1.本发明涉及林木育种技术领域，具体涉及一种旱柳抗逆快速进化基因的发掘方法。
背景技术：
2.柳树是杨柳科(salicaceae)柳属(salix.l)和钻天柳属(chosenia nakai)树种的统称，落叶乔木或灌木，主要分布于北半球温带与寒带地区，是一种重要的能源、造林和绿化树种。全球共有520多种柳树，亚洲是柳树的起源中心，其中，中国分布有257种。
3.柳树具有很好的抗逆性，如耐盐、耐旱、耐水湿以及耐重金属胁迫等，同时在生态修复中发挥着重要的作用。
4.旱柳(salix matsudana koidz)是杨柳科柳属异源四倍体高大乔木，抗逆性良好，适应性强，一些品种如9901，海柳1号等已在中国沿海地区得到应用。为了培育出更多的抗逆性良好的旱柳品种，采用传统的柳树抗逆性基因的发掘效率低且速度慢。
技术实现要素：
5.为克服现有技术所存在的缺陷，现提供一种旱柳抗逆快速进化基因的发掘方法，以解决传统的柳树抗逆性基因的发掘效率低且速度慢的问题。
6.为实现上述目的，提供一种旱柳抗逆快速进化基因的发掘方法，包括以下步骤：
7.选取不同的多个柳树品种构建基础群；
8.筛选出所述基础群中的二倍体柳树品种；
9.对所述二倍体柳树品种进行基因组重测序并结合异源四倍体旱柳ab亚基因组构建所述二倍体柳树品种的分子进化树以初选所述异源四倍体旱柳的多个二倍体柳树候选亲本；
10.在多个所述二倍体柳树候选亲本中，筛选出与所述异源四倍体旱柳ab亚基因组最吻合的两所述二倍体柳树候选亲本作为终选亲本；
11.将两所述终选亲本杂交及染色体加倍处理获得异源四倍体柳树新种质；
12.对所述异源四倍体柳树新种质进行全基因组测序，并与已测序的异源四倍体旱柳及二倍体柳树进行基因比对并在生物信息数据库和异源四倍体旱柳非生物胁迫下转录组差异基因中注释出抗逆快速进化基因。
13.进一步的，所述选取不同的多个柳树品种构建基础群的步骤包括：
14.截取不同的多个所述柳树品种的茎段；
15.将所述茎段通过水培生根形成植株。
16.进一步的，所述筛选出所述基础群中的二倍体柳树品种的步骤包括：
17.检测所述基础群的柳树品种的植株的倍性；
18.以已知的二倍体杞柳品种作为对照，筛选出所述基础群中的二倍体柳树品种。
19.进一步的，所述筛选出与所述异源四倍体旱柳ab亚基因组最吻合的所述二倍体柳
树候选亲本作为终选亲本的步骤包括：
20.将所述二倍体柳树候选亲本通过细胞染色体制片核型分析、田间生长形态学观测表型，同时将所述二倍体柳树候选亲本与异源四倍体旱柳的叶绿体进行测序比对、检索所述二倍体柳树候选亲本的柳树种质地理分布，比对出与所述异源四倍体旱柳ab亚基因组最吻合的二倍体柳树候选亲本作为所述终选亲本。
21.进一步的，所述对所述终选亲本经杂交及染色体加倍处理获得异源四倍体柳树新种质的步骤包括：
22.将两所述终选亲本进行杂交获得f1代并收获所述f1代的第一种子；
23.同时种植所述第一种子和所述异源四倍体旱柳的第二种子分别获得植株；
24.通过生长表型比对，筛选出表型数据与所述第二种子的植株最大相似度的所述第一种子的植株；
25.对筛选出的所述第一种子的植株进行染色体加倍获得所述异源四倍体柳树新种质。
26.进一步的，所述注释出抗逆快速进化基因的步骤包括：
27.借助orthomcl软件对异源四倍体柳树新种质和现有旱柳的蛋白序列进行聚类，得到单拷贝直系同源基因；
28.使用paml中的codeml模块，应用branch site模型对两者的单拷贝基因进行选择压力分析，根据选择压力lrt值大小，确定快速进化基因。
29.本发明的有益效果在于，本发明的旱柳抗逆快速进化基因的发掘方法能够快速、高效、准确的发掘出柳树的抗逆快速进化基因，为旱柳遗传育种提供丰富的材料基础以应用于抗逆性良好、适应性强的柳树品种选育中。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。
31.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本技术。
32.本发明提供了一种旱柳抗逆快速进化基因的发掘方法，包括以下步骤：
33.s1：选取不同的多个柳树品种构建基础群。
34.具体的，步骤s1包括：
35.s11、截取不同的多个柳树品种的茎段；
36.s12、将所述茎段通过水培生根形成植株。
37.s2：筛选出基础群中的二倍体柳树品种。
38.具体的，步骤s2包括：
39.s21、检测基础群的柳树品种的植株的倍性；
40.s22、以已知的二倍体杞柳(salix integra)作为对照，筛选出基础群中的二倍体柳树品种。
41.s3：对二倍体柳树品种进行基因组重测序并结合异源四倍体旱柳ab亚基因组构建二倍体柳树品种的分子进化树以初选异源四倍体旱柳的多个二倍体柳树候选亲本。
