兰科植物组培材料无菌处理方法与流程

1.本发明涉及植物组培技术领域，特别是涉及兰科植物组培材料无菌处理方法。


背景技术：

2.兰科是单子叶植物中的第一大科，有悠久的栽培历史和众多的品种，自然界中尚有许多有观赏价值的野生兰花有待开发、保护和利用，植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术，植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术，狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物；
3.组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，于含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程，组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性，即植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达，产生出完整植株；
4.目前的兰科植物组培材料在处理过程中对花梗清洗时用自来水和小毛刷轻轻刷洗，很可能会使植物体受伤，导致之后无法培养成活，造成浪费，并且对次氯酸钠溶液的使用浓度一般在4
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5％之间，对植物体消杀灭菌时的伤害比较大，导致灭菌后植物体成活率低，对植物体的防护效果不佳；因此，我们提出兰科植物组培材料无菌处理方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供兰科植物组培材料无菌处理方法，以解决上述背景中提出的问题。
6.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
7.本发明为兰科植物组培材料无菌处理方法，所述无菌处理方法，包括以下步骤：
8.step1：提前一周计算需切割点数量，按每个点用一个瓶子做好营养液，并提前一天准备好121℃高温灭菌纯净水适量；
9.step2：按照每段花梗中间部位留一个芽点剪取有用花梗，带入实验室；
10.step3：配制适量浓度为3％的次氯酸钠溶液，加入几滴吐温20，轻轻摇匀(现用现配，不可久置)，准备好适量70％酒精溶液；
11.step4：将剪好带芽点的花梗放入带旋钮盖的消毒瓶中；
12.step5：瓶中倒入适量15
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20℃左右的自来水，并加一滴洗洁精，盖好瓶盖不停晃动冲洗花梗5
‑
10min，用清水冲净泡沫，沥干水分；
13.step6：将70％酒精溶液倒入装有花梗的瓶中，溶液需没过所有花梗并高出5mm以上，盖好瓶盖进行1
‑
2min晃动消毒；
14.step7：沥干酒精溶液，加入配置好的带有吐温20的3％次氯酸钠溶液(溶液量可稍多于酒精溶液)，进行15
‑
20min晃动消毒；
15.step8：小心沥干次氯酸钠消毒液，注意尽量避免将花梗倒出污染；
16.step9：倒入高温灭菌纯净水适量，盖好盖子充分晃动，洗净残留的次氯酸钠溶液，重复3
‑
4遍；
17.step10：将所有不再需要的器具小心地拿出工作台，用酒精清理台面，确认准备好对应的瓶装营养液，开始进行切割装瓶；
18.step11：小心切除花梗两端消毒漂白了的部位，芽点朝上，斜插入营养液中，尽量插在靠近瓶壁的部位，以便进行观察；
19.step12：做到每次尽量少取几根花梗到切割垫板上(3
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4根)，每切一根梗需换一下位置，不可重复在一个位置切割，每切3
‑
4根花梗换一把刀和切割垫板，尽量避免现交叉感染现象；
20.step13：做好标签，完成兰科植物组培材料的无菌处理。
21.优选地，所述step2中进入实验室前的花梗不允许做低温保存处理(不低于15℃)，否则会导致芽点死亡。
22.优选地，所述step4中花梗每瓶数量不超过15支，切记不要放混，每瓶做好植物编号标记。
23.优选地，所述step6中操作前准备好手术刀及镊子并打开高温消毒器开始消毒工作，工作台中放好消毒过的工作纸盒，高温灭菌锅的纯净水，工作台旁准备好倒废水的容器，准备几块干净毛巾。
24.优选地，所述step6和step7操作时瓶盖不要盖太紧，故意让少许溶液在晃动过程中流出，用以消毒瓶盖与瓶口位置。
25.优选地，所述step9中消毒好的花梗须放在工作状态的超净工作台中，不得拿到超精工作台外面或关闭工作台，以免再次污染。
26.优选地，所述step13中工作中须精力集中，做好标签以免最后忘记或弄混植物造成损失。
27.优选地，所述step6
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step13中进入超净工作台进行，即所有需要放入超净工作台的工具及容器需内外表面先用酒精消毒，所有动作都必须轻柔，以免破坏工作台风向而引起污染。
28.本发明具有以下有益效果：
29.一、本发明兰科植物组培材料无菌处理方法，通过在瓶中倒入适量15
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20℃左右的自来水，并加一滴洗洁精，用洗洁精溶液清洁，可以避免接触植物体，并利用洗洁精自身的去油污功效，将植物体在自然界中无论是自身产生的保护蜡油还是被污染的油污溶解掉95％以上。
30.二、本发明兰科植物组培材料无菌处理方法，通过配制适量浓度为3％的次氯酸钠溶液，降低对植物体消杀灭菌时的伤害，增加灭菌后植物体成活率，从而减少浪费。
