百里酚在防治花生白绢病方面的应用

1.本发明属于白绢病防治技术领域，具体涉及一种百里酚在防治花生白绢病方面的应用。


背景技术：

2.百里酚，又名百里香酚、麝香草酚，天然存在于植物牛至（origanum vulgare）和百里香（hymus mongolicus）中，也是牛至精油、百里香精油的主要活性成分。起初，胡瑛等研究发现百里酚与壳聚糖复配对金黄色葡萄球菌等6种细菌均具有较好的抑菌活性。之后，关于百里酚的研究在动物饲料、医学、食品等领域也越来越多。庄英帜等研究表明，百里酚能抑制肝癌bel
‑
7402细胞生长。王思宇等研究发现，在饲料中添加百里酚和香芹酚可改善断奶仔猪的肠道微生物区系，促进肠道健康并促进仔猪生长。在植物保护领域，张静、路露等研究发现，百里酚对烟粉虱、秀丽线虫具有较好的杀虫活性。但百里酚在植物病原真菌方面的研究较少。目前，尚未见百里酚对花生白绢病菌生物活性和防治效果的研究报道。
3.花生白绢病是由齐整小核菌（sclerotium rolfsii）侵染引起的真菌性土传病害。该病原菌寄主广泛，可侵染谷类、薯类、豆类等500多种植物。目前，白绢病已成为制约我国花生产量和品质的重要因素。花生白绢病多在花生成株期发生，病菌主要从植株茎基部侵入，菌丝可沿茎杆向上、向下扩展，最终导致植株茎部、果针、根部和荚果均可受害。受害初期叶片萎蔫，近地面和茎基部覆盖有白色绢丝状菌丝，拔出后根部和荚果上也附着有白色菌丝；后期整株枯死，根茎部和荚果变褐腐烂，甚至种仁也会变色，呈湿腐状腐烂。后期菌丝开始聚集形成菌核，初期为白色小颗粒，后逐渐增大变成黄褐色，最后变成油菜籽状黑褐色或茶褐色的坚硬菌核，随后这些菌核会随着浇灌、雨水或一些农事操作等方式进行传播，进而加大病情。目前，在我国河南、山东、安徽、辽宁、江西省等花生种植区均有花生白绢病爆发成灾的报道，一般发病率为10%
‑
40%，可造成花生20%
‑
30%产量损失，严重时可减产50%以上。2020年，河南省农业农村厅将花生白绢病列为河南省二类病虫害名录。由于国内外对花生白绢病的研究较少，缺乏抗病品种，深耕土地、合理轮作等农业措施因其寄主广泛和菌核存活时间长而防控作用有限。目前，防治花生白绢病主要依靠化学杀菌剂。但是，中国农药信息网上登记防治花生白绢病的化学杀菌剂品种有限，并且化学杀菌剂的长期使用不仅使有害生物产生抗药性，还会造成农药残留超标、环境污染以及危害人类健康等问题。因此，急需寻找安全、高效、无公害的新药剂。
4.在新农药创制周期长、成本高等的背景下，人们开始从天然产物中寻找高活性的化合物，并且以天然产物为先导化合物进行结构优化和改造可开发出更为高效的农药品种，如金色链霉菌产生的代谢产物
‑
多抗霉素对白绢病具有较好的防治效果，并在我国已进行了农药登记。此外，来源于植物体内的丁香酚、大蒜素、苦参碱等杀菌物质均已登记防治多种植物病害。本研究发现，百里酚以及含其的植物精油对花生白绢病菌具有很强的抑制活性，且对花生白绢病防治效果良好，具有巨大的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种百里酚在防治花生白绢病应用方面的新用途，经试验验证：百里酚能有效防治花生白绢病，且防治效果较佳。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种百里酚在防治花生白绢病方面应用的新用途。
7.上述的应用，可以是含百里酚的植物精油在防治花生白绢病方面的应用。
8.进一步的，百里酚天然存在于牛至、百里香等植株中，也是牛至精油、百里香精油的主要活性成分。因此，所述植物精油可以为牛至精油或百里香精油等。
9.本发明提供了一种百里酚或含百里酚的植物精油与本领域常规辅料复配制备成的混合药剂。所述的混合药剂可以为悬浮剂、水分散粒剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水乳剂、乳油或微胶囊剂等。
10.牛至精油是从唇形科牛至属多年生半灌木或草本植物牛至（origanum vulgare）中提取的挥发油，是农业部批准使用的饲料添加剂。起初，关于牛至精油的研究多集中于动物营养与饲料领域。顾仁勇等研究发现牛至精油不仅对霉菌、酵母菌有较好的抑菌作用，而且还具有一定抗氧化作用。之后，在中医药、食品、果蔬采后管理领域，对牛至精油的抑菌作用及药理活性的研究逐渐增多。林清华等研究表明，牛至精油有增强机体免疫力和解热镇痛等作用。另外，牛至精油也可作为一种食品保鲜剂。张瑞等综述了牛至精油在果蔬、肉制品、蛋奶等食品保鲜中的应用。牛至精油不仅对黄曲霉菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等具有较好的抑菌作用，还可替代化学杀菌剂用于果蔬采后的管理。但关于牛至精油对植物病原真菌生物活性的研究还相对有限。目前未见牛至精油对花生白绢病菌生物活性得研究报道。
