一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法。


背景技术：

2.植物组织培养的材料几乎包括了植物体的各个部位，如嫩芽、叶、子叶、茎段、鳞茎、花瓣和花药等。嫩芽不仅生长速度快，繁殖率高，不容易发生变异，而且是获得脱毒苗木的有效途径。因此，嫩芽是植物组织培养中常用的外植体。然而，若从野外直接采集嫩芽作外植体进行组培操作时，往往会遇到以下几个突出问题：(1)植物抽芽时间较短，从野外采集嫩芽极易错过最佳取样时间；(2)野外采集的嫩芽长时间运输后活性下降，组培效果不理想；(3)野外采集的嫩芽只能用一次，一旦不成功，又要再次采集，工作量大；(4)野外采集的嫩芽里内生菌较多，消毒困难，污染率高。
3.污染是植物组培过程中经常出现的问题，植物组织一旦污染，势必导致组培的失败。污染途径可分为外植体引入和非外植体引入。外植体引入的主要原因是外植体表面消毒不彻底或外植体内生菌较多；而非外植体引入主要原因有：接种室或超净工作台不清洁、接种工具带菌或接种人员操作不规范等。
4.植物内生菌是指能够进入活体植物组织内或细胞间,但不引起植物组织明显变化的微生物。内生菌普遍存在于野外生长的植物组织中,且难以用常规方法彻底清除，所以，利用植物组织进行离体培养时,通常会遇到内生菌引起的污染。
5.目前，从野外采集枝条，在室内人工诱导不含内生菌的嫩芽方法尚无报道,因此亟待开发一种批量获得不含内生菌嫩芽的诱导方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法简单易操作，节省时间和成本，并且提高了出芽数量和质量，生产出不含内生菌的嫩芽，为蓝果树组织培养提供大量外植体。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法，包括以下步骤：
9.(1)选取两年生以上植物枝条，洗净晾干；
10.(2)晾干后的植物枝条，底端向下，并将所述植物枝条底端4
‑
6cm浸泡在生长溶液中静置处理1
‑
3h；
11.其中所述生长溶液是将1
‑
萘乙酸(naa)与乙醇按照(0.5
‑
2.5g)：(100
‑
300ml)配比溶解后，用蒸馏水稀释而成；
12.(3)配制培养液，加入氨苄青霉素和庆大霉素溶液，将步骤(2)浸泡后的枝条转入培养液中，光照/黑暗交替密闭培养，获取不含内生菌的嫩芽；
13.其中所述培养液为：1/2ms培养基+8.5
‑
12g/l磷酸二氢钾，ph调至5.8
‑
6.2。
14.优选的是，步骤(1)中，所述植物枝条为早春植物抽芽长叶前选取的越冬休眠枝条。
15.优选的是，步骤(1)中，用清水对所述植物枝条进行清洗干净后，将其放置于背阳通风处摊开晾干30
‑
40min。
16.优选的是，步骤(2)中，所述生长溶液是将1
‑
3g 1
‑
萘乙酸用100
‑
300ml乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容至2.5
‑
5.0l得到。
17.优选的是，将步骤(2)浸泡后的枝条基部浸泡到所述培养液中，于12h光照、温度为23
‑
25℃，12h黑暗、温度为17
‑
19℃的条件下培养，7天后即能获取不含内生菌嫩芽。
18.优选的是，步骤(3)中，培养期间，每24h更换一次所述培养液。
19.优选的是，步骤(3)中，待不含内生菌的嫩芽长到1
‑
2cm，即可将所述嫩芽取下，然后嫩芽所在的植物枝条继续放回所述培养液进行培养，如此反复，每个所述植物枝条可采收4
‑
5批次无菌嫩芽。
20.本发明还提供所述的方法在蓝果树组织培养中的应用，应用于组培诱导蓝果树不含内生菌嫩芽生成中。
21.本发明公开了以下技术效果：
22.本发明以嫩芽为外植体可直接诱导丛生芽的产生，这种途径遗传稳定性好，由于没有经过脱分化和再分化过程，能较好地保持母株的优良特性。另外，相对于现有野外直接采样嫩芽作为外植体进行组培，枝条更有利于运输保存，不易损坏，并且经枝条新诱导出来的嫩芽干净、无菌、数量多、生长一致，随时可以采样，缩短芽离开母体后到实验室组培操作之间的时间。同一根枝条能够采样4
‑
