一种防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物及使用方法与流程

1.本发明涉及一种防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物及使用方法，可以用作哺乳动物粪便样品常温保护液，涉及粪便样品的常温保存和粪便中肠道微生物组成结构的保护，特别是涉及一般家庭条件下粪便样品的保存和运输。


背景技术：

2.人类肠道中寄生着数量庞大、种类繁多的微生物，被科学家称为人类的“第二基因组”。随着科学研究的深入，越来越多的证据表明肠道菌群与人体健康的各个方面，诸如消化吸收、内分泌、肿瘤形成和发展、免疫反应和神经系统等，有着十分密切的关联。大量的人群实验数据显示，不同生理和疾病状态的人，其肠道菌群之间也往往存在显著差异。因此，可以通过检测肠道菌群的一些关键指标来指导人们的日常生活或辅助临床诊疗。
3.当前大多数针对人肠道微生物的科学研究，主要通过采集粪便样品来进行检测分析。而基因测序作为肠道菌群物种和功能分析的重要检测手段，其检测结果的准确性严重依赖于粪便样本中微生物基因组的保存情况。
4.人肠道微生物主要由细菌组成，种群结构复杂。对氧气耐受能力不同的细菌在粪便离体暴露于氧气后，会很快受到不同程度的生长抑制或促进，微生物组成发生改变。为了保证基于基因检测技术的结果准确性，有必要在短时间内对采集到的粪便样本进行特殊处理，维持样品中微生物组成、丰度等信息稳定不变。
5.目前，学界认可的粪便样品保存的标准方法为：粪便按照操作规范采集后尽快放入负80摄氏度冰箱或干冰中冻存(消化道微生态标准化样本库共识，杨云生，《转化医学杂志》，2018年8月第7卷第4期)。但该种方法的施行需要较高的条件，比如采集场所需具备大型超低温冰箱或足量干冰，并不适用于一般家庭。
6.因此开发出一款安全有效，满足常规运输条件的粪便样本保护液仍然在商业上有巨大的应用价值，并且帮助肠道微生物分析测试在消费端的普及。


