杆菌沉淀后，弃上层液体。用mma悬浮液(mma悬浮液配方：10mmol/l mgcl 2
，10mmol/l mes(ph 5.6，100μmol/l as)将菌体配制成od
600
＝1.0的注射液，为保证菌体与mma溶液充分混合，静置3h后可进行后续接种处理。
[0044]
二、五味子果实提取物对烟草花叶病毒(tmv)增殖及运动的抑制效果
[0045]
五味子果实提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0046]
用体积百分含量95％乙醇水溶液28℃浸泡五味子果实24h，得到提取液和残渣，残渣重复3次用体积百分含量95％乙醇水溶液浸泡得到续滤液，然后与提取液合并，得到总的提取液；然后除去总的提取液中的乙醇，即得到五味子果实提取物。
[0047]
接种处理：
[0048]
将五味子果实提取物(200mg/ml、100mg/ml、50mg/ml、5mg/ml)以及200μg/ml宁南霉素水溶液依次喷施在整株烟草上(每株喷施10ml)，6h后，将诱导后含有目的基因质粒的农杆菌对本氏烟进行注射，选取6
‑
8叶期健康植株，注射叶为下部新展开的较大叶片(共3片)，注射方法为：将叶片背面向上，一只手抵住叶片正面，另一只手用针尖划破叶表皮，用不含针头的注射器对准伤口处，均匀力度慢慢讲注射叶推入植株体内(每片叶均匀注射满，约为1ml)，同时放在叶片正面的手顶住伤口处的叶片正面，通过手提式紫外探照灯对植株上绿色荧光情况进行观察，并根据烟草不同部位侵染增殖情况用相机拍照记录结果。
[0049]
1、烟草的注射叶中，五味子果实提取物对tmv的增殖及运动抑制效果
[0050]
注射后第7天，结合7天的观察，注射叶侵染情况，结果如图1所示。
[0051]
由图1中可知，对比健康植株，清水阴性对照处理组中的注射叶已经布满绿色荧光；每片叶均注射1ml农杆菌液；
[0052]
宁南霉素阳性对照(200μg/ml水溶液)处理组开始出现零星斑点；
[0053]
五味子果实提取物(100mg/ml水溶液)处理组产生少量的绿色荧光；
[0054]
五味子果实提取物(50mg/ml水溶液)处理组中注射叶的绿色荧光数量多于五味子果实提取物(100mg/ml水溶液)处理组；
[0055]
五味子果实提取物(5mg/ml)此时产生大量绿色荧光标记。
[0056]
由图1中结果可知，在注射叶部位，说明50～100mg/ml浓度下的五味子果实提取物具有一定控制tmv在注射叶中增殖的效果，且浓度越高效果越显著。
[0057]
更高浓度的处理(200mg/ml)喷施(10ml/株)后，植株出现萎蔫，甚至死亡的现象(前期实验证明)，五味子果实提取物本身含有特殊的刺激性香味，但过高浓度，提取物中的刺激性物质可能对烟草具有一定的损失，固浓度缩减至五味子果实提取物(100mg/ml)时无此类影响。
[0058]
2、烟草茎中，五味子果实提取物对tmv的增殖及运动的抑制效果
[0059]
如图2所示，步骤三使用静置后的mma悬浮液(od
600
＝1.0)注射烟草后第7天，清水阴性对照处理组ck的绿色荧光已经侵染整个烟草的茎，烟草花叶病毒从注射叶开始侵染，随着时间逐步向生长势优的位置移动，直至布满整个植株。
[0060]
宁南霉素阳性对照组(200μg/ml)在喷施过后，对烟草花叶病毒产生明显的抑制作用；只有注射叶的茎部含有一些块状荧光，说明tmv增殖与运动受到了宁南霉素的抑制，移动缓慢。
[0061]
五味子果实提取物(100mg/ml)处理组中烟草花叶病毒的侵染与阴性对照组相比，侵染只进行到主茎及注射叶的侧茎，而上部仍有一些侧茎没有绿色荧光，从植株中茎的部位说明五味子果实提取物在对tmv侵染及运动中起到了一定的作用，进一步印证，五味子果实提取物对烟草抗tmv具有一定的诱导抗性。
[0062]
3、烟草新生叶(上部新展开的大小均一的嫩小叶片，6
‑
8叶期)中，五味子果实提取物对tmv的增殖及运动的抑制效果
[0063]
如图3和4中结果所示，接种处理后第8天，清水阴性对照处理中，新生叶已产生大量的绿色荧光，但未达到布满整片新生叶。
[0064]
宁南霉素处理组(200μg/ml)中新生叶仅有微弱的绿色荧光。
[0065]
五味子果实提取物(100mg/ml)中新生叶仅有少量绿色荧光产生，可以说明其效果虽然不及宁南霉素处理组(200μg/ml)，但其抑制烟草花叶病毒的能力还是很显著的。
[0066]
五味子果实提取物(50mg/ml)新生叶中有一定量的绿色荧光斑点，但远少于阴性对照组(阴性对照为清水处理后接种的处理组)浓度下，新生叶绿色荧光数量较多，与阴性对照组相比，相差不多，可以看出，此时的浓度已经没有诱导烟草抗tmv抗性的效果。
[0067]
4、qrt
‑
pcr检测五味子果实提取物处理对烟草叶片中tmv
‑
cp基因表达的影响