5批次嫩芽，数量多还能避免野外采样错过最佳采样时间的缺陷。本发明公开的用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法，该方法简单易操作，节省时间和成本，并且提高了出芽数量和质量，生产出不含内生菌的嫩芽，为蓝果树组织培养提供大量外植体。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为实施例2蓝果树枝条底部浸泡在生长溶液时状态；
25.图2为实施例2用树枝上的芽培育的幼苗。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括
或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.实施例1
32.一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法，包括以下步骤：
33.1、树枝选择
34.在早春植物抽芽长叶前选取两年生以上的蓝果树枝条，用清水进行清洗。
35.将洗干净枝条放在背阳通风处进行摊开晾干，时间30min。
36.2、配制生长溶液：称0.5gnaa生长素，用100ml乙醇进行溶解，用蒸馏水定容至3.5l，配制成生长溶液。
37.浸泡处理：将已经晾干枝条，底端向下，并将底端4cm浸泡在生长溶液里，静置1h。
38.3、培养液配制：1/2ms培养基+8.5g/l磷酸二氢钾，ph调至5.8，加入氨苄青霉素和庆大霉素溶液，两者终浓度分别为200mg/l和100mg/l。
39.将培养液移到步入室人工气候室内，放到蓝色pvc(聚氯乙烯)筐里。
40.4、把枝条基部浸泡到培养液里，吸收水分和营养，并在pvc筐上覆盖一层透明薄膜。
41.把步入室人工气候室设定为12h光照，光照强度为2000lux(勒克斯)，温度为22℃。另外12h为黑暗，不补光，温度为17℃；每隔24h更换新鲜培养液。
42.5、7天后能在枝条上生长出大量无菌嫩芽。等嫩芽生长到1
‑
2cm，符合组培用芽的需求时，用无菌手术刀轻轻地在芽基把嫩芽部挖出。枝条放回去培养。大概一周后，又有大量新芽冒出来，又可以收获一批新嫩芽。每根枝条能培养二个月左右，总的能采收4到5批次无菌嫩芽。
43.实施例2
44.一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法，包括以下步骤：
45.1、树枝选择
46.在早春植物抽芽长叶前选取两年生以上的蓝果树枝条，用清水对枝条进行清洗。
47.将洗干净枝条放在背阳通风处进行摊开晾干，时间35min。
48.2、配制生长溶液：称1gnaa生长素，用200ml乙醇进行溶解，再用蒸馏水定容至5l，配制成生长溶液。
49.浸泡处理：将已经晾干枝条，底端向下，并将底端5cm浸泡在生长溶液里，静置2h。(浸泡方式详见图1所示)
50.3、培养液配制：1/2ms培养基+10g/l磷酸二氢钾，ph调至5.8，加入氨苄青霉素和庆大霉素溶液，两者终浓度分别为200mg/l和200mg/l。
51.将培养液移到步入室人工气候室内，放到蓝色pvc(聚氯乙烯)筐里。
52.4、把枝条基部浸泡到培养液里，吸收水分和营养，并在pvc筐上覆盖一层透明薄膜。
53.把步入室人工气候室设定为12h光照，光照强度为2000lux(勒克斯)，温度为23℃。另外12h为黑暗，不补光，温度为18℃；每隔24h更换新鲜培养液。
54.5、7天后能在枝条上生长出大量无菌嫩芽。等嫩芽生长到1
‑
2cm，符合组培用芽的需求时，用无菌手术刀轻轻地在芽基把嫩芽部挖出。枝条放回去培养。大概一周后，又有大量新芽冒出来，又可以收获一批新嫩芽。每根枝条能培养二个月左右，总的能采收4到5批次无菌嫩芽。
55.实施例3
56.一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法，包括以下步骤：
57.1、树枝选择
58.在早春植物抽芽长叶前选取两年生以上的蓝果树枝条，用清水进行清洗。
59.将洗干净枝条放在背阳通风处进行摊开晾干，时间40min。
60.2、配制生长溶液：称2gnaa生长素，用250ml乙醇进行溶解，再用蒸馏水定容至5.5l，配制成生长溶液。
