赋予植物物种有益特性的方法、组合物、聚生体、代谢物及合成组合与流程

施例中，微生物聚生体可以是来自表2的个别微生物的任何组合。在其它实施例中， 微生物聚生体可以是来自表3的个别微生物的任何组合。在其它实施例中，微生物聚 生体可以是来自表1到3中任一个的个别微生物的任何组合。在某些实施例中，微生 物聚生体包含两种微生物，或三种微生物，或四种微生物，或五种微生物，或六种微 生物，或七种微生物，或八种微生物，或九种微生物，或10种微生物，或超过10种 微生物。
24.本公开的另一个目标涉及使用经分离的微生物和微生物聚生体作为植物生长促进 剂。在其它方面中，经分离的微生物和微生物聚生体充当生长调节剂，其可例如抵抗 正常老化从而引起生物质量增加。
25.本公开的另一目标涉及使用经分离的微生物和微生物聚生体作为土壤健康增强剂 和植物健康增强剂。
26.本公开的另一目标是设计微生物联合体，其能够共同实现多维活性。在某些方面 中，包含联合体的微生物以协同方式起作用。在各方面中，微生物联合体对某一植物 特征的作用将大于所述联合体中任何一个个别微生物成员在单独使用时所观察到的作 用。也就是说，在一些方面中，与联合体中的任何个别成员在单独使用时发现的作用 相比，联合体对所需植物特征呈现大于累加作用的作用。
27.在一些方面中，聚生体引起产生其它植物-微生物相互作用，例如通过充当可设定 未来微生物群落发育轨迹的主要定殖体或产生群体。
28.在实施例中，本公开涉及微生物分离物的协同组合(或混合物)。
29.在一些方面中，本文中教示的聚生体提供广泛范围的农业应用，包括：改良谷物、 果实和花朵产量；改良植物部分的生长；改良抗病性；改良在极端气候中的存活率； 以及改良其它所需植物表现型特征。显然，对植物的这些益处可在对环境无任何有害 副作用的情况下获得。
30.在一些方面中，本公开的个别微生物或包含其的聚生体可组合成农业上可接受的 组合物。
31.在一些实施例中，本公开的农业组合物包括(但不限于)：润湿剂、相容剂、消泡 剂、清洗剂、螯合剂、防飘移剂、中和剂、缓冲剂、腐蚀抑制剂、染料、气味剂、扩 展剂、渗透助剂、粘着剂、结合剂、分散剂、增稠剂、稳定剂、乳化剂、冷冻点抑制 剂、抗菌剂、肥料、农药、除草剂、惰性载剂、聚合物等。
32.在本公开的一个实施例中，以种子涂料或其它种子施用物形式供应微生物(包括 经分离的单一物种，或品系，或聚生体)。在实施例中，种子涂料可施用于裸的和未经 处理的种子。在其它实施例中，种子涂料可用作经预先处理的种子的种子外涂层。
33.在一些实施例中，所施用的可变成内生性并且因此将存在于所处理的生长植物和 其后代中。在其它实施例中，微生物可与种子处理同时以共同处理形式施用。
34.在本公开的一个实施例中，微生物以颗粒，或插入物，或施用于植物生长培养基 的土壤浇灌物形式供应。在其它实施例中，微生物以叶面施用物形式供应，如叶面喷 雾或液体组合物。叶面喷雾或液体施用物可施用于生长植物或生长培养基，例如土壤。
35.在实施例中，本公开的农业组合物可尤其配制成：(1)溶液；(2)可湿性粉末；(3) 粉尘；(4)可溶性粉末；(5)乳液或悬浮液浓缩物；(6)拌种；(7)片剂；(8)水分 散性颗粒；(9)水溶性颗粒(缓慢或快速释放)；(10)微囊封颗粒或悬浮液；以及(11) 灌溉组分。在某些方
面中，在常规喷雾施用之前，组合物可在水性介质中稀释。本公 开的组合物可施用于土壤、植物、种子、根围、根鞘或其它可有利地施用微生物组合 物的区域。
36.本公开的另一目标涉及农业组合物，其经配制以提供高集落形成单位(cfu)细 菌群体或聚生体。在一些方面中，农业组合物具有可实现相关存放期的佐剂。在实施 例中，所教示的农业组合物的cfu浓度高于在所公开的方法之外，所述微生物将天然 存在的浓度。在另一实施例中，农业组合物以10
3-10
12
cfu/克载剂或10
5-109cfu/克载 剂的浓度含有微生物细胞。在一个方面中，微生物细胞以种子涂层形式，以10
5-109cfu 的浓度直接施用于种子。在其它方面中，微生物细胞以另一种皮顶部上的种子外涂层 形式，以10
5-109cfu的浓度施用。在其它方面中，微生物细胞与另一种种子处理剂一 起以共同处理形式，以10
5-109cfu的浓度施用。
37.在各方面中，本公开涉及可促进植物生长的农业微生物配制物。在各方面中，本 公开提供所教示的经分离的微生物，和包含其的聚生体，其待配制成农业生物接种体。 所教示的生物接种体可施用于植物、种子或土壤。配制包含经分离的微生物的生物接 种体的适合的实例可见于美国专利案第7,097,830号中，其以引用的方式并入本文中。
38.所公开的多微生物配制物可：降低对含氮肥料的需要、使矿物质溶解、保护植物 抵抗病原体以及使植物可获得有价值的营养物，如磷酸盐，由此降低或消除对使用化 学农药和化学肥料的需要。
39.在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中， 可使用本公开的经分离和生物学上纯的微生物。
40.在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中， 可使用含有本公开的经分离和生物学上纯的微生物的农业上可接受的组合物。
41.在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中， 可使用本公开的聚生体。
42.在一些实施例中，在赋予所需植物物种一种或多种有利的性质或特性的方法中， 可使用含有本公开的聚生体的农业上可接受的组合物。
43.在一些方面中，本公开的经分离和生物学上纯的微生物和/或本公开的聚生体是来 源于加速微生物选择过程(“ams”过程)。在本公开的一些方面中使用的ams描述于 例如以下文献中：(1)2012年9月20日公开为国际公开案第wo 2012125050 a1号的 国际专利申请案第pct/nz2012/000041号，和(2)2014年3月27日公开为国际公开 案第wo 2014046553 a1号的国际专利申请案第pct/nz2013/000171号，这些pct申 请案中的每一篇以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。ams过程描述于本公 开中，例如图1到4中。
44.然而，在其它实施例中，本公开的微生物不来源于加速微生物选择过程。在一些 方面中，本公开的实施例中使用的微生物是选自资料库中存在的微生物成员。在具体 方面中，本公开的实施例中使用的微生物是基于所述微生物的具体特征而选自资料库 中存在的微生物。
45.本公开假设可通过用经分离的微生物或微生物聚生体以通常无法在植物元件或植 物部分上发现的量涂布所述植物元件或植物部分来使植物元件或植物部分有效扩增。
46.本文中所描述的一些实施例是用于制备农业种子组合物，或种子涂层的方法，其 包含：使种子的表面与包含经纯化的微生物群体的配制物接触，所述经纯化的微生物 群体
包含至少一种对所述种子来说是异源的经分离的微生物。另外实施例需要制备农 业植物组合物，其包含：使植物的表面与包含经纯化的微生物群体的配制物接触，所 述经纯化的微生物群体包含至少一种对所述植物来说是异源的经分离的微生物。
47.在一些方面中，向种子或植物施用本公开的经分离的微生物、微生物聚生体和/或 农业组合物可调节重要的农艺特性。重要的农艺特性可以是例如抗病性、抗旱性、耐 热性、耐寒性、耐盐性、金属耐性、除草剂耐性、化学耐性、经改良的水使用效率、 经改良的氮利用率、经改良的耐缺氮性、经改良的固氮作用、抗虫性、食草动物耐性、 抗病原体性、增加的产量、在水受限条件下增加的产量、健康增强、活力改良、生长 改良、光合作用能力改良、营养增强、改变蛋白质含量、改变含油量、增加生物质量、 增加芽长度、增加根长度、改良根架构、增加种子重量、更快的种子出芽、改变种子 碳水化合物组成、改变种子油组成、结荚的数目、延缓老化、常绿以及改变种子蛋白 质组成。在一些方面中，调节至少2、3、4或更多种重要的农艺特性。在一些方面中， 调节是对一种前述农艺特性的积极作用。
48.在一些方面中，本公开的经分离的微生物、聚生体和/或农业组合物可施用于植物， 以调节或改变植物特征，如改变含油量、改变蛋白质含量、改变种子碳水化合物组成、 改变种子油组成、改变种子蛋白质组成、化学耐性、耐寒性、延缓老化、抗病性、耐 旱性、耳穗重量、生长改良、健康增强、耐热性、除草剂耐性、食草动物耐性、改良 的固氮作用、改良的氮利用、改良的根架构、改良的水使用效率、增加生物质量、降 低生物质量、增加根长度、降低根长度、增加种子重量、增加芽长度、降低芽长度、 增加产量、在水受限条件下增加产量、果仁质量、果仁水分含量、金属耐性、耳穗数 目、每个耳穗的果仁数目、结荚数目、营养增强、抗病原体性、抗虫性、光合作用能 力改良、耐盐性、常绿、活力改良、增加成熟种子的干重、增加成熟种子的鲜重、增 加每个植物的成熟种子的数目、增加叶绿素含量、增加每个植物的结荚数目、增加每 个植物的结荚长度、降低每个植物的凋谢的叶子的数目、降低每个植物的严重凋谢的 叶子的数目以及增加每个植物的未凋谢的叶子的数目、代谢物含量的可检测的调节、 转录物含量的可检测的调节以及与参考植物有关的蛋白质组的可检测的调节。