11.和现有技术相比，本发明具有如下优异的效果：1）本发明经试验发现：百里酚对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着百里酚浓度的升高，其抑制活性增强，ec
50
值为83.3 mg/l，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（ec
50
值为204.7 mg/l）。百里酚对花生白绢病菌的菌核萌发也有较好的抑制作用，在100 mg/l处理浓度下，百里酚对菌核萌发的抑制率为76.67%；当百里酚浓度升高至150 mg/l及以上浓度时，其对菌核萌发的抑制率均高达100%。百里酚对花生白绢病有很好的治疗效果，其在1000 mg/l剂量下的防效（62.54%）显著高于对照药剂多抗霉素在1000mg/l剂量下的防效（42.9%），这表明了百里酚在花生白绢病防治上有很大的应用前景；2）本发明经试验发现：在1000 mg/l和500 mg/l的处理浓度下，牛至精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率均高达100%，均明显优于对照药剂多抗霉素（64.9%和61.7%）。牛至精油对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着精油浓度的升高，其抑制活性增强，ec
50
值为118.5 mg/l，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（ec
50
值为204.7 mg/l）。牛至精油对花生白绢病菌的菌核萌发也有较好的抑制作用，在250 mg/l处理浓度下，牛至精油对菌核萌发的抑制率为85%；当精油浓度升高至300 mg/l浓度时，其对菌核萌发的抑制率高达100%。牛至精油对花生白绢病具有良好的防治效果，1000 mg/l牛至精油对花生白绢病的防治效果为50.76%，与对照药剂多抗霉素在1000 mg/l剂量下的防效（42.9%）相当。
附图说明
12.图1 为不同浓度牛至精油对花生白绢病防治效果图片。从三张图可知，在对照处理中，白绢病已经导致了花生植株的死亡。虽然白绢病也对牛至精油处理的花生植株的根系造成了一定的破坏，但是并没有导致植株出现大量死亡。由于牛至精油已经抑制病原菌在植株上的扩展，受到病原菌危害的菌株后期可再恢复正常生长，从而降低了产量损失，且这种防治效果与牛至精油浓度成正相关性。
具体实施方式
13.以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
14.下述实施例中，所用百里酚为普通市售产品，牛至精油为购买自江西雪松天然药用油有限公司生产的牛至油，外观为浅黄色至棕红色油状液体，有百里香所有的辛辣芳香气味，主要成分香芹酚≥88%，百里香酚≥2.0 %。
15.试验方法与结果1. 百里酚对花生白绢病菌菌丝生长的毒力采用抑制菌丝生长速率法测定。取百里酚0.03 g 溶于0.4 ml dmso和吐温
‑
80中，加入19.57 ml 无菌水定容至20ml，并配置成1500 mg/l的母液，其中dmso和吐温
‑
80的体积比均为1%；再用无菌水梯度稀释成1300、1100、900、450、225 mg/l共5个系列浓度的药液。分别取1 ml不同浓度的药液加入到9 ml pda培养基中，制成终浓度为150、130、110、90、45、22.5 mg/l共6种含药培养基，对照药剂多抗霉素的最终浓度为6000、1000、500、100、50、10mg/l，以含0.1% dmso和0.1% 吐温
‑
80的无药培养基为对照，每个浓度重复三次。于25℃光照培养箱中黑暗培养，3 d后用十字交叉法测定菌落直径。计算百里酚和多抗霉素对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率，并根据机率值分析法求得毒力回归方程和有效中浓度（ec
50
）以及抑制率高达90%的浓度（ec
90
）。
[0016] 菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径
‑
菌饼直径）
‑
（处理菌落直径
‑
菌饼直径）]/（对照菌落直径
‑
菌饼直径）
×
100。结果见表1。
[0017]
表1 百里酚对花生白绢病菌菌丝的毒力由表1可知，百里酚对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着百里酚浓度的升高，其抑制活性增强，ec
50
值为83.3 mg/l，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（ec
50
值为204.7 mg/l）。
[0018]
百里酚对花生白绢病菌菌核萌发的抑制作用取百里酚0.06 g 溶于1 ml dmso和吐温
‑
80中，加入18.94 ml 无菌水定容至20 ml并配置成3000 mg/l的母液备用，其中dmso和吐温
‑
