一种液基细胞保存液及其配制方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种液基细胞保存液及其配制方法。


背景技术：

2.目前，宫颈癌是目前女性癌症中最常见的恶性肿瘤之一。早期诊断宫颈癌及癌前病变是提高宫颈癌治愈率及患者生存率的关键，宫颈癌筛查方法有hpv基因分型检查和薄层液基细胞学检查两种方式。hpv基因分型检查费用昂贵，对检查的环境和设备要求较高，不宜适用常规的大规模筛查手段。薄层液基细胞学检查有着费用低，检查的环境和设备要求不高，是目前临床应用最广泛的筛查子宫颈癌的主要方法。它是以观察细胞结构和形态变化来诊断临床病症的一门学科。几十年来细胞学检查已成为宫颈癌的大规模普查和高危人群随访观察的主要方法，使中晚期宫颈癌发生率大幅度下降。
3.但是，薄层液基细胞学检查也存在不足。由于细胞脱离原来的生存环境，细胞的形态结构都将会发生改变，只有通过正确的细胞保存方法才能确保得到正确的诊断。现有的细胞保存液常用大于40％的醇类或对细胞标本进行冷冻保存，而这些的细胞保存时间很短并对细胞有损伤的危害，会导致细胞形态结构发生改变，从而影响到对病变判断。
4.本发明的目的是提供一种液基细胞保存液极其制备方法，适合用于薄层液基细胞学检查。


技术实现要素：

5.基于上述问题，本发明的目的在于提供一种液基细胞保存液及其配制方法，以克服现有技术中细胞液存在的细胞保存时间短，同时很好地维持细胞形态。
6.本发明的技术方案一是提供液基细胞保存液，具体如下：
7.一种液基细胞保存液，按照质量百分比，包括15～20％醇类、0.4～0.7％缓冲成分、0.2～0.5％离子强度调节剂、0.05～2％抗凝剂、0.05～0.2％粘液解离剂、0.5～0.9％防腐剂、余量为纯化水。
8.一实施例，所述液基细胞保存液中，所述醇类选自甲醇、乙醇及异丙醇中的一种或任意两种；优选甲醇；
9.一实施例，所述液基细胞保存液中，所述缓冲成分为磷酸二氢钠、磷酸二氢甲、磷酸钠或磷酸钾。
10.一实施例，所述液基细胞保存液中，所述离子强度调节剂为乙酸钠、乙酸镁、乙酸钙、氯化钠及氯化钾中的一种或任意两种。
11.一实施例，所述液基细胞保存液中，所述抗凝剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠及乙二胺四乙酸二钾中的一种或任意两种。
12.一实施例，所述液基细胞保存液中，所述粘液解离剂为n－乙酰基－l－半胱氨酸、二硫苏糖醇及三(2－羰基乙基)磷盐酸盐中的一种或任意两种。
13.一实施例，所述液基细胞保存液中，所述防腐剂为苯氧乙醇、苯甲酸钠及苯酚中的
一种。
14.本发明的技术方案二是提供液基细胞保存液的配制方法，具体如下：
15.一种上述液基细胞保存液的配制方法，包括如下步骤：
16.将缓冲成分、离子强度调节剂、抗凝剂、粘液解离剂及防腐剂加入容量器中，获得混合液；
17.往容量器中加入纯化水，搅拌溶解所述混合液；随后再加入醇类，继续搅拌混合均匀，制得前驱液体；
18.调节所述前驱液体ph至6.50～7.00，并补充纯化水，制得所述液基细胞保存液。
19.一实施例中，所述前驱液体ph的调节是加入盐酸或氢氧化钠来实现的。
20.与现有的常用技术相比，本发明的优点在于：
21.(1)细胞保存液中成分设置合理，能够常温长时间地保存细胞，维持细胞形态；
22.(2)加入粘液解离剂，能有有效软化细胞粘液，可使样本中被粘液粘附的细胞分离出来，避免细胞堆积；
23.(3)加入防腐剂，能有效抑制霉菌、细菌或其他病原体增生，有利于细胞保存。
附图说明
24.图1为实施例1中细胞保存前的形态图；
25.图2为采用实施例1配制的保存液保存1年以后的细胞形态图。
具体实施方式
26.下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
27.本发明提供的液基细胞保存液，它由纯化水、醇类、缓冲成分、离子强度调节剂、抗凝剂、粘液解离剂、防腐剂等组分组成。按照质量百分比，各组分比例如下：
28.15～20％醇类，0.4～0.7％缓冲成分，0.2～0.5％离子强度调节剂，0.05～2％抗凝剂，0.05～0.2％粘液解离剂，0.5～0.9％防腐剂，余量为纯化水。