49.在一些实施例中，本文中教示的农业配制物包含至少一个选自以下组成的组的成 员：农业上相容的载剂、增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗菌剂、除草剂、杀线 虫剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂、灭鼠剂以及营养物。
50.本文所描述的方法可包括使种子或植物与至少100cfu或孢子、至少300cfu或 孢子、至少1,000cfu或孢子、至少3,000cfu或孢子、至少10,000cfu或孢子、至 少30,000cfu或孢子、至少100,000cfu或孢子、至少300,000cfu或孢子、至少 1,000,000cfu或孢子或更多的本文中教示的微生物接触。
51.在本文所描述的方法的一些实施例中，本公开的经分离的微生物以在农业植物的 目标组织内和/或目标组织上可被有效检测的量存在于配制物中。举例来说，在植物的 目标组织中和/或目标组织上检测到至少100cfu或孢子、至少300cfu或孢子、至少 1,000cfu或孢子、至少3,000cfu或孢子、至少10,000cfu或孢子、至少30,000cfu 或孢子、至少100,000cfu或孢子、至少300,000cfu或孢子、至少1,000,000cfu或 孢子或更多的量的微生物。或者或另外，本公开的微生物可按当与未被施用本公开的 配制物的参考农业植物相比时，使被施用这类配制物的植物的生物质量和/或产量有效 增加至少1％、至少2％、至少3％、
至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少 30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％ 或更多的量存在于配制物中。或者或另外，本公开的微生物可按当与未被施用本公开 的配制物的参考农业植物相比时，使被施用这类配制物的植物的相关农艺特点有效地 可检测地调节至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、 至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少 100％或更多的量存在于配制物中。
52.在一些实施例中，本文中教示的农业组合物是耐贮存的。在一些方面中，本文中 教示的微生物是冷冻干燥的。本文中还描述封闭于选自以下组成的组的物件内的多种 经分离的微生物：瓶子、罐子、安瓿、包装袋、容器、包、盒子、储存箱、包膜、纸 盒、容器、筒仓、船运集装箱、车箱以及箱子。
53.在一些方面中，组合所选择的植物物种与所公开的微生物(操作分类单元(otu)、 品系或包含前述各项中的任一种的组合物)可引起改良的作物产量和其产物生产。因此， 在一个方面中，本公开提供第一植物的种子与涂布在所述第一植物的种子的表面上的微生 物制剂的合成组合，使得与未经涂布的参考种子的表面相比，微生物以更高的含量存在于 种子的表面上。在另一方面中，本公开提供第一植物的一部分与涂布在所述第一植物的所 述部分的表面上的微生物制剂的合成组合，使得与未经涂布的参考植物部分相比，微生物 以更高的含量存在于所述第一植物的所述部分的表面上。上述方法可单独使用，或与植物 育种和转基因技术同时使用。
附图说明
54.图1展示所公开的用于加速微生物选择(ams)(在本文中也称为定向微生物选择) 的方法的示意性一般化过程。当在微生物联合体的情形下观察过程时，示意图是微生 物联合体的定向进化过程的说明。所述过程是一种方法，其可用于获得本公开的有益 微生物。
55.图2展示一个实施例的一般化过程流程图，其可用于获得本公开的有益微生物。
56.图3展示一个实施例的图形表示和相关流程图，其可用于获得本公开的有益微生 物。
57.图4展示一个实施例的图形表示和相关流程图，其可用于获得本公开的有益微生 物。
58.图5展示在用个别微生物品系(bci)接种后第七天，小麦的平均总生物质量(鲜 重克数)的图形表示。
59.图6展示在用个别微生物品系处理后第4天，玉米的平均芽长度(毫米)的图形 表示。玉米种子用个别微生物品系(bdnz编号)接种并且经历出芽测试。将种子接 种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个 个别品系各自一式两份地测试。在接种后第4天(dpi)测量芽长度。展示标准误差柱。 结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的，但与活体内水对照物相比，在 接种后第4天(dpi)，一些品系引起芽长度的相对增加。
60.图7展示在用个别微生物品系处理后第4天，玉米的平均根长度(毫米)的图形 表示。玉米种子用个别微生物品系(bdnz编号)接种并且经历出芽测试。将种子接 种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个 个别品系各自一
式两份地测试。在接种后第4天(dpi)测量根长度。展示标准误差柱。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的，但与活体内水对照物相比，在接种后第4天(dpi)，一些品系引起根长度的相对增加。
61.图8展示在用个别微生物品系处理后第4天，小麦的平均芽长度(毫米)的图形表示。小麦种子用个别微生物品系(bdnz编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量芽长度。结果表明所测试的所有品系(》90％)的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(dpi)，一些品系引起芽长度的相对增加。
62.图9展示在用个别微生物品系处理后第4天，小麦的平均根长度(毫米)的图形表示。小麦种子用个别微生物品系(bdnz编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将30个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量根长度。结果表明所测试的所有品系(》90％)的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(dpi)，一些品系引起根长度的相对增加。
63.图10展示在用个别微生物品系处理后第4天，番茄的平均芽长度(毫米)的图形表示。番茄种子用个别微生物品系(bdnz编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将50个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量芽长度。水对照种子的芽的平均长度可见于标记为“h2o”的最右侧柱中。结果表明所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(dpi)，一些品系引起芽长度的相对增加。
64.图11展示在用个别微生物品系处理后第4天，番茄的平均根长度(毫米)的图形表示。番茄种子用个别微生物品系(bdnz编号)接种并且经历出芽测试。将种子接种，置放于湿纸巾上并且辊压。辊在密封塑料袋中在25℃下培育。将50个种子的每个个别品系各自一式两份地测试。在处理后第4天测量根长度。水对照种子的根的平均长度可见于标记为“h2o”的最右侧柱中。结果表明所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并且与活体外水对照物相比，在接种后第4天(dpi)，一些品系引起根长度的相对增加。
65.国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(budapesttreatyontheinternationalrecognitionofthedepositofmicroorganismsforthepurposeofpatentprocedures)
66.在本技术案中描述的微生物保存在农业研究服务培养物收藏中心(agriculturalresearchserviceculturecollection；nrrl)，其是位于1815northuniversitystreet,peoria,il61604,usa的国际保存机构。
67.保存是在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款下进行。
68.保存是根据37c.f.r.