80的体积比分别为3%和2%。之后再梯度稀释成2500、2000、1500、1000、500 mg/l 5个系列浓度的药液。分别取1 ml药液加入到9 ml pda培养基中，制成终浓度为300、250、200、150、100、50 mg/l 6个系列含药培养基。分别
选取形状相同、大小一致的菌核，放于含药培养基上，每个处理放20个菌核，以含0.3% dmso和0.2% 吐温
‑
80的无药培养基为对照，每个浓度重复三次。在含药培养基上培养2 d后，观察菌核的萌发情况，当菌核产生的菌丝 ≥ 2 mm 时为萌发。菌核萌发抑制率=（对照菌核萌发数量
‑
处理菌核萌发数量）/（对照菌核萌发数量）
×
100。结果见表2。
[0019]
表2 百里酚对花生白绢病菌菌核萌发的抑制作用表2的结果表明：百里酚对花生白绢病菌的菌核萌发也有较好的抑制作用。在100 mg/l处理浓度下，百里酚对菌核萌发的抑制率为76.67%；当百里酚浓度升高至150 mg/l及以上浓度时，其对菌核萌发的抑制率均高达100%。
[0020]
百里酚对花生白绢病的盆栽防治效果采用喷淋法测试百里酚对花生白绢病的盆栽防治效果。
[0021]
试验花生品种为豫花9326，选取颗粒饱满大小一致的花生种子置于盆中，加入无菌水淹没种子的三分之一，并放于培养箱中浸种半天。将基质土与蛭石以3:1的体积比例混合，用无菌水调整土壤持水量70%后置于盆钵中，将发芽的种子胚根朝下播种。
[0022]
人工接种病菌：待播种一周后，选取健康、长势、大小一致的花生植株，每株在茎基部接种1个菌饼，并用土掩埋。当观察到花生植株和土壤上出现白色菌丝后，分别以500、1000 mg/l百里酚和1000 mg/l多抗霉素药液喷淋花生植株根茎部和周围土壤，每株喷药液10 ml。以含0.1% dmso和0.1% 吐温
‑
80的无菌水作为对照。每个处理15株，重复三次。施药3 d后，按照以下分级标准鉴定病情：0级：无病斑；1级：病斑小于1/3根茎部；3级：病斑大于2/3根茎部，地面有少量菌丝；5级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝；7级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝，且地上部分出现萎蔫；9级：植株枯死。
[0023]
根据病情指数=∑（各级病株
×
相对级数值）/（总株数
×
9）
×
100、防治效果（%）= （对照处理病情指数
‑
药剂处理病情指数）/对照处理病情指数
×
100，计算不同处理的病情指数和防效。结果见表3。
[0024]
表3 百里酚对花生白绢病的盆栽防效注：表中数据为平均值
ꢀ±ꢀ
标准误差。同列的不同字母表示经最小显著差异法检
验在 p < 0.05 水平差异显著。
[0025]
由上表3可知，百里酚对花生白绢病有很好的治疗效果，其在1000 mg/l剂量下的防效（62.54%）显著高于对照药剂多抗霉素在1000 mg/l剂量下的防效（42.9%），这表明百里酚在花生白绢病防治上有很大的应用前景。
[0026]
牛至精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制作用采用抑制菌丝生长速率法测定牛至精油对白绢病菌菌丝生长的抑制活性。取牛至精油0.1 g 溶于0.2 ml dmso和吐温
‑
80中，加入9.7 ml无菌水定容至10 ml，配置成10000 mg/l的母液，其中dmso和吐温
‑
80的体积比均为1%。然后用无菌水稀释成5000 mg/l的药液。分别取1 ml两种不同浓度的药液加到9 ml pda培养基中，制成终浓度分别为1000 mg/l和500 mg/l的含药培养基。对照药剂多抗霉素最终浓度为1000 mg/l和500 mg/l。以含0.1% dmso和0.1% 吐温
‑
80的无药培养基为对照，每浓度重复三次。于25℃光照培养箱中黑暗培养，3 d后用十字交叉法测定菌落直径。按照菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径
‑
菌饼直径）
‑
（处理菌落直径
‑
菌饼直径）]/（对照菌落直径
‑
菌饼直径）
×
100，计算牛至精油的抑制率。结果见表4。
[0027]
表4 不同浓度牛至精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率由表4可以看出，在1000 mg/l和500 mg/l的处理浓度下，牛至精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率均高达100%，均明显优于对照药剂多抗霉素（64.9%和61.7%）。
[0028]
牛至精油对花生白绢病菌菌丝生长的毒力采用抑制菌丝生长速率法测定。取牛至精油0.1 g 溶于0.4 ml dmso和吐温
‑
80中，加入19.5 ml 无菌水定容至20ml，并配置成5000 mg/l的母液，其中dmso和吐温