[0068]
tmv主要是由rna以及外壳蛋白(cp)两部分组成的。tmv外壳蛋白不仅可以保护病毒的核酸物质不被降解，还能帮助tmv进行远距离的运动，因此可以使用五味子果实提取物抑制烟草植株中tmv
‑
cp基因的表达程度来恒定其对tmv增殖抑制效果的一个重要指标。
[0069]
五味子果实提取物能诱导烟草产生对tmv抗性的能力，从紫外灯下观察表明，五味子果实提取物处理后绿色荧光蛋白的数量与对照组相比确有减少，为证实绿色荧光蛋白标记技术观察结果的准确性采用qrt
‑
pcr方法分别测定了五味子果实提取物处理的烟草与对照烟草新叶中cp基因表达水平。经荧光定量pcr结果进行数据分析，计算病毒相对基因表达量，并计算出tmv病毒抑制率(cp基因及内参基因引物序列见表1)。
[0070]
表1引物序列
[0071][0072]
通过使用thunderbirdtm sybr qpcr mix(toyobo，qps
‑
201)以及特异性引物进行实时荧光定量pcr扩增，反应体系如下表2所示。
[0073]
表2qrt
‑
pcr体系建立
[0074][0075]
在bio
‑
rad cfx96系统上进行实时荧光定量pcr，热循环程序，45个循环如下：95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s。
[0076]
本试验在bio
‑
rad cfx9软件上进行分析，通过检测其荧光值，绘制烙点曲线。将目的基因的ct值控制在20～35的合理范围内。结果采用2
‑△△
ct
法计算基因相对表达量。每组处理进行了三次生物学重复。
[0077]
阳性对照宁南霉素(200μg/ml)抑制效果最好，抑制率可高达97.43％，五味子果实提取物(100mg/ml)、五味子果实提取物(50mg/ml)、五味子果实提取物(25mg/ml)三组处理随着浓度的降低抑制率也在随之下降，抑制率分别为66.19％、55.44％、16.96％。上述结果说明五味子果实提取物处理能抑制烟草叶片中tmv
‑
cp基因表达。
[0078]
5、western blot检测五味子果实提取物对烟草中tmv
‑
gfp表达情况
[0079]
为了印证qrt
‑
pcr试验结果符合绿色荧光蛋白观察结果，采用western
‑
blot法检测接种7d后(按照“二、五味子果实提取物对烟草花叶病毒(tmv)增殖及运动的抑制效果”中接种处理方法进行接种)的处理与对照烟草植株新生叶中gfp基因表达水平。
[0080]
取各处理组新生叶叶片，用液氮冷冻研磨至粉末，取1g叶片粉末加入0.2ml2
×
loading buffer(北京全式金生物技术有限公司，货号dl101
‑
02),放入沸水中煮5min，10000g/min离心10min，收集上清液。然后进行sds
‑
page电泳，电泳完成后，取出胶体，依据萨姆布鲁克等人的方法进行western blot实验。将sds
‑
page电泳后的凝胶、滤纸和pvdf膜放置在转移缓冲液中30min作为预处理，其中pvdf膜应先在甲醇溶液里浸泡10s后再放进转移缓冲液里；负极在下，正极在上的顺序，依次整齐码放海绵夹板、2层滤纸、分离胶、pvdf膜，注意将pvdf膜下方的气泡用赶出，随后再继续码放2层滤纸、海绵夹板。接通电源，60v条件下转移60min，取出pvdf膜，放入至含有5％脱脂奶粉(bsa)的封闭液中常温下孵育1h，随后使用tbst洗脱液进行3次洗膜，每次8
‑
10min。将膜拿出后放入含有gfp一抗(北京全式金生物技术有限公司，货号：ht801
‑
01，稀释5000倍)的5％bsa溶液中，常温下平摇孵育1h，回收1抗，将膜放在tbsa中洗脱三次，每次8
‑
10min，取出膜加入含有mouse anti goat二抗(北
京全式金生物技术有限公司，货号：hs201
‑
01，稀释10000倍)的5％bsa溶液中，常温下平摇孵育1h，随后用tbst溶液进行8
‑
10min洗膜共计三次。将膜放置在夹板中，用2ml显色液(显影液a与b1:1)均匀涂抹，避光打开后放上胶片，闭合轻压20s
‑
60s左右，放入显影液显影后再放入定影液进行定影处理，最终放入水中，在凝胶成像仪上记录数据。
[0081]
如图5中结果表明，a表示健康植株中并没有印记，说明未检测到gfp蛋白表达；(选取gfp抗血清作为一抗、mouse anti goat作为二抗)b表示阴性对照中检测出大量gfp蛋白的表达；c表示宁南霉素(200μg/ml)处理组中蛋白印记很浅，说明检测极少量gfp蛋白表达；d和e分别表示五味子果实提取物(100mg/ml)与五味子果实提取物(25mg/ml)处理组，均检测到gfp蛋白表达，并随浓度的增加而减少，与试验结果相符。上述结果说明本发明五味子果实提取物能抑制对烟草中tmv
‑
gfp表达。