42.具体的，选取所有二倍体柳树的植株的叶片，提取叶片中的dna后送生物公司重测序。基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(snp)，插入缺失位点(indel，insertion/deletion)、结构变异位点(sv，structure variation)位点和拷贝数变异位点(cnv，copy number variation)。测定snps(snps一般指单核苷酸多态性，单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性)，同时结合异源四倍体旱柳ab亚基因组数据与前期报道的sci论文中的柳树进化图以及www.timetree.org网站资料构建分子进化树，初步分析异源四倍体旱柳的二倍体亲本，再用sniploid软件对snps进行异源四倍体柳树起源分析，进一步查找异源四倍体旱柳的多个二倍体柳树候选亲本。
43.s4：在多个二倍体柳树候选亲本中，筛选出与异源四倍体旱柳ab亚基因组最吻合的两个二倍体柳树候选亲本为终选亲本。
44.具体的，包括：将多个二倍体柳树候选亲本通过细胞染色体制片核型分析、田间生长形态学观测表型，同时将二倍体柳树候选亲本与异源四倍体旱柳(旱柳s.matsudana
‘
yanjiang’)的叶绿体进行测序比对、检索二倍体柳树候选亲本的柳树种质地理分布，比对出与异源四倍体旱柳ab亚基因组最吻合的两个二倍体柳树候选亲本作为终选亲本。
45.s5：将两个终选亲本杂交，并进行染色体加倍处理获得异源四倍体柳树新种质。
46.具体的步骤s5包括：
47.s51、将两个终选亲本进行杂交获得f1代并收获f1代的第一种子；
48.s52、将第一种子与异源四倍体旱柳(旱柳s.matsudana
‘
yanjiang’)的第二种子一起播种种植获得植株；
49.s53、通过生长表型比对，筛选出表型数据与第二种子的植株最大相似度的所述第一种子的植株；
50.s54、对筛选出的第一种子的植株进行染色体加倍获得异源四倍体柳树新种质。
51.对筛选出的第一种子的植株进行秋水仙素加倍，再用流式细胞术检测其倍性，创制出异源四倍体柳树新种质。
52.s6：对异源四倍体柳树新种质进行全基因组测序，并与已测序的异源四倍体旱柳及二倍体柳树进行基因比对并在生物信息数据库和异源四倍体旱柳非生物胁迫下转录组差异基因中注释出抗逆快速进化基因。
53.将异源四倍体柳树新种质与现有旱柳(s.matsudana
‘
yanjiang’)进行表型性状对比，选取表型最大相似度的异源四倍体柳树新种质进行全基因组测序，并与已测序的异源四倍体旱柳进行基因对比，借助orthomcl软件对异源四倍体柳树新种质和现有旱柳的蛋白序列进行聚类，得到单拷贝直系同源基因，使用paml(phylogenetic analysis by maximum likelihood)软件中的codeml模块，应用branch site模型对两者的单拷贝基因进行选择压力分析，根据选择压力lrt值确定快速进化基因，lrt＝2
×
|lnp
1-lnp2|，其中p1：ω》1的概率，p2：0《ω《1的概率，ω＝ka/ks。当lrt》0.95时，认为是受到了显著的正选择压力，即该基因发生了快速进化。再将快速进化基因参考已报道的柳树二倍体基因组数据，结合go、kegg、nr、swiss-prot、cog以及eggnog等生物信息数据库注释与异源四倍体旱柳非生物胁迫下转录组差异基因比对得到抗逆快速进化基因，同时分析进化过程中抗逆快速进化基因
的增加/缺失/突变。
54.快速进化基因，是可促使一个物种演变为两个物种的基因，比基因组中的其他基因显现出更强的适应能力。若快速进化基因能编码一些抗逆性物质，如编码抗干旱物质、抗高盐蛋白、抗毒蛋白，那么就被称为抗逆快速进化基因。
55.本发明涉及的orthomcl软件(http://orthomcl.org/orthomcl/)主要用来找直系同源基因以及旁系同源基因。它主要在比较完整的基因组之间找直系同源基因。
56.本发明涉及的paml是一款利用dna或protein数据使用最大似然法进行系统发育分析的软件。
57.以上描述仅为本技术的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本技术中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本技术中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。