§§
1.801-1.809和专利检查程序手册
§§
2402-2411.05中所阐述的准则进行并且符合所述准则。
69.nrrl寄存编号、保存日期以及关于前述布达佩斯条约保存物的说明提供于表1-3中。
70.表1
71.72.73.74.系的保存物。
81.表3
82.83.84.85.86.87.88.[0089][0090]
*表示已保存并且公众可获得的微生物物种，但所述物种不是确切的bci或bdnz品 系的保存物。
具体实施方式
[0091]
定义
[0092]
尽管相信所属领域的一般技术人员将充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有 助于说明本发明所公开的主题。
[0093]
术语“一(a/an)”是指所述实体中的一个或多个，即可指多个指示物。因而，术语
ꢀ“
一”、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换地使用。此外，通过不定冠词“一
”ꢀ
提及“一个元件”并不排除存在超过一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个 且仅存在一个元件。
[0094]
如本文所使用，术语“微生物体”或“微生物”应广泛考虑。这些术语可互换地使用并 且包括(但不限于)两个原核结构域，细菌和古细菌，以及真核真菌和原生生物。在 一些实施例中，本公开涉及表1-3中的“微生物”，或本公开中多种其它表格中的“微生 物”。这种表征不仅可以指表格中所鉴别的分类细菌属，而且还可以指所鉴别的分类物 种，以及所述表格中多种新型和新近鉴别的细菌品系。
[0095]
术语“微生物聚生体”或“微生物联合体”是指个别微生物物种的微生物群体的子集， 或物种的品系，其可描述为发挥共同功能，或可描述为参与或引起可识别的参数或植 物表现型特性或与其相关联。所述群体可包含微生物的两种或更多种物种，或物种的 品
系。在一些情况下，微生物以共生方式在群体内共存。
[0096]
术语“微生物群体”意指包含两种或更多种物种或品系的微生物群组。与微生物聚 生体不同，微生物群体未必发挥共同功能，或未必参与或引起可识别的参数或植物表 现型特性或与其相关联。
[0097]
术语“加速微生物选择”或“ams”可与术语“定向微生物选择”或“dms”互换使用并 且是指迭代选择方法，其在本公开的一些实施例中用于衍生所要求的微生物物种或所 述物种的聚生体。
[0098]
如本文中所使用，“分离物”、“经分离的”、“经分离的微生物”和类似术语意图指从 至少一种在具体环境(例如土壤、水、植物组织)中与其相关联的材料分离的一种或 多种微生物。
[0099]
因此，“经分离的微生物”并不存在于其天然存在的环境中；实际上，通过本文中 所描述的多种技术从其天然环境移出微生物并且处于非天然存在状态。因此，经分离 的品系可以例如与农业载剂结合的生物学上纯的培养物或孢子形式(或品系的其它形 式)存在。
[0100]
在本公开的某些方面中，经分离的微生物以经分离和生物学上纯的培养物形式存 在。所属领域的技术人员应了解，具体微生物的经分离和生物学上纯的培养物表示所 述培养物基本上不含(在科学原因内)其它活的生物体并且仅含有所讨论的个别微生 物。培养物可含有不同浓度的所述微生物。本公开注意到经分离和生物学上纯的微生 物通常“必须不同于不太纯或不纯的材料”。参见例如in re bergstrom,427f.2d 1394, (ccpa 1970)(讨论纯化的前列腺素)，还参见in re bergy,596f.2d 952(ccpa 1979)(讨 论纯化的微生物)，还参见parke-davis和co.v.h.k.mulford和co.,189f.95(s.d.n.y. 1911)(learned hand，讨论纯化的肾上腺素)，aff'd in part,rev'd in part,196f.496(1912 年第2期)，其中每一个以引用的方式并入本文中。此外，在一些方面中，本公开提供 必须在经分离和生物学上纯的微生物培养物内发现的浓度或纯度界限的某些定量测量 值。在某些实施例中，存在这些纯度值是可区分本发明所公开的微生物与以天然状态 存在的微生物的另一种属性。参见例如merck&co.v.olin mathieson chemical corp., 253f.2d 156(1958年第4期)(讨论由微生物产生的维生素b12的纯度界限)，其以引 用的方式并入本文中。
[0101]
如本文中所使用，“个别分离物”应视为指在与一种或多种其它微生物分离之后， 主要包含微生物的单一属、物种或品系的组合物或培养物。片语不应视为指示微生物 的分离或纯化程度。然而，“个别分离物”可基本上仅包含微生物的一种属、物种或品 系。
[0102]
如本文中所使用，术语“生长培养基”是任何适合于支持植物生长的培养基。作为 实例，培养基可以是天然或人造的，包括(但不限于)：土壤、盆栽混合土、树皮、蛭 石、单独的并且施用于固体植物支持系统的水耕溶液以及组织培养凝胶。应了解，培 养基可单独使用或与一种或多种其它培养基组合使用。其还可以在添加或不添加用于 根和叶子的外源营养物和物理支持系统的情况下使用。
[0103]
在一个实施例中，生长培养基是天然存在的培养基，如土壤、砂、泥浆、粘土、 腐殖质、表土、岩石或水。在另一实施例中，生长培养基是人造的。这类人造的生长 培养基可构筑成模拟天然存在的培养基的条件；然而，这并非必需的。人造的生长培 养基可由任何数目的材料中的一种或多种和其组合制成，包括砂、矿物质、玻璃、岩 石、水、金属、盐、营养
物、水。在一个实施例中，生长培养基是无菌的。在另一实 施例中，生长培养基不是无菌的。
[0104]
培养基可被改善或富含其它化合物或组分，例如可有助于微生物与植物的特定群 体以及彼此的相互相用和/或选择的组分。举例来说，可存在抗生素(如青霉素)或灭 菌剂(例如季铵盐和氧化剂)和/或可改善生理条件(如盐度、植物营养物(例如有机 和无机矿物质(如磷、氮盐、氨、钾和微量养分，如钴和镁)、ph值和/或温度)。
[0105]
如本文中所使用，术语“植物”包括完整植物或其任何部分或衍生物，如植物细胞、 植物原生质体、可使植物再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、胚芽、花粉、 胚珠、果实、花朵、叶子、种子、根根端等。
[0106]
如本文所使用，术语“栽培品种”是指已通过园艺或农艺技术产生并且通常不发现 于野生型群体中的植物品种、品系或族类。
[0107]
如本文中所使用，术语“双子叶植物(dicotyledon/dicot)”和“双子叶”是指具有胚 芽的开花植物，所述胚芽含有两个子叶。如本文中所使用，术语“单子叶植物 (monocotyledon/monocot)”和“单子叶”是指具有仅含有一个子叶的胚芽的开花植物。 这些群组之间当然存在其它已知的差异，其将由所属领域的技术人员容易地识别。
[0108]
如本文中所使用，“经改良”应广泛地用于涵盖与对照植物相比，或与所讨论的特 征相关联的已知平均数量相比，植物的特征的改良。举例来说，与施用本公开的有益 微生物或聚生体相关联的“经改良”植物生物质量可通过比较由本文中教示的微生物处 理的植物的生物质量与未经处理的对照植物的生物质量来证明。或者，可以比较由本 文中教示的微生物处理的植物的生物质量与既定植物通常达到的平均生物质量(如所 属领域的技术人员已知的科学或农业出版物中表示)。在本公开中，“经改良”未必需要 资料是统计显著的(即p《0.05)；实际上，任何表明一个值(例如平均处理值)与另一 个值(例如平均对照值)的可定量差异可上升到“经改良”的程度。
[0109]
如本文中所使用，“抑制和抑止”和类似术语不应解释为需要完全抑制或抑止，但 在一些实施例中可能需要这种作用。
[0110]
如本文中所使用，术语“基因型”是指个别细胞、细胞培养物、组织、生物体(例 如植物)或生物体群组的基因组成。
[0111]
如本文中所使用，术语“等位基因”意指基因的一种或多种替代形式中的任一种， 其中所有等位基因涉及至少一种特性或特征。在二倍体细胞中，既定基因的两个等位 基因占据一对同源染色体上的相应基因座。在实施例中，因为本公开涉及qtl，即可 包含一种或多种基因或调节序列的基因组区域，在一些情况下，称为“单倍型”(即染 色体区段的等位基因)比“等位基因”更准确，然而，在那些实例中，术语“等位基因
”ꢀ
应理解为包含术语“单倍型”。等位基因在其表达类似表现型时被视为一致。序列中可 能存在差异，但并不重要，只要其不影响表现型即可。
[0112]
如本文中所使用，术语“基因座(locus)”(基因座(loci)的复数形式)意指可发 现例如基因或基因标记物的染色体上的特定位置或位点。
[0113]
如本文中所使用，术语“以基因方式连接”是指在育种期间，两种或更多种特性以 高比率共同遗传，使得其难以通过杂交来分离。
[0114]
如本文所使用，“重组”或“重组事件”是指染色体交叉或独立分类。术语“重组”是指 具有作为重组事件的结果产生的新基因组成的植物。
[0115]