‑
80的体积比均为1%。再用无菌水梯度稀释成2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 mg/l共6个系列浓度的药液。分别取1 ml不同浓度的药液加入到9 ml pda培养基中，制成终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 mg/l共7种含药培养基，对照药剂多抗霉素的最终浓度为6000、1000、500、100、50、10mg/l，以含0.1% dmso和0.1% 吐温
‑
80的无药培养基为对照，每个浓度重复三次。于25℃光照培养箱中黑暗培养，3 d后用十字交叉法测定菌落直径。计算百里酚和多抗霉素对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率，并根据机率值分析法求得毒力回归方程和有效中浓度（ec
50
）以及抑制率高达90%的浓度（ec
90
）。菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径
‑
菌饼直径）
‑
（处理菌落直径
‑
菌饼直径）]/（对照菌落直径
‑
菌饼直径）
×
100。结果见表5。
[0029]
表5 牛至精油对花生白绢病菌菌丝的毒力由表5可知，牛至精油对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着精油
浓度的升高，其抑制活性增强，ec
50
值为118.5 mg/l，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（ec
50
值为204.7 mg/l）。
[0030]
牛至精油对花生白绢病菌菌核萌发的抑制作用取牛至精油0.1 g 溶于1 ml dmso和吐温
‑
80中，加入18.9 ml 无菌水定容至20 ml并配置成5000 mg/l的母液备用，其中dmso和吐温
‑
80的体积比分别为3%和2%。之后再梯度稀释成3000、2500、2000、1500、1000、500 mg/l 6个系列浓度的药液。分别取1 ml药液加入到9 ml pda培养基中，制成终浓度为300、250、200、150、100、50 mg/l 6个系列含药培养基。分别选取形状相同、大小一致的菌核，放于含药培养基上，每个处理放20个菌核，以含0.3% dmso和0.2% 吐温
‑
80的无药培养基为对照，每个浓度重复三次。在含药培养基上2 d后，观察菌核的萌发情况，当菌核产生的菌丝 ≥ 2 mm 时为萌发。菌核萌发抑制率=（对照菌核萌发数量
‑
处理菌核萌发数量）/（对照菌核萌发数量）
×
100。结果见表6。
[0031]
表6 牛至精油对花生白绢病菌菌核萌发的抑制作用表6结果表明，牛至精油对花生白绢病菌的菌核萌发也有较好的抑制作用。在250 mg/l处理浓度下，牛至精油对菌核萌发的抑制率为85%；当精油浓度升高至300 mg/l浓度时，可完全抑制菌核的萌发。
[0032]
牛至精油对花生白绢病的盆栽防治效果试验花生品种为豫花9326，选取颗粒饱满大小一致的花生种子置于盆中，加入无菌水淹没种子的三分之一，并放于培养箱中浸种半天。然后将基质土与蛭石以3:1的体积比例混合，加入无菌水调整土壤到70%的湿度后置于盆钵中，将发芽的种子胚根朝下播种。
[0033]
人工接种病菌：待播种一周后，选取健康、长势、大小一致的植株，每株在茎基部接种1个菌饼，并用土掩埋。当观察到花生植株和土壤上出现白色菌丝后，分别以500、1000 mg/l牛至精油和1000 mg/l多抗霉素均匀喷淋植株根茎部和周围土壤，每株喷药液10 ml。以含0.1% dmso和0.1% 吐温
‑
80的无菌水作为对照。每个处理15株植株，重复三次。施药后3 d，按照以下分级标准鉴定病情：0级：无病斑；1级：病斑小于1/3根茎部；3级：病斑大于2/3根茎部，地面有少量菌丝；5级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝；7级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝，且地上部分出现萎蔫；9级：植株枯死。
[0034]
根据病情指数=∑（各级病株
×
相对级数值）/（总株数
×
9）
×
100、防治效果（%）= （对照处理病情指数
‑
药剂处理病情指数）/对照处理病情指数
×
100，计算不同处理的病情指数和防效。结果见表7和图1。
[0035]
表7 牛至精油对花生白绢病的防治效果
注：表中数据为平均值
±
标准误差。同列的不同字母表示经最小显著差异法检验在p< 0.05水平差异显著。
[0036]
由表7、图1可以看出，牛至精油对花生白绢病具有良好的防治效果。1000 mg/l牛至精油对花生白绢病的防治效果为50.76%，与对照药剂多抗霉素在1000 mg/l剂量下的防效（42.9%）相当。