29.较好地，液基细胞保存液中，醇类组分可以选自甲醇、乙醇及异丙醇中的一种或任意两种；如，醇类组分单独选用甲醇、乙醇或异丙醇；或者醇类组分选自甲醇和乙醇的混合醇、乙醇与异丙醇的混合醇、甲醇与异丙醇的混合醇，其中，甲醇与乙醇的质量比为10：1～1：1，乙醇与异丙醇的质量比为5：1～1：1，甲醇与异丙醇的质量比为10：1～2：1。在液基细胞保存液中，醇类组分优选为甲醇。如果醇类物质控制在20％以下，有利于避免细胞形态结构改变。
30.较好地，液基细胞保存液中，缓冲成分可为磷酸二氢钠、磷酸二氢甲、磷酸钠或磷酸钾中的任意一种。
31.较好地，液基细胞保存液中，离子强度调节剂组分可为乙酸钠、乙酸镁、乙酸钙、氯化钠及氯化钾中的一种或任意两种；如，离子强度调节剂组分单独选用乙酸钠、乙酸镁、乙酸钙、氯化钠或氯化钾；或者离子强度调节剂组分选自乙酸钠和乙酸镁混合物、乙酸镁与乙酸钙的混合物、乙酸钙与氯化钠的混合物、氯化钠及氯化钾的混合物、乙酸钠与乙酸钙的混合物、乙酸钠与氯化钠的混合物、乙酸钠与氯化钾的混合物、乙酸镁与氯化钠的混合物、乙酸镁与氯化钾的混合物、乙酸钙与氯化钾的混合物中的一种混合物；所述离子强度调节剂
为混合物时，相应组分的摩尔比为5：1～1：5。
32.较好地，液基细胞保存液中，抗凝剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠及乙二胺四乙酸二钾中的一种或任意两种；如，抗凝剂单独选自二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸二钾；或者抗凝剂选自乙二胺四乙酸与乙二胺四乙酸二钠的混合物、乙二胺四乙酸二钠及乙二胺四乙酸二钾的混合物、乙二胺四乙酸与乙二胺四乙酸二钾的混合物中的一种混合物；所述抗凝剂为混合物时，相应组分的摩尔比为3：1～1：1。
33.较好地，液基细胞保存液中，粘液解离剂选自n－乙酰基－l－半胱氨酸、二硫苏糖醇及三(2－羰基乙基)磷盐酸盐中的一种或任意两种；如，粘液解离剂单独选自n－乙酰基－l－半胱氨酸、二硫苏糖醇或三(2－羰基乙基)磷盐酸盐；或粘液解离剂选自n－乙酰基－l－半胱氨酸与二硫苏糖醇的混合物、二硫苏糖醇与三(2－羰基乙基)磷盐酸盐的混合物、n－乙酰基－l－半胱氨酸与三(2－羰基乙基)磷盐酸盐的混合物中的一种混合物；所述粘液解离剂为混合物时，相应各组分的摩尔比为5：1～1：1。
34.较好地，液基细胞保存液中，防腐剂选自苯氧乙醇、苯甲酸钠、苯酚等中的一种。该防腐剂的作用是防止细菌滋生，提高细胞保存时间。
35.上述提供的液基细胞保存液，其配制工艺步骤如下：
36.s1、以配置1000ml保存液为例，将缓冲成分、离子强度调节剂、抗凝剂、粘液解离剂及防腐剂等组分物质加入容量器中，得到混合液；
37.s2、先用500ml纯化水加入容量器中，搅拌溶解混合液中的各组分物质；随后加入醇类，继续搅拌充分混合，制得前驱体液；
38.s3、调节前驱液体ph至6.50～7.00，最后再补充纯化水至1000ml刻度出，搅拌均匀；制得液基细胞保存液；该液基细胞保存液中，按照质量百分比，包括15～20％醇类，0.4～0.7％缓冲成分，0.2～0.5％离子强度调节剂，0.05～2％抗凝剂，0.05～0.2％粘液解离剂，0.5～0.9％防腐剂，余量为纯化水。
39.上述步骤s3中，前驱液体ph的调节是加入盐酸或氢氧化钠来实现的。
40.下面举一些具体实施例来进一步详细说明液基细胞保存液的配制
41.实施例1
42.以配置1000ml保存液为例，取6g磷酸二氢钠、1.2g乙酸镁、2g氯化钠、1g乙二胺四乙酸二钠、1.5g n－乙酰基－l－半胱氨酸及6g苯氧乙醇加入容量器中。
43.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸二氢钠、乙酸镁、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、n－乙酰基－l－半胱氨酸、苯氧乙醇；随后再加入180g甲醇，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
44.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
45.如图1和2所示。图1为细胞保存前的形态状态图；图2为采用本实施例配制的保存液保存1年以后的细胞形态图。从图1和2中可以看出，1年后细胞呈分散状态，细胞形态完整，而且涂片背景清晰透明、细胞单层均匀分布，有利于诊断及病态跟踪观察。