如本文中所使用，术语“分子标记物”或“基因标记物”是指在用于观察核酸序列特征 中的差异的方法中使用的指示物。这类指示物的实例是限制性片段长度多形现象(rflp)标记物、经扩增的片段长度多形现象(aflp)标记物、单核苷酸多态性(snp)、 插入突变、微卫星标记物(ssr)、经序列表征的扩增区域(scar)、经裂解的扩增多 晶序列(caps)标记物或同工酶标记物或本文中所描述的标记物的组合(其定义特定 基因和染色体位置)。等位基因附近分子标记物的定位是可由有分子生物技术经验的普 通人执行的程序。
[0116]
如本文中所使用，术语“特性”是指特征或表现型。举例来说，在本公开的一些实 施例的情形下，作物产量涉及由植物产生的可销售生物质量(例如果实、纤维、谷物) 的量。所需特性还可以包括其它植物特征，包括(但不限于)：水使用效率、营养物使 用效率、生产率、机械收割能力、果实成熟期、存放期、抗虫性/抗病性、早期植物成 熟期、耐胁迫性等。特性可以显性或隐性方式，或以部分或不完全显性方式遗传。特 性可以是单基因性(即由单个基因座决定)或多基因性(即由超过一个基因座决定) 或也可以由一种或多种基因与环境的相互相用产生。
[0117]
显性特性引起在异型接合或同型接合状态下的完全表现型表现；隐性特性仅当在 同型接合状态下存在时显示本身。
[0118]
在本公开的情形下，特性也可以由一种或多种植物基因与一种或多种微生物基因 的相互相用产生。
[0119]
如本文中所使用，术语“同型接合”意指当两个一致的等位基因驻存在特定基因座， 但个别地安置在二倍生物体的细胞中的相应同源染色体对上时存在的基因条件。相反， 如本文中所使用，术语“异型接合”意指当两个不同等位基因驻存在特定基因座，但个 别地安置在二倍生物体的细胞中的相应同源染色体对上时存在的基因条件。
[0120]
如本文中所使用术语“表现型”是指个别细胞、细胞培养物、生物体(例如植物) 或生物体群体的可观察的特征，其由个体的基因组成(即基因型)与环境之间的相互 相用产生。
[0121]
如本文中所使用，当描述核酸序列或蛋白质序列时，术语“嵌合”或“重组”是指将至 少两个异源聚核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子，或使至少一个天然核酸或蛋 白质序列的一个或多个元件重新排列的核酸或蛋白质序列。举例来说，术语“重组”可 指序列中两个以其它方式分离的区段的人造组合，例如通过化学合成或通过遗传工程 改造技术操作核酸中经分离的区段。
[0122]
如本文中所使用，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是已知在自然界中不存 在或不是天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其它天然存在的核苷酸序列相比时， 这类合成核苷酸序列将包含至少一种核苷酸差异。
[0123]
如本文中所使用，术语“核酸”是指具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核 糖核苷酸)的聚合形式，或其类似物。这一术语是指分子的初始结构，并且因此包括 双股和单股dna，以及双股和单股rna。其还包括经修饰的核酸，如甲基化和/或封 端核酸、含有经修饰的碱基、主链修饰的核酸等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换地 使用。
[0124]
如本文中所使用，术语“基因”是指与生物功能相关联的任何dna区段。因此，基 因包括(但不限于)编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还可以包括未表达的 dna区段，其例如形成其它蛋白质的识别序列。基因可从多种来源获得，包括从相关 来源克隆或
从已知或预测的序列信息合成，并且可包括设计成具有所需参数的序列。
[0125]
如本文中所使用，术语“同源”或“同源物”或“直系同源物”是所属领域中已知的并且 是指共有共同的祖先或家族成员并且基于序列一致性程度测定的相关序列。术语“同源 性”、“同源”、“大体上类似”和“基本上对应”在本文中可互换地使用。其是指其中在一 个或多个核苷酸碱基中的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生某一表现型的能力 的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰，如一个或多个与初始、未经修 饰的片段相比不显著改变所得核酸片段的功能特性的核苷酸的缺失或插入。因此，应 理解，如所属领域的技术人员将了解，本公开涵盖超过特定例示性序列。这些术语描 述在一种物种、亚种、变种、栽培品种或品系中发现的基因与另一种物种、亚种、变 种、栽培品种或品系中的相应或等效基因之间的关系。在本公开中，比较同源序列。 认为、相信或已知“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”是功能相关的。功能关系可以 多种方式中的任一种表示，包括(但不限于)：(a)序列一致性程度和/或(b)相同或 类似的生物功能。优选的是，指示(a)和(b)。同源性可使用所属领域中容易获得的 软件程序测定，如《最新分子生物学实验方法汇编(current protocols in molecularbiology)》(f.m.ausubel等人编,1987)增刊30,章节7.718,表7.71中讨论的软件程序。 一些比对程序是macvector(oxford molecular ltd，英国牛津布(oxford,u.k.))、alignplus(scientific and educational software，宾夕法尼亚州(pennsylvania))以及alignx (vector nti，invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca))。另一种比对程序 是sequencher(gene codes，密歇根安娜堡(ann arbor,michigan))，其使用默认参数。
[0126]
如本文中所使用，术语“核苷酸变化”是指例如核苷酸取代、缺失和/或插入，如在 所属领域中良好理解。举例来说，突变含有可产生沉默取代、添加或缺失，但不改变 所编码的蛋白质的特性或活性或如何制得蛋白质的变化。
[0127]
如本文中所使用，术语“蛋白质修饰”是指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/ 或插入，如在所属领域中良好理解。
[0128]
如本文中所使用，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”意指具有这类序列的最 小尺寸特征的部分，或全长分子任何更大的片段，最多是并且包括全长分子。本公开 的聚核苷酸的片段可编码基因调节元件的生物活性部分。基因调节元件的生物活性部 分可通过分离本公开的一种聚核苷酸中包含基因调节元件的部分并且如本文中所描述 评估活性来制备。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、 7个氨基酸等，最多是全长多肽。待使用的部分的长度将取决于具体应用。适用作杂交 探针的核酸部分可短到12个核苷酸；在一些实施例中，其是20个核苷酸。适用作抗 原决定基的多肽部分可短到4个氨基酸。多肽中发挥全长多肽功能的部分将通常长于4 个氨基酸。
[0129]
变异型聚核苷酸还涵盖来源于突变诱发和诱重组程序(如dna改组)的序列。这 类dna改组的策略是所属领域中已知的。参见例如stemmer(1994)《美国国家科学 院院刊(pnas)》91:10747-10751；stemmer(1994)《自然(nature)》370:389-391； crameri等人(1997)《自然生物技术(nature biotech.)》15:436-438；moore等人(1997) 《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》272:336-347；zhang等人(1997)《美国国家科学院 院刊》94:4504-4509；crameri等人(1998)《自然》391:288-291；以及美国专利第5,605,793 号和第5,837,458号。对于本文公开的聚核苷酸的pcr扩增，寡核苷酸引物可设计成 用于pcr反应以由从任何相
关植物提取的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。 用于设计pcr引物和pcr克隆的方法是所属领域中通常已知的并且公开于sambrook 等人(1989)《分子克隆实验指南(molecular cloning:a laboratory manual)》(第2版， cold spring harbor laboratory press，纽约普莱恩维尤(plainview,new york))。还参见 innis等人编(1990)《pcr方案：方法和应用指导(pcr protocols:a guide to methods andapplications)》(academic press，纽约)；innis和gelfand编(1995)《pcr策略(pcrstrategies)》(academic press，纽约)；以及innis和gelfand编(1999)《pcr方法手册(pcr methods manual)》(academic press，纽约)。已知的pcr方法包括(但不限于)使 用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性 引物、部分不匹配引物等的方法。