61.浸泡处理：将已经晾干的枝条，底端向下，并将底端5.5cm浸泡在生长溶液里，静置2.5h。
62.3、培养液配制：1/2ms培养基+11g/l磷酸二氢钾，ph调至5.8，加入氨苄青霉素和庆大霉素溶液，两者终浓度分别为100mg/l和100mg/l。
63.将培养液移到步入室人工气候室内，放到蓝色pvc(聚氯乙烯)筐里。
64.4、把枝条基部浸泡到培养液里，吸收水分和营养，并在pvc筐上覆盖一层透明薄膜。
65.把步入室人工气候室设定为12h光照，光照强度为2000lux(勒克斯)，温度为24℃。另外12h为黑暗，不补光，温度为18℃；每隔24h更换新鲜培养液。
66.5、7天后能在枝条上生长出大量无菌嫩芽。等嫩芽生长到1
‑
2cm，符合组培用芽的需求时，用无菌手术刀轻轻地在芽基把嫩芽部挖出。枝条放回去培养。大概一周后，又有大量新芽冒出来，又可以收获一批新嫩芽。每根枝条能培养二个月左右，总的能采收4到5批次无菌嫩芽。
67.实施例4
68.一种用植物枝条诱导不含内生菌嫩芽的方法，包括以下步骤：
69.1、树枝选择
70.在早春植物抽芽长叶前选取两年生以上的蓝果树枝条，用清水进行清洗。
71.将洗干净枝条放在背阳通风处进行摊开晾干，时间40min。
72.2、配制生长溶液：称2.5gnaa生长素，用300ml乙醇进行溶解，用蒸馏水定容至6.0l，配制成生长溶液。
73.浸泡处理：将已经晾干枝条，底端向下，并将底端6cm浸泡在生长溶液里，静置2h。
74.3、培养液配制：1/2ms培养基+8.5g/l磷酸二氢钾，ph调至5.8，加入氨苄青霉素和庆大霉素溶液，两者终浓度分别为100mg/l和200mg/l。
75.将培养液移到步入室人工气候室内，放到蓝色pvc(聚氯乙烯)筐里。
76.4、把枝条基部浸泡到培养液里，吸收水分和营养，并在pvc筐上加一层透明薄膜。
77.把步入室人工气候室设定为12h光照，光照强度为2000lux(勒克斯)，温度为25℃。另外12h为黑暗，不补光，温度为19℃；每隔24h更换新鲜培养液。
78.5、7天后能在枝条上生长出大量无菌嫩芽。等嫩芽生长到1
‑
2cm，符合组培用芽的需求时，用无菌手术刀轻轻地在芽基把嫩芽部挖出。枝条放回去培养。大概一周后，又有大量新芽冒出来，又可以收获一批新嫩芽。每根枝条能培养二个月左右，总的能采收4到5批次无菌嫩芽。
79.对比例1
80.与实施例2不同之处在于：从野外采集的嫩芽不进行任何处理。
81.对比例2
82.与实施例2不同之处在于：用自来水替代培养液。其他步骤均相同。
83.对比例3
84.与实施例2不同之处在于：培养液中加入3％的葡萄糖。其他步骤均相同。
85.对上述实施例1
‑
4以及对比例1
‑
3获得的嫩芽进行鉴定，包括：每组枝条5个批次生长嫩芽的总数量、内生菌污染率、以及组培生成幼苗的成活率。
86.每组枝条5个批次生长嫩芽的总数量测定方法：以5个枝条为一组，该组5个批次获取嫩芽数量之和为总嫩芽数。
87.取实施例1
‑
4和对比例1
‑
3组获得的嫩芽，放入75％酒精中5s，无菌水冲洗5次，再用0.1％hgcl2浸泡消毒4min，再次用无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸水分，接入如下生根培养基：1/2wpm培养基+30g/l蔗糖+0.50mg/ml 6
‑
苄氨基嘌呤+0.05mg/l naa+7g/l琼脂，育成蓝果树组培苗(其中实施例2嫩芽继续组培后得到的组培苗如图2所示)。
88.表1实施例1
‑
4和对比例1
‑
3嫩芽相关指标统计结果
[0089][0090]
由表1结果可以看出，野外采集的蓝果树枝条通过常规的消毒方式并不能很好的对其进行彻底消毒，导致培养的嫩芽中含有大量内生菌，影响组培嫩芽的数量和质量。另外，在进行组培时，各步骤处理过程中所用试剂的选择对枝条组培诱导嫩芽的数量和质量也起到至关重要的作用，经过大量的试验发现，在实施例2的条件下为最佳条件，组培蓝果树枝条能获取大批量的不含内生菌的嫩芽，并且能够在转化之后100％的培育成组培幼苗。
[0091]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。