技术实现要素：

7.在本技术中，含有以下术语的，均应当参照以下含义进行解释。
[0008]“患者”指哺乳动物，包括人类。
[0009]“药学上可接受”物质指如下物质，其在正常的医学判断范围内适用于与患者的组织接触而不会有不适当毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的利弊比，且能有效用于其目的用途。
[0010]“惰性”物质指可影响药物的生物可利用性，但在其它方面不具有药学活性的物质。
[0011]
术语“基本上”和“大约”表示可由任何定量比较、数值、测量或其它表示方法造成的固有不确定程度。在本文中还使用这些术语表示数量的表示可以与所述的参比值有一定的偏离程度，但是不会导致所针对的对象的基本功能改变。
[0012]
术语“基本上没有”、“基本上不(包)含”是指基于所述组合物(重量百分比)至多10％、优选至多5％、更优选至多1％、更优选至多0.5％、更优选至多0.1％、更优选至多0.05％、更优选至多0.03％、更优选至多0.02％、以及最优选至多0.01％量的讨论的组分。
[0013]
本领域普通技术人员将理解“约”，并且在使用该术语的上下文中将在某种程度上变化。如果术语的使用对于本领域普通技术人员来说是不清楚的，考虑到使用它的上下文，“约”将意味着高达特定术语的加或减20％。当使用术语“约”来描述范围的值或端点时，应理解本发明包括所参考的具体值或者端点。无论本发明中范围的数值或终点是否使用“约”，范围的数值或终点包括两种实施方式：一种用“约”修饰，另一种未用“约”修饰。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相结合以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。
[0014]
本说明书中任何有关温度范围、ph范围、重量(质量)范围、分子量范围、百分比范围等，不论是否使用“范围”或“各个范围”的措词进行表达，都包括所指定的端点以及两端点间的各点。
[0015]
在粪便完成采集后，为了使所采集的粪便最大程度地保持原有的菌落组成，通常需要将试样进行深度冷冻保存。但在家庭使用等场景下并不能满足这样的测试要求，所以陆续开发了能够抑制细菌生长的保护液等技术并通过冷藏尽可能地减少菌落组成的变化。
[0016]
本发明要解决的技术问题之一是提供一款能够在一定储存温度以下使粪便样本发生凝固或大幅降低其流动性，在一定使用温度以上使粪便样本恢复成流动态的保护液配方。
[0017]
本发明所提供的保护液配方能够使尚未达到保护液体系凝固点温度的保护液发生凝结，使其流动性大幅降低，进一步阻碍粪便样本的菌落组成发生变化；而在测试温度时使保护液体系恢复流动性，便于仪器的测试；且该保护液组成不会对仪器测试结果产生负面影响。
[0018]
为了解决上述技术问题，本发明提供一种防止生物学样本遗传信息物质降解的配方及使用方法。
[0019]
一方面，本发明提供一种温度敏感的防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物(保护液配方)，能够在较高温度下(例如高于20℃)保持水样液体的流动性(流体状)，而在较低温度下(例如0-20℃)变成不透明状态的凝胶状物质，而且使水凝胶的流体状与凝胶状的温度改变点可以在更宽的范围内进行调整。
[0020]
首先，本发明配方所形成的水凝胶具有透明的流体状特性。其次，本发明向该水凝胶保护液中添加离子型表面活性剂，优选为阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂一般具有krafft点，即当温度升高至某一点时，阴离子型表面活性剂在水中的溶解度急剧升高，本发明将阴离子型表面活性剂作为“热敏感响应组分”引入到水凝胶保护液的凝胶网格里，当水凝胶保护液温度处于krafft点或以下时，阴离子型表面活性剂在凝胶网格里会出现析出或溶解的改变，析出的阴离子型表面活性剂会使水凝胶保护液发生凝结形成凝胶状，从而使得水凝胶保护液在流体与凝胶两种状态下进行改变，从而实现温度控制水凝胶流动性的目的。第三，本公开通过调节水和有机溶剂的比例、调节阴离子型表面活性剂浓度和种类等因素能够改变水凝胶流动性的温度变化点。本发明优选能够与水以任意比互溶的有机溶剂，因而水凝胶流动性的温度变化点的调节范围更宽。
[0021]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，本发明提供的一种温度敏感的防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物，包含：包含蛋白质变性剂、抑菌剂、阴离子表面活性剂及分散剂。
[0022]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，蛋白质变性剂优选为螯合剂，螯合剂可以选自cdta、edta等，例如edta
·
4na、edta
·
2na等；cdta指1,2-环己二胺四乙酸，例如cdta
·
4na、cdta
·
2na等。除螯合剂外，蛋白质变性剂还可以是高浓度盐、高浓度重金属盐、还原剂、胍盐酸盐、脲和/或蛋白酶等。
[0023]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，抑菌剂可以选自三氯生、三氯卡班、二氯生(hp-100)、对氯二甲苯酚等。
[0024]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，分散剂选自醇醚，所选的醇醚易溶于水；优选的醇醚能与水互溶。本发明中所称的“醇醚”指含有羟基基团的醚。
[0025]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，分散剂选自醇醚或聚醚中的至少一种或是它们的组合物，醇醚或聚醚结构式由一个多元醇的或由彼此之间形成醚键的两个以上多元醇组成，易溶于水，优选为能跟水混溶。
[0026]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，醇醚结构式由一个多元醇的或由彼此之间形成醚键的两个以上多元醇的其中至少一个羟基与至少一个一元醇形成醚键后，所述醇醚至少含有一个羟基，且易溶于水，优选为能跟水混溶。
[0027]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，这种醇醚优选自乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、二乙二醇甲醚、二乙二醇乙醚、三乙二醇甲醚、三乙二醇乙醚、四乙二醇甲醚、五乙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、三丙二醇甲醚、四丙二醇甲醚、五丙二醇甲醚、三乙二醇丁醚、聚甘油醚、聚乙二醇和聚丙二醇中的一种或是它们的组合物。聚甘油醚、聚乙二醇或聚丙二醇的化学式中包含一个或一个以上羟基，分子量低于2000，优选分子量低于1000。
[0028]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，这种醇醚进一步优选为三乙二醇甲醚、三乙二醇乙醚、三乙二醇丙醚、三乙二醇丁醚、二乙二醇丁醚、三乙二醇戊醚或它们的类似物。
[0029]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，阴离子表面活性剂优选自烷基苯磺酸、烷基磺酸、烷基硫酸、烃基羧酸等的钠盐或钾盐中的一种或是它们的组合物。所述烷基苯磺酸的钠盐或钾盐可以选自十二烷基苯磺酸钠(或钾)，所述烷基磺酸的钠盐或钾盐可以选自十二烷基磺酸钠(或钾)，所述烷基硫酸的钠盐或钾盐可以选自十二烷基硫酸钠(或钾)；所述烃基羧酸可以选自烷基羧酸中的硬脂酸、软脂酸、月桂酸等，也可以选自烯烃基羧酸中的油酸等。阴离子表面活性剂优选为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠和月桂酸钠中的一种或是它们的组合物。