46.本实施例中的液基细胞保存液，主要用于保存宫颈上皮细胞。及采用细胞保存液对脱落的上皮细胞在常温下进行保存，并察细胞的形态结构变化。结果显示脱落的上皮细胞的保存率高、细胞分布均匀，细胞形态完整，胞浆与细胞核分界清楚，无粘液层次分明，胞
浆与细胞核透亮性非常好。上皮细胞在这种液基细胞保存液下，常温能够保存1～2年。
47.实施例2
48.以配置1000ml保存液为例，取5g磷酸钠、2g乙酸钙、1.5g氯化钠、1.2g乙二胺四乙酸、1g n－乙酰基－l－半胱氨酸及7g苯酚加入容量器中。
49.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸钠、乙酸钙、氯化钠、乙二胺四乙酸、n－乙酰基－l－半胱氨酸、苯酚；随后再加入170g甲醇，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
50.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
51.实施例3
52.以配置1000ml保存液为例，取6g磷酸二氢钾、1.5g乙酸钠、3g氯化钠、1.2g乙二胺四乙酸二钾、1gl三(2－羰基乙基)磷盐酸盐及7g苯氧乙醇加入容量器中。
53.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸二氢钾、乙酸钠、氯化钠、乙二胺四乙酸二钾、三(2－羰基乙基)磷盐酸盐、苯氧乙醇；随后再加入180g异丙醇，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
54.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
55.实施例4
56.以配置1000ml保存液为例，取5g磷酸钾、2g乙酸钠、1.6g乙二胺四乙酸与乙二胺四乙酸二钠的混合物(其中，乙二胺四乙酸与乙二胺四乙酸二钠的摩尔比为1：1，即0.7g乙二胺四乙酸，0.9g乙二胺四乙酸二钠)、0.9g二硫苏糖醇及6g苯甲酸钠加入容量器中。
57.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸钾、乙酸钠、乙二胺四乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇、苯甲酸钠；随后再加入180g乙醇与异丙醇的混合醇(其中，乙醇与异丙醇质量比为2：1，乙醇120g，异丙醇60g)，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
58.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
59.实施例5
60.以配置1000ml保存液为例，取6g磷酸二氢甲、4g氯化钠、2.15g乙二胺四乙酸二钠及乙二胺四乙酸二钾的混合物(其中，乙二胺四乙酸二钠及乙二胺四乙酸二钾的摩尔比为2：1，即1.39g乙二胺四乙酸二钠，0.76g乙二胺四乙酸二钾)、1.27g n－乙酰基－l－半胱氨酸与二硫苏糖醇的混合物(其中，n－乙酰基－l－半胱氨酸与二硫苏糖醇的摩尔比为1：1，即0.65g n－乙酰基－l－半胱氨酸，0.62g二硫苏糖醇)及6g苯氧乙醇加入容量器中。
61.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸二氢钾、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、n－乙酰基－l－半胱氨酸、二硫苏糖醇、苯氧乙醇；随后再加入160g甲醇与异丙醇的混合醇(其中，甲醇与异丙醇质量比为3：1，甲醇120g，异丙醇40g)，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
62.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
63.实施例6