[0130]
如本文所使用，术语“引物”是指能够粘接到允许dna聚合酶连接的扩增目标的寡 核苷酸，从而在处于诱导引物延伸产物合成的条件下(即在核苷酸和用于聚合的试剂 (如dna聚合酶)存在下和在适合的温度和ph值下)充当dna合成的起始点。(扩 增)引物优选是单股以获得扩增中的最大功效。优选的是，引物是寡脱氧核苷酸。引 物必须足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取 决于多种因素，包括引物的温度和组成(a/t对比g/c含量)。一对双向引子由一个正 向和一个反向引物组成，如在dna扩增(如pcr扩增)领域中通常使用。
[0131]
术语“严格度”或“严格杂交条件”是指影响杂交物的稳定性的杂交条件，例如温度、 盐浓度、ph值、甲酰胺浓度等。这些条件可凭经验最佳化以最大化特异性结合和最小 化引物或探针与其目标核酸序列的非特异性结合。所使用的术语包括提及探针或引物 将与其目标序列杂交的条件，达到与其它序列相比可检测地更大的程度(例如比背景 大至少2倍)。严格条件具有序列依赖性并且将在不同情形下不同。更长序列在更高温 度下特异性地杂交。通常，选择严格条件比既定离子强度和ph值下的特异性序列的热 熔点(tm)低约5℃。tm是使50％的互补目标序列与完全匹配的探针或引物杂交的温 度(在既定离子强度和ph值下)。通常，严格条件将是其中在ph 7.0到8.3下盐浓度 小于约1.0mna+离子，通常是约0.01到1.0m na+离子浓度(或其它盐)，并且温度是 至少约30℃(对于短探针或引子(例如10到50个核苷酸))和至少约60℃(对于长 探针或引子(例如大于50个核苷酸))的条件。严格条件也可以用添加去稳定化剂(如 甲酰胺)来实现。例示性低严格度条件或“降低的严格度的条件”包括在37℃下与具有 30％甲酰胺、1m nacl、1％sds的缓冲溶液杂交并且在40℃下，在2
×
ssc中洗涤。 例示性高严格度条件包括在37℃下，在50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中杂交，并且 在60℃下，在0.1
×
ssc中洗涤。杂交程序是所属领域中是众所周知的并且由例如ausubel 等人,1998和sambrook等人,2001描述。在一些实施例中，严格条件是在45℃下，在 含有1mm na2edta、0.5-20％十二烷基硫酸钠的0.25m na2hpo4缓冲液(ph 7.2) 杂交，如0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、 14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，接着在55℃到65℃下，在含有0.1％(w/v) 十二烷基硫酸钠的5
×
ssc中洗涤。
[0132]
如本文中所使用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能性rna的表达的dna 序列。启动子序列由接近和更靠近末端的上游元件组成，后一种元件通常称为强化子。 因此，“强化子”是可以刺激启动子活性的dna序列，并且可以是启动子的固有元件或 被插入以增强启动子的含量或组织特异性的异源元件。启动子可完全来源于原生基因， 或由来源于在
自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成dna区 段。所属领域的技术人员应理解，不同启动子可引导不同组织或细胞类型中基因的表 达，或处于不同发育阶段，或响应不同的环境条件。还认识到，因为在大多数情况下， 未完全界定调节序列的准确边界，一些变异形式的dna片段可具有一致的启动子活 性。
[0133]
如本文中所使用，“植物启动子”是能够引发植物细胞中的转录的启动子，无论其 来源是否是植物细胞，例如众所周知的是农杆菌属(agrobacterium)启动子在植物细 胞中具有功能性。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒和细菌(如农杆菌属和短 根瘤菌属(bradyrhizobium)细菌)获得的启动子dna。植物启动子可以是组成性启 动子或非组成性启动子。
[0134]
如本文中所使用，“组成性启动子”是在大部分条件下和/或在大部分发展阶段期间 具有活性的启动子。在用于植物生物技术的表达载体中使用组成性启动子存在若干优 势，如：用于选择转基因细胞或植物的蛋白质的高生产水准；报告蛋白质或评估标记 物的高表达水准，使得易于检测和定量；作为调节转录系统的一部分的转录因子的高 生产水准；生产在植物中需要普遍存在的活性的化合物；和生产在植物发育的所有阶 段期间所需的化合物。非限制性例示性组成性启动子包括camv 35s启动子、冠瘿碱 启动子、泛素启动子、醇脱氢酶启动子等。
[0135]
如本文中所使用，“非组成性启动子”是在某些条件下、在某些类型的细胞中和/或 在某些发育阶段期间具有活性的启动子。举例来说，组织特异性、组织优先、细胞类 型特异性、细胞类型优先、诱导型启动子和在发育控制下为非组成性启动子的启动子。 在发育控制下的启动子的实例包括优先起始在某些组织，如茎、叶子、根或种子中的 转录的启动子。
[0136]
如本文中所使用，“诱导型”或“阻抑型”启动子是在化学或环境因素控制下的启动 子。可能影响通过诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或某些化学物 质或存在光。
[0137]
如本文中所使用，“组织特异性”启动子是仅仅在某些组织中起始转录的启动子。 不同于基因的组成性表达，组织特异性表达是若干相互作用水准的基因调节的结果。 因此，在所属领域中，有时优选的是使用来自同源或紧密相关植物物种的启动子以实 现转基因在具体组织中的有效和可靠表达。这是大量从具体植物和组织分离的组织特 异性启动子发现于科学和专利文献中的主要原因之一。
[0138]
如本文中所使用，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列的偶联，使 得一个核酸序列的功能由另一个调节。举例来说，启动子在其能够调节编码序列的表 达时与所述编码序列可操作地连接(即，编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列 可以正义或反义定向可操作地连接于调节序列。在另一实例中，本公开的互补rna区 域可以使5'与目标mrna可操作地连接(直接或间接)，或使3'与目标mrna可操作 地连接，或在目标mrna内，或针对目标mrna来说，第一互补区域是5'并且其补体 是3'。
[0139]
如本文中所使用，短语“重组型构筑体”、“表达构筑体”、“嵌合构筑体”、“构筑体
”ꢀ
以及“重组型dna构筑体”在本文中可互换地使用。重组型构筑体包含核酸片段(例如 在自然界中未发现在一起的调节和编码序列)的人造组合。举例来说，嵌合构筑体可 以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于同一来源的调节序列和编码 序列，但其以与在自然界中发现的方式不同的方式排列。这类构筑体可单独使用或可 与载体结合使用。
然界中未在上面发现其的植物组织上。举例来说，如果既定微生物仅在既定植物的根 上天然存在，那么所述微生物可以外源方式施用于植物的地上组织并且将因此“以外源 方式安置”在所述植物组织上。同样，当施用于不天然具有微生物或不天然具有所施用 的数目的微生物的植物上时，所述微生物视为以外源方式安置。
[0145]
本文中的组合物和方法可向宿主植物提供改良的“农艺特性”或“重要的农艺特性”， 其可包括(但不限于)以下：与从不具有所述种子处理剂配制物的种子生长的等值植 物相比，改变含油量、改变蛋白质含量、改变种子碳水化合物组成、改变种子油组成 以及改变种子蛋白质组成、化学耐性、耐寒性、延缓老化、抗病性、耐旱性、耳穗重 量、生长改良、健康增强、耐热性、除草剂耐性、食草动物耐性、改良氮固定、改良 氮利用、改良根架构、改良水使用效率、增加生物质量、增加根长度、增加的种子重 量、增加芽长度、增加的产量、在水有限条件下增加产量、果仁质量、果仁水分含量、 金属耐性、耳穗数目、每个耳穗的果仁数目、结荚编号、营养增强、抗病原体性、抗 虫性、光合作用能力改良、耐盐性、常绿、活力改良、增加成熟种子的干重、增加成 熟种子的鲜重、增加每个植物的成熟种子的数目、增加叶绿素含量、增加每个植物的 结荚数目、增加每个植物的结荚长度、降低每个植物的凋谢的叶子的数目、降低每个 植物的严重凋谢的叶子的数目以及增加每个植物的未凋谢的叶子的数目、代谢物含量 的可检测的调节、转录物含量的可检测的调节以及蛋白质组的可检测的调节。
[0146]
由本公开的微生物和聚生体赋予既定植物物种有益特性的能力
[0147]