[0030]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，阴离子表面活性剂在组合物中重量百分比含量为0.1-8％；优选为0.5-5％；进一步优选为0.7-3％；更进一步优选为0.8-2％；最优选为0.95-1.05％。
[0031]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，分散剂在组合物中重量百分比含量为1-50％；优选为5-40％；进一步优选为10-30％；更进一步优选为10-25％；最优选为12-25％。
[0032]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，分散剂中基本上不添加对人体有毒的物质，优选为分散剂中基本上不包含对人体有毒的物质，例如基本上不包含异硫氰酸胍等。优
选地，在本技术的一个或多个具体实施方式中，组合物中基本上不添加对人体有毒的物质，进一步优选为组合物中基本上不包含对人体有毒的物质，例如基本上不包含异硫氰酸胍等。
[0033]
一方面，本发明还提供了前述的一种或多种防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物的使用方法。
[0034]
前述的一种或多种防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物配合保温容器在低于配方krafft点(例如0-20℃)的环境下保存采集的生物学样本，优选为人体排泄和/或排遗物质样本，用户自行采集样本后将样本置入该容器后保存，并送至检测机构检测，最大可能性的降低样品采集后至送检过程中导致的待检物质变质风险。
[0035]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，保温容器可以是类似于保温杯一样的容器，其中可以置入冰袋或冰块；也可以是一种中间层灌入比热容较高的液体的双层容器，双层容器可以先保存在冰箱中，待用户自行采集样本后，用户将采样容器置入该双层容器中保存。
[0036]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，用户将自行采集的样本在配方krafft点以上(即环境温度)放入装有防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物的采样容器中；混合均匀；用户将采样容器的温度降至配方krafft点以下使组合物配方形成凝胶状；保持采样容器的温度在组合物配方krafft点以下至样品检测环节。
[0037]
另一方面，本发明提供前述的一种或多种防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物在稳定化哺乳动物生物学样本遗传信息物质方面中的应用。
[0038]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，优选为稳定化人体生物学样本遗传信息物质，进一步优选为稳定化从人体排泄和/或排遗物质作为生物学样本中包含的遗传信息物质，遗传信息物质可以是来自于人和/或微生物的脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)等。
[0039]
在本技术的一个或多个具体实施方式中，前述的一种或多种温度敏感的水凝胶保护液能够稳定化哺乳动物生物学样本遗传信息物质。
[0040]
本发明的有益效果为：
[0041]
1.本发明提供的温度敏感的水凝胶式防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物具有热敏感响应性，且响应温度可以在较宽范围内调整，能够作为保护液的温度响应组分。
[0042]
2.本发明中的温度敏感的水凝胶式防止生物学样本遗传信息物质降解的组合物以阴离子表面活性剂作为基质材料，化学交联形成的三维网络结构稳定，孔隙均匀；凝胶骨架上的基团不会与体系中存在的其他分子发生反应，从而使该水凝胶式防止生物学样本遗传信息物质降解的配方具有温度响应的可逆性，配方本身可反复使用。
[0043]
3.本发明以阴离子型表面活性剂作为温度响应组分，其能够在基质凝胶中，以胶团形式大量存在于溶剂中的阴离子表面活性剂会在基质凝胶中均匀析出或溶解，宏观表现为所得凝胶透明度和流动性的改变，形成凝胶状物质，从而实现保护液流动性的降低、进一步阻碍粪便样本的菌落组成发生变化。
附图说明
[0044]
图1为实施例3在10℃(krafft点以下)和20℃(krafft点以上)粪便菌群dna琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0045]
图2为实施例1(配方1)和比较例1(配方2)在3℃粪便菌群dna琼脂糖凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
[0046]
以下结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0047]
如没有特别说明，本技术及具体实施方式中所用到的浓度单位的含义：百分比浓度为重量百分比浓度；m、mm指摩尔浓度即mol/l或mmol/l；ppm指溶质质量占全部溶液质量的百万分比来表示的浓度，即百万分比浓度。
[0048]
实施例1(配方1)：
[0049]
表1实施例1配方表
[0050][0051]
实施例1的制备方法具体为：
[0052]
1、取2l去离子水，经0.22μm滤膜过滤后，121℃灭菌30min，得到无菌水。
[0053]
2、称取edta
·
4na粉末(纯度》98％)2g溶于无菌水中，定容至500ml，得到edta
·
4na水溶液。
[0054]
3、向上步骤得到的500ml edta
·
4na水溶液中分别加入10g十二烷基苯磺酸钠。
[0055]
5、用无菌水将上步骤得到的混合溶液定容至1l。
[0056]
6、使用0.22μm滤膜将上步骤定容后的混合溶液过滤，分装至配套的粪便样本采集器中。
[0057]
7、样本采集时，4ml保护液最多保护1g粪便样本。采集适宜重量的粪便样本至采集器，通过摇晃使粪便与保护液充分混合，即可实现粪便中微生物dna保护效果。
[0058]
最终形成的实施例1配方参见表1。
[0059]
实施例1的krafft点为：约5℃。
[0060]
比较例1(配方2)：
[0061]
参照实施例1的制备方法，将各试剂添加量按照表2配方进行适应性修改配置为比较例1。
[0062]
表2比较例1配方表
[0063]
[0064]
实施例2：
[0065]
参照实施例1的制备方法，将各试剂添加量按照表3配方进行适应性修改配置为实施例2。
[0066]
表3实施例2配方表
[0067][0068]
实施例2的krafft点为：约10℃。
[0069]
实施例3：
[0070]
参照实施例1的制备方法，将各试剂添加量按照表4配方进行适应性修改配置为实施例3。
[0071]
表4实施例3配方表
[0072][0073]
实施例3的krafft点为：约15℃。
[0074]
根据实施例1防降解(防止菌落变化)效果实验的方法对上述实施例2和实施例3测试，证明实施例2和实施例3的实际防降解效果均明显优于其他非阴离子表面活性剂体系，且实施例处于krafft点以下条件时的防降解效果明显优于其在krafft点以上的条件，证明本发明的具体实施方式中通过温度调控体系呈现凝胶化对于防降解(提升抑菌效果防止菌落变化)有显著的增强效果。
[0075]
最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。