64.以配置1000ml保存液为例，取7g磷酸二氢钠、2.5g氯化钾、1.92g乙二胺四乙酸与乙二胺四乙酸二钾的混合物(其中，乙二胺四乙酸(292)及乙二胺四乙酸二钾的摩尔比为3：1，即1.31g乙二胺四乙酸，0.61g乙二胺四乙酸二钾)、1.5g二硫苏糖醇与三(2－羰基乙基)磷盐酸盐的混合物(其中，二硫苏糖醇与三(2－羰基乙基)磷盐酸盐的摩尔比为3：1，即0.93g二硫苏糖醇、0.57g三(2－羰基乙基)磷盐酸盐)及6.5g苯甲酸钠加入容量器中。
65.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸二氢钠、氯化钾、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钾、二硫苏糖醇、三(2－羰基乙基)磷盐酸盐、苯甲酸钠；随后再加入175g甲醇和乙醇的混合醇(其中，甲醇与乙醇质量比为4：1，甲醇140g，乙醇35g)，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
66.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
67.实施例7
68.以配置1000ml保存液为例，取4.5g磷酸钠、2.4g乙酸镁、1.8g乙二胺四乙酸二钾、1.88g n－乙酰基－l－半胱氨酸与三(2－羰基乙基)磷盐酸盐的混合物(其中，n－乙酰基－l－半胱氨酸与三(2－羰基乙基)磷盐酸盐的摩尔比为4：1，即1.31g n－乙酰基－l－半胱氨酸，0.57g三(2－羰基乙基)磷盐酸盐)及6g苯氧乙醇加入容量器中。
69.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸钠、乙酸镁、乙二胺四乙酸二钾、n－乙酰基－l－半胱氨酸、三(2－羰基乙基)磷盐酸盐、苯氧乙醇；随后再加入170g甲醇，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
70.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
71.实施例8
72.以配置1000ml保存液为例，取6.5g磷酸钾、1.2g乙酸镁、3.5g氯化钠、1.6g乙二胺四乙酸、1.3g n－乙酰基－l－半胱氨酸及7g苯酚加入容量器中。
73.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸钾、乙酸镁、氯化钠、乙二胺四乙酸二钾、n－乙酰基－l－半胱氨酸、苯酚；随后再加入180g乙醇，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
74.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
75.实施例9
76.以配置1000ml保存液为例，取6g磷酸二氢钠、1.8g乙酸钠、2g氯化钾、1g乙二胺四乙酸二钠、0.8g三(2－羰基乙基)磷盐酸盐及6.5g苯酚加入容量器中。
77.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸二氢钠、乙酸钠、氯化钠、乙二胺四乙酸二钾、三(2－羰基乙基)磷盐酸盐、苯酚；随后再加入180g甲醇，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
78.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
79.实施例10
80.以配置1000ml保存液为例，取5g磷酸二氢钾、1.2g乙酸钙、0.9g氯化钠、2g乙二胺四乙酸二钠、1.6g二硫苏糖醇及5g苯氧乙醇加入容量器中。
81.用500ml纯化水加入容量器中，搅拌充分溶解磷酸二氢钾、乙酸钠、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、二硫苏糖醇、苯氧乙醇；随后再加入160g乙醇，继续搅拌充分混合；制得前驱液体。
82.使用盐酸或氢氧化钠调节前驱液体的ph至6.50～7.00，最后补充纯化水至1000ml刻度处，搅拌均匀，制成细胞保存液。
83.应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。