本公开利用微生物赋予所需植物物种(如相关农艺物种)有益性质(或有益特性)。 在本公开中，术语“有益性质”或“有益特性”可以互换地使用并且表示通过施用如本文中 所描述的微生物或微生物聚生体来调节相关的所需植物表现型或基因性质。如前所述， 在一些方面中，可能极佳的是由既定微生物产生的代谢物最终负责调节或赋予既定植 物有益特性。
[0148]
存在许多可通过施用本公开的微生物来调节的有益特性。举例来说，微生物可具 有赋予植物物种一种或多种有益性质的能力，例如：增加生长、提高产量、提高氮利 用效率、提高耐胁迫性、提高耐旱性、提高光合率、增强水使用效率、提高抗病原体 性、未必影响植物产量，但实际上解决植物功能性，引起植物提高相关代谢物的产生 的对植物架构的修改等。
[0149]
在一些方面中，本文中教示的微生物提供广泛范围的农业应用，包括：改良谷物、 果实和花朵产量；改良植物部分的生长；改良抗病性；改良在极端气候中的存活率； 以及改良其它所需植物表现型特征。
[0150]
在一些方面中，可向植物施用本公开的经分离的微生物、聚生体和/或农业组合物， 以调节或改变植物特征，如改变含油量、改变蛋白质含量、改变种子碳水化合物组成、 改变种子油组成、改变种子蛋白质组成、化学耐性、耐寒性、延缓老化、抗病性、耐 旱性、耳穗重量、生长改良、健康增强、耐热性、除草剂耐性、食草动物耐性、改良 的固氮作用、改良的氮利用、改良的根架构、改良的水使用效率、增加生物质量、增 加根长度、增加种子重量、增加芽长度、增加产量、在水受限条件下增加产量、果仁 质量、果仁水分含量、金属耐性、耳穗数目、每个耳穗的果仁数目、结荚数目、营养 增强、抗病原体性、抗虫性、光合作用能力改良、耐盐性、常绿、活力改良、增加成 熟种子的干重、增加成熟种子的鲜重、增加每个植物的
成熟种子的数目、增加叶绿素 含量、增加每个植物的结荚数目、增加每个植物的结荚长度、降低每个植物的凋谢的 叶子的数目、降低每个植物的严重凋谢的叶子的数目以及增加每个植物的未凋谢的叶 子的数目、代谢物含量的可检测的调节、转录物含量的可检测的调节以及与参考植物 有关的蛋白质组的可检测的调节。
[0151]
在一些方面中，可向植物施用本公开的经分离的微生物、聚生体和/或农业组合物， 以按负性方式调节具体植物特征。举例来说，在一些方面中，本公开的微生物能够降 低相关表现型特性，如可能在一些应用中需要这种功能性。举例来说，本公开的微生 物可具有降低根生长或降低根长度的能力。或微生物可具有降低发芽生长或降低植物 成长速度的能力，如在某些应用中需要植物特性的这些调节。
[0152]
经分离的微生物-表1-3
[0153]
在各方面中，本公开提供经分离的微生物，包括所鉴别的微生物物种的新品系， 其呈现于表1-3中。
[0154]
在其它方面中，本公开提供表1-3中鉴别的物种和品系的经分离的完整微生物培 养物。这些培养物可包含多种浓度的微生物。
[0155]
在各方面中，本公开提供在农业中利用选自表1-3的微生物。
[0156]
在一些实施例中，本公开提供属于以下属的经分离的微生物物种：固氮菌属(azotobacter)、固氮螺旋菌属(azospirillum)、芽孢杆菌属(bacillus)、芽生杆菌属 (bosea)、柄杆菌属(caulobacter)、杜擀氏菌属(duganella)、黄杆菌属(flavobacterium)、 草螺菌属(herbaspirillum)、橙黄杆菌属(luteibacter)、马赛菌属(massilia)、粘液杆 菌属(mucilaginibacter)、泛菌属(pantoeo)、类芽孢杆菌属(paenibacillus)、极单胞 菌属(polaromonas)、杜擀氏菌属(pseudoduganella)、假单胞菌属(pseudomonas)、 拉恩氏菌属(rahnella)、拉力菌属(ramlibacter)、根瘤菌属(rhizobium)、赤球菌屬 (rhodococcus)、红育菌属(rhodoferax)、鞘氨醇杆菌属(sphingobium)以及寡养单胞 菌属(stenotrophomonas)。
[0157]
在一些实施例中，在农业中利用来自芽生杆菌属的微生物以赋予植物物种一种或 多种有益特性。
[0158]
在一些实施例中，本公开提供经分离的微生物物种，其选自以下组成的组：褐球 固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、荧光假单胞菌、稻皮假单胞菌、恶臭 假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤球菌以及嗜麦芽窄食单胞菌。
[0159]
在一些实施例中，本公开提供物种的新型经分离的微生物，其选自以下组成的组： 褐球固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、荧光假单胞菌、稻皮假单胞菌、 恶臭假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤球菌以及嗜麦芽窄食单胞菌。这 些前述物种的具体新品系可见于表1-3中。
[0160]
此外，本公开涉及具有与表1-3中鉴别的微生物的特征基本上类似的特征的微生 物。
[0161]
本公开中鉴别的经分离的微生物物种和所述物种的新品系能够赋予目标植物物种 有益性质或特性。
[0162]
举例来说，表1-3中描述的经分离的微生物或所述微生物的聚生体能够改良植物 健康和活力。可定量测量改良的植物健康和活力，例如通过测量所述微生物应用对植 物表
现型或基因型特性的作用。
[0163]
微生物聚生体-表1-3
[0164]
在各方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表1中鉴别的微生物的至少 任何两种微生物的组合。
[0165]
在其它方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表2中鉴别的微生物的至 少任何两种微生物的组合。
[0166]
在其他方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表3中鉴别的微生物的至 少任何两种微生物的组合。
[0167]
并且，本公开提供微生物聚生体，其包含选自表1-3中鉴别的微生物的至少任何 两种微生物的组合。
[0168]
在某些实施例中，本公开的聚生体包含两种微生物，或三种微生物，或四种微生 物，或五种微生物，或六种微生物，或七种微生物，或八种微生物，或九种微生物， 或十种或更多种微生物。聚生体中的所述微生物是不同微生物物种，或微生物物种的 不同品系。
[0169]
在一些实施例中，本公开提供聚生体，其包含：至少两种属于以下属的经分离的 微生物物种：固氮菌属、固氮螺旋菌属、芽孢杆菌属、芽生杆菌属、柄杆菌属、杜擀 氏菌属、黄杆菌属、草螺菌属、橙黄杆菌属、马赛菌属、粘液杆菌属、泛菌属、类芽 孢杆菌属、极单胞菌、杜擀氏菌属、假单胞菌属、拉恩氏菌属、拉力菌属、根瘤菌属、 赤球菌屬、红育菌属、鞘氨醇杆菌属以及寡养单胞菌属。
[0170]
在一些实施例中，本公开提供聚生体，其包含：至少两种选自以下组成的组的经 分离的微生物物种：褐球固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、荧光假单胞 菌、稻皮假单胞菌、恶臭假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤球菌以及嗜 麦芽窄食单胞菌。
[0171]
在一些实施例中，本公开提供聚生体，其包含：物种的至少两种新型经分离的微 生物品系，其选自以下组成的组：褐球固氮菌、成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)、 荧光假单胞菌、稻皮假单胞菌、恶臭假单胞菌、水生拉恩菌、埃特里根瘤菌、红串赤 球菌以及嗜麦芽窄食单胞菌。这些前述物种的具体新品系可见于表1-3中。
[0172]
在具体方面中，本公开提供微生物聚生体，其包含如表4-10中分组的物种。关于 表4-10，字母a到i表示本公开的微生物的非限制性选择，其定义为：
[0173]
a＝表1中鉴别的褐球固氮菌和相关新品系；
[0174]
b＝表1中鉴别的成团泛菌(最近重新分配成瓦氏泛菌)和相关新品系；
[0175]
c＝表1中鉴别的荧光假单胞菌和相关新品系；
[0176]
d＝表1中鉴别的稻皮假单胞菌和相关新品系；
[0177]
e＝表1中鉴别的恶臭假单胞菌和相关新品系；
[0178]
f＝表1中鉴别的水生拉恩菌和相关新品系；
[0179]
g＝表1中鉴别的埃特里根瘤菌和相关新品系；
[0180]
h＝表1中鉴别的红串赤球菌和相关新品系；以及
[0181]
i＝表1中鉴别的嗜麦芽窄食单胞菌和相关新品系。
[0182]
表4：八种和九种品系的聚生体
[0183][0184]
表5：七种品系的聚生体
[0185][0186][0187]
表6：六种品系的聚生体
[0188][0189]
表7：五种品系的聚生体
[0190]
[0191][0192]
表8：四种品系的聚生体
[0193]