31.三、本发明兰科植物组培材料无菌处理方法，通过加入几滴吐温20，轻轻摇匀，由于次氯酸钠的消杀灭菌作用非常犀利，很可能会直接杀死植物体幼嫩部位，导致消毒灭菌后成活率低，而吐温20是一种表面活性剂，也就是稳定剂，能将次氯酸钠犀利的消杀作用减
缓，以便保护植物重要细胞的活性。
32.四、本发明兰科植物组培材料无菌处理方法，操作简便，安全性高，适应性强，具备很高的推广价值。
33.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1为本发明的兰科植物组培材料无菌处理方法的操作方法流程图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
37.请参阅图1所示：本发明为兰科植物组培材料无菌处理方法，无菌处理方法，包括以下步骤：
38.step1：提前一周计算需切割点数量，按每个点用一个瓶子做好营养液，并提前一天准备好121℃高温灭菌纯净水适量；
39.step2：按照每段花梗中间部位留一个芽点剪取有用花梗，带入实验室；
40.step3：配制适量浓度为3％的次氯酸钠溶液，加入几滴吐温20，轻轻摇匀(现用现配，不可久置)，准备好适量70％酒精溶液；
41.step4：将剪好带芽点的花梗放入带旋钮盖的消毒瓶中；
42.step5：瓶中倒入适量15
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20℃左右的自来水，并加一滴洗洁精，盖好瓶盖不停晃动冲洗花梗5
‑
10min，用清水冲净泡沫，沥干水分；
43.以下步骤需进入超净工作台进行(所有需要放入超净工作台的工具及容器需内外表面先用酒精消毒)，所有动作都必须轻柔，以免破坏工作台风向而引起污染；
44.step6：将70％酒精溶液倒入装有花梗的瓶中，溶液需没过所有花梗并高出5mm以上，盖好瓶盖进行1
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2min晃动消毒；
45.step7：沥干酒精溶液，加入配置好的带有吐温20的3％次氯酸钠溶液(溶液量可稍多于酒精溶液)，进行15
‑
20min晃动消毒；
46.step8：小心沥干次氯酸钠消毒液，注意尽量避免将花梗倒出污染；
47.step9：倒入高温灭菌纯净水适量，盖好盖子充分晃动，洗净残留的次氯酸钠溶液，重复3
‑
4遍；
48.step10：将所有不再需要的器具小心地拿出工作台，用酒精清理台面，确认准备好对应的瓶装营养液，开始进行切割装瓶；
49.step11：小心切除花梗两端消毒漂白了的部位，芽点朝上，斜插入营养液中，尽量
插在靠近瓶壁的部位，以便进行观察；
50.step12：做到每次尽量少取几根花梗到切割垫板上(3
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4根)，每切一根梗需换一下位置，不可重复在一个位置切割，每切3
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4根花梗换一把刀和切割垫板，尽量避免现交叉感染现象；
51.step13：做好标签，完成兰科植物组培材料的无菌处理。
52.其中，step2中进入实验室前的花梗不允许做低温保存处理(不低于15℃)，否则会导致芽点死亡。
53.其中，step4中花梗每瓶数量不超过15支，切记不要放混，每瓶做好植物编号标记。
54.其中，step6中操作前准备好手术刀及镊子并打开高温消毒器开始消毒工作，工作台中放好消毒过的工作纸盒，高温灭菌锅的纯净水，工作台旁准备好倒废水的容器，准备几块干净毛巾。
55.其中，step6和step7操作时瓶盖不要盖太紧，故意让少许溶液在晃动过程中流出，用以消毒瓶盖与瓶口位置。
56.其中，step9中消毒好的花梗须放在工作状态的超净工作台中，不得拿到超精工作台外面或关闭工作台，以免再次污染，这时所有病菌和细菌都被消灭了，但芽点是活的，每根花梗的两端都洗白了，是需要后面在消毒过的切割垫板上切除掉的。
57.其中，step13中工作中须精力集中，做好标签以免最后忘记或弄混植物造成损失，随切随记录是良好的工作习惯，既避免了之后可能出现的错误，也可以及时休息手指，让工作轻松愉快。
58.其中，step6
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step13中进入超净工作台进行，即所有需要放入超净工作台的工具及容器需内外表面先用酒精消毒，所有动作都必须轻柔，以免因破坏工作台风向而引起污染。
59.本方案中，step5改进前不是用洗洁精初级清理消毒灭菌植物体，而是用自来水和小毛刷轻轻刷洗，缺点是用毛刷刷洗很可能会使植物体受伤，导致之后无法培养成活，造成浪费，而用洗洁精溶液清洁，可以避免接触植物体，并利用洗洁精自身的去油污功效，将植物体在自然界中无论是自身产生的保护蜡油还是被污染的油污溶解掉95％以上；改进前step3次氯酸钠溶液的浓度一般在4
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5％之间，对植物体消杀灭菌时的伤害比较大，导致灭菌后植物体成活率低，造成浪费，改进后通过配制适量浓度为3％的次氯酸钠溶液，降低对植物体消杀灭菌时的伤害，增加灭菌后植物体成活率，从而减少浪费；改进前step3没有加入吐温20，由于次氯酸钠的消杀灭菌作用非常犀利，很可能会直接杀死植物体幼嫩部位，导致消毒灭菌后成活率低，通过加入吐温20，其是一种表面活性剂，也就是稳定剂，能将次氯酸钠犀利的消杀作用减缓，以便保护植物重要细胞的活性。
60.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
61.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，
可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。