例可见于gerhardt,p.(编),《一般和分子微生物学方法(methods for general andmolecular microbiology)》,美国微生物学会(american society for microbiology), washington,d.c.(1994)和lennette,e.h.(编),《临床微生物学手册(manual of clinicalmicrobiology)》,第三版,美国微生物学会,washington,d.c.(1980)，其皆以引用的方 式并入本文中。
[0205]
分离可通过将样品以条纹形式置放于固体培养基(例如营养物琼脂板)上以获得 单个群落(其特征在于上文描述的表现型特性(例如革兰氏阳性/阴性(grampositive/negative)、能够以好氧/厌氧方式形成孢子、细胞形态、碳源代谢、酸/碱产生、 酶分泌、代谢分泌物等)和降低用变得被污染的培养物进行操作的可能性来实现。
[0206]
举例来说，对于本公开的经分离的细菌，生物学上纯的分离物可通过生物样品的 重复继代培养获得，在每次继代培养之后以条纹方式置放于固体培养基上以获得个别 群落。制备冻干细菌、使其解冻和生长的方法是众所周知的，例如gherna,r.l.和c.a. reddy.2007,《培养物保藏(culture preservation)》,第1019-1033页,c.a.reddy,t.j. beveridge,j.a.breznak,g.a.marzluf,t.m.schmidt和l.r.snyder编,美国微生物学 协会,washington,d.c.,1033页；其以引用的方式并入本文中。因此，涵盖在含有甘油 的溶液中，在-70℃下冷冻长期储存的经干燥的液体配制物和培养物以用于提供本发明 的配制物。
[0207]
本公开的细菌可在好氧条件下，在液体培养基中繁殖。用于使本公开的细菌菌株 生长的培养基包括碳源、氮源和无机盐，以及特殊需要的物质，如维生素、氨基酸、 核酸等。可用于使细菌菌株生长的适合的碳源的实例包括(但不限于)淀粉、蛋白胨、 酵母提取物、氨基酸、糖，如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡糖胺、麦芽糖等；有机 酸(如乙酸、反丁烯二酸、己二酸、丙酸、柠檬酸、葡糖酸、苹果酸、丙酮酸、丙二 酸等)的盐；醇，如乙醇和甘油等；油或脂肪，如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、 芝麻油。所添加的碳源的量根据碳源种类而变化并且通常在每升培养基1到100克之 间。优选的是，培养基中含有0.1-5％(w/v)的浓度的葡萄糖、淀粉和/或蛋白胨作为 主要碳源。可用于使本发明的细菌菌株生长的适合的氮源的实例包括(但不限于)氨 基酸、酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉提取物、蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫 酸铵、磷酸铵、氨或其组合。氮源的量根据氮源的类型而变化，通常在每升培养基0.1 到30克之间。无机盐、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫 酸铁、硫酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、 氯化钙、氯化钠、碳酸钙、碳酸钠可单独或以组合形式使用。无机酸的量根据无机盐 的种类而变化，通常在每升培养基0.001到10克之间。特殊需要的物质的实例包括(但 不限于)维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉类提取物、麦芽提取物、干燥酵母 和其组合。培养可在实现细菌菌株生长的温度下实现，基本上在20℃与46℃之间。在 一些方面中，温度范围是30℃-37℃。对于最佳生长，在一些实施例中，可将培养基调 节到ph 7.0-7.4。应了解，还可以使用市售培养基培养细菌菌株，如可从密歇根州底特 律(detroit,mi)的difco购得的nutrient broth或nutrient agar。应了解，培养时间可 视所使用的培养基类型和作为主要碳源的糖的浓度而不同。
[0208]
在各方面中，培养持续24-96小时。使用所属领域中是众所周知的方法分离由此获 得的细菌细胞。实例包括(但不限于)薄膜过滤和离心分离离心分离。可使用氢氧化 钠等调
中已知16s rrna含有高变区，其可提供适用于细菌鉴别的物种/品系特异性标记序列。 在本公开中，通过部分(500-1200bp)16s rrna序列标记来鉴别许多微生物。在各方 面中，每个品系代表选自琼脂盘的纯的群落分离物。基于琼脂培养基上群落的任何既 定形态特征来进行选择，以表示所存在的生物体的多样性。在实施例中，所使用的培 养基是r2a、pda、无氮型半固体培养基或mrs琼脂。在24小时生长之后进行每个
‘
经 挑选’的分离物的群落说明并且接着输入到我们的资料库中。接着获得每个分离物的序 列资料。
[0218]
使用16s rrna基因的系统发生的分析用于定义属于共同属的“大体上类似”物种 以及定义既定分类物种的“大体上类似”品系。此外，我们记录分离物的生理学和/或生 物化学特性，其可用于突出可引起植物的有利状态的品系之间的较小和显著差异。
[0219]
农业组合物
[0220]
在一些实施例中，本公开的微生物组合成农业组合物。在一些实施例中，本公开 的农业组合物包括(但不限于)：湿润剂、相容剂(也称为“相容性试剂”)、消泡剂、 清洗剂、螯合剂、防飘移剂、中和剂和缓冲剂、腐蚀抑制剂、染料、气味剂、扩展剂 (也称为“散布剂”)、渗透助剂(也称为“渗透剂”)、粘着剂(也称为“粘合剂”或“结合剂”)、 分散剂、增稠剂(也称为“稠化剂”)、稳定剂、乳化剂、冷冻点抑制剂、抗菌剂等。
[0221]
在一些实施例中，本公开的农业组合物是固体。当使用固体组合物时，可能需要 包括一种或多种载剂材料以及活性经分离的微生物或聚生体。在一些实施例中，本公 开教示载剂的用途，包括(但不限于)：矿物质土，如二氧化硅、二氧化硅凝胶、硅酸 盐、滑石、高岭土、美国活性白土(limestone)、石灰石、白垩、黄土、粘土、白云石、 硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、经研磨的合成材料、肥料(如硫酸铵)、磷酸铵、 硝酸铵、硫脲和脲、植物来源产物(谷粉、树皮粉、木粉以及果壳粉)、纤维素粉末、 绿坡缕石、蒙脱石、云母、蛭石、合成二氧化硅和合成硅酸钙，或这些物质的组合物。
[0222]
在一些实施例中，本公开的农业组合物是液体。因此，在一些实施例中，本公开 教示的是，本文中公开的农业组合物可包括化合物或盐，如单乙醇胺盐、硫酸钠、硫 酸钾、氯化钠、氯化钾、乙酸钠、硫酸氢铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、草酸铵、碳 酸铵、碳酸氢铵、硫代硫酸铵、二磷酸氢铵、单磷酸二氢铵、磷酸氢钠铵、硫氰酸铵、 氨基磺酸铵或氨基甲酸铵。
[0223]
在一些实施例中，本公开教示的是，农业组合物可包括结合剂，如：聚乙烯吡咯 烷酮、聚乙烯醇、部分水解的聚乙酸乙烯酯、羧基甲基纤维素、淀粉、乙烯吡咯烷酮/ 乙酸乙烯酯共聚物以及聚乙酸乙烯酯，或这些物质的组合物；润滑剂，如硬脂酸镁、 硬脂酸钠、滑石或聚乙二醇，或这些物质的组合物；消泡剂，如聚硅氧乳液、长链醇、 磷酸酯、乙炔二醇、脂肪酸或有机氟化合物，以及络合剂，如：乙二胺四乙酸(edta) 的盐、三次氮基三乙酸的盐或聚磷酸的盐，或这些物质的组合物。
[0224]
在一些实施例中，农业组合物包含表面活性剂。在一些实施例中，向液体农业组 合物中添加表面活性剂。在其它实施例中，向固体配制物，尤其被设计成在施用之前 用载剂稀释的配制物中添加表面活性剂。因此，在一些实施例中，农业组合物包含表 面活性剂。有时使用表面活性剂(单独或与其它添加剂一起，如矿物质或植物油)作 为佐剂用于喷雾箱混合物以改良微生物对目标的生物性能。用于生物增强剂的表面活 性剂的类型通常取决于微生物的性质和作用模式。表面活性剂的特征可以是阴离子性、 阳离子性或非离子性，并且可用作乳化剂、湿润剂、悬浮剂或用于其它目的。在一些 实施例中，表面活性剂是
非离子物质，如：烷基乙氧基化物、乙氧基化直链脂肪醇以 及乙氧基化脂肪族胺。配制物领域中常用并且还可以用于本发明的配制物中的表面活 性剂描述于《麦克卡森的清洁剂和乳化剂年鉴(mccutcheon's detergents and emulsifiersannual)》,mc publishing corp.,新泽西州里齐伍(ridgewood,n.j.),1998和《表面 活性剂百科全书(encyclopedia of surfactants)》,第i-iii卷,chemical publishing co.,纽 约,1980-81。在一些实施例中，本公开教示表面活性剂的用途，包括芳香族磺酸(例 如木素磺酸、酚磺酸、萘磺酸以及二丁基萘磺酸；芳基磺酸酯、烷基醚、十二烷基醚、 脂肪醇硫酸盐以及脂肪醇二醇醚硫酸盐的脂肪酸)的碱金属、碱土金属或铵盐；磺化 萘和其衍生物其衍生物与甲醛的缩合物；萘的缩合物或萘磺酸与酚和甲醛的缩合物； 酚或酚磺酸与甲醛的缩合物；酚与甲醛和亚硫酸钠的缩合物；聚氧乙烯辛基苯基醚； 乙氧基化异辛基酚、乙氧基化辛基酚或乙氧基化壬基酚；三丁基苯基聚二醇醚；烷基 芳基聚醚醇；异十三基醇；乙氧基化蓖麻油；乙氧基化三芳基酚；乙氧基化磷酸化三 芳基酚的盐；十二烷醇聚二醇醚乙酸盐；山梨糖醇酯；木质素-亚硫酸盐废液或甲基纤 维素，或这些物质的组合物。
[0225]
在一些实施例中，本公开教示其它适合的表面活性剂，包括烷基硫酸酯的盐，如 十二烷基硫酸二乙醇铵；烷基芳基磺酸盐，如十二烷基苯磺酸钙；烷基苯酚-环氧烷加 成产物，如壬基酚-c
18
乙氧基化物；乙醇-环氧烷加成产物，如十三烷基醇-c
16
乙氧基 化物；皂类，如硬脂酸钠；烷基萘-磺酸盐，如二丁基萘磺酸钠；磺基丁二酸盐的二烷 基酯，如二(2-乙基己基)磺基丁二酸钠；山梨糖醇酯，如山梨糖醇油酸酯；季胺，如氯 化十二烷基三甲基铵；脂肪酸的聚乙二醇酯，如聚乙二醇硬脂酸酯；环氧乙烷与环氧 丙烷的嵌段共聚物；单烷基和二烷基磷酸酯的盐；植物油，如大豆油、油菜籽/菜籽油、 橄榄油、蓖麻油、葵花籽油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、棕榈油、花生油、 红花油、芝麻油、桐油等；以及以上植物油的酯，尤其甲酯。
[0226]
在一些实施例中，农业组合物包含湿润剂。湿润剂是在添加到液体中时可通过降 低液体与上面扩散液体的表面之间的界面张力来提高液体的扩散或渗透能力的物质。 处于两种主要功能而在农业化学配制物中使用湿润剂：在处理和制造期间提高粉末在 水中的湿润率以制备可溶性液体浓缩物或悬浮液浓缩物；和在喷雾箱或其它容器中混 合产物与水期间缩短可湿性粉末的湿润时间和改良水进入水分散性颗粒的渗透。在一 些实施例中，本公开的农业组合物(包括可湿性粉末、悬浮液浓缩物以及水分散性颗 粒配制物)中使用的湿润剂的实例是：十二烷基硫酸钠；二辛基磺基丁二酸钠；乙氧 基化烷基酚；以及乙氧基化脂肪醇。
[0227]
在一些实施例中，本公开的农业组合物包含分散剂。分散剂是吸附在粒子表面上 并且有助于保持粒子的分散状态和防止其重新聚集的物质。在一些实施例中，在制造 期间向本公开的农业组合物中添加分散剂以促进分散和悬浮，以及确保粒子在喷雾箱 中重新分散于水中。在一些实施例中，分散剂用于可湿性粉末、悬浮液浓缩物以及水 分散性颗粒中。用作分散剂的表面活性剂具有强力吸附到粒子表面上并且提供针对粒 子的重新聚集的带电或空间障壁的能力。在一些实施例中，最常用的表面活性剂是阴 离子性、非离子性或两种类型的混合物。
[0228]
在一些实施例中，对于可湿性粉末配制物，最常用的分散剂是木素磺酸钠。在一 些实施例中，悬浮液浓缩物使用聚电解质(如萘磺酸钠甲醛缩合物)提供极良好的吸 附和
稳定作用。在一些实施例中，还使用乙氧基化三苯乙烯基苯酚磷酸酯。在一些实 施例中，如烷基芳基乙烯氧化物缩合物和eo-po嵌段共聚物有时与作为分散剂的阴离 子表面活性剂组合以用于悬浮液浓缩物。
[0229]
在一些实施例中，本公开的农业组合物包含聚合表面活性剂。在一些实施例中， 聚合表面活性剂极长的疏水性
‘
骨架’和许多环氧乙烷链，其形成
‘
梳状’表面活性剂的
ꢀ‘
齿’。在一些实施例中，这些高分子量聚合物可使悬浮液浓缩物具有极良好的长期稳定 性，因为疏水性骨架在粒子表面上具有许多锚定点。在一些实施例中，本公开的农业 组合物中使用的分散剂的实例是：木素磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；乙氧基化三苯 乙烯基苯酚磷酸酯；乙氧基化脂肪醇；烷基乙氧基化物；eo-po嵌段共聚物；以及接 枝共聚物。
[0230]
在一些实施例中，本公开的农业组合物包含乳化剂。乳化剂是使一种液相的液滴 的悬浮液在另一种液相中稳定的物质。当不存在乳化剂时，两种液体将分离成两种不 可混溶的液相。在一些实施例中，最常用的乳化剂掺合物包括12个或更多的环氧乙烷 单元的烷基苯酚或脂肪醇以及油溶性十二烷基苯磺酸的钙盐。在8到18范围内的亲水
ꢀ‑
亲油平衡(“hlb”)值通常将提供良好的稳定乳液。在一些实施例中，乳液稳定性有 时可通过添加少量的eo-po嵌段共聚物表面活性剂来改良。
[0231]
在一些实施例中，本公开的农业组合物包含增溶剂。增溶剂是表面活性剂，其将 在超过临界微胞浓度的浓度下在水中形成微胞。接着，微胞能够使微胞的疏水性部分 内的不溶于水的材料分解或溶解。通常用于溶解的表面活性剂的类型是非离子性表面 活性剂：脱水山梨糖醇单油酸酯；乙氧基化脱水山梨糖醇单油酸酯；以及油酸甲酯。
[0232]
在一些实施例中，本公开的农业组合物包含有机溶剂。有机溶剂主要用于可乳化 浓缩物的配制物、ulv配制物以及较小程度地用于颗粒状配制物中。有时，使用溶剂 的混合物。在一些实施例中，本公开教示溶剂的用途，所述溶剂包括脂肪族链烷烃油， 如煤油或精炼石蜡。在其它实施例中，本公开教示芳香族溶剂的用途，如二甲苯和具 有c9和c10的较高分子量部分的芳香族溶剂。在一些实施例中，氯化烃适用作共溶剂 以在配制物在水中乳化时防止农药结晶。有时使用醇作为共溶剂以提高溶剂功能。
[0233]
在一些实施例中，农业组合物包含胶凝剂。增稠剂或胶凝剂主要用于悬浮液浓缩 物、乳液和悬浮乳液的配制中，以改变液体的流变学或流动性以及防止分散的粒子或 液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂以及防沉降剂通常属于两种类别，即不溶于水的 颗粒和水溶性聚合物。有可能使用粘土和二氧化硅产生悬浮液浓缩物配制物。在一些 实施例中，农业组合物包含一种或多种增稠剂，包括(但不限于)蒙脱石，例如膨润 土、硅酸镁铝；以及绿坡缕石。在一些实施例中，本公开教示使用多糖作为增稠剂。 最常用的多糖的类型是种子和海藻的天然提取物或纤维素的合成衍生物。一些实施例 利用黄原胶并且一些实施例利用纤维素。在一些实施例中，本公开教示增稠剂的用途， 包括(但不限于)：瓜尔豆胶；刺槐豆胶；角叉菜胶；海藻酸盐；甲基纤维素；羧甲基 纤维素钠(scmc)；羟基乙基纤维素(hec)。在一些实施例中，本公开教示其它类型 的防沉降剂的用途，如经改性的淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇以及聚氧化乙烯。另一 种良好的防沉降剂是三仙胶。
[0234]
在一些实施例中，存在表面活性剂(其降低界面张力)可引起基于水的配制物在 通过喷雾箱进行的制备和施用中的混合操作期间起泡。因此，在一些实施例中，为了 降低起泡趋势，通常在制备阶段期间或在填充到瓶子/喷雾槽中之前添加消泡剂。通常， 存在两
种类型的下消泡剂，即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液， 而非聚硅氧消泡剂是不溶于水的油，如辛醇和壬醇，或二氧化硅。在两种情况下，消 泡剂的功能是从空气-水界面转移表面活性剂。
[0235]
在一些实施例中，农业组合物包含防腐剂。
[0236]
此外，根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落可与农 业领域中可用的已知活性剂组合，如：农药、除草剂、杀菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、 杀病毒剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀疥虫剂、植物生长调节剂、灭鼠剂、抗藻剂、生物 控制或有利的试剂。此外，根据所公开的方法研发的微生物、微生物聚生体或微生物 群落可与已知的肥料组合。这类组合可呈现协同特性。此外，根据所公开的方法研发 的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落可与惰性成分组合。而且，在一些方面中， 所公开的微生物与生物活性剂组合。
[0237]
由本公开的微生物和聚生体产生的代谢物
[0238]
在一些情况下，本公开的微生物可产生一种或多种化合物和/或具有一种或多种活 性，例如以下中的一种或多种：产生代谢物、产生植物激素(如生长素)、产生乙偶姻、 产生抗微生物化合物、产生含铁细胞、产生纤维素酶、产生果胶酶、产生壳质酶、产 生木聚糖酶、氮固定或矿物质磷酸盐溶解。
[0239]
举例来说，本公开的微生物可产生选自以下组成的组的植物激素：生长素、细胞 分裂素、赤霉素、乙烯、油菜素内固醇以及脱落酸。
[0240]
因此，“由本公开的微生物产生的代谢物”意图涵盖由微生物产生的任何分子(小 分子、维生素、矿物质、蛋白质、核酸、脂质、脂肪、碳水化合物等)。通常，本公开 的微生物赋予既定植物物种有益特性的精确作用机制是未知的。假设在一些情况下， 微生物产生对植物有益的代谢物。因此，在一些方面中，微生物的无细胞或不活化制 剂对植物有益，因为微生物并不必须是活的以赋予既定植物物种有益特性，只要所述 制剂包括由所述微生物产生的代谢物并且其对植物有益即可。
[0241]
在一个实施例中，本公开的微生物可产生生长素(例如吲哚-3-乙酸(iaa))。可 分析生长素的产生。本文中所描述的许多微生物当在培养物中生长时能够产生植物激 素生长素吲哚-3-乙酸(iaa)。生长素在更改植物的生理学(包括根生长程度)中起重 要作用。
[0242]
因此，在一个实施例中，本公开的微生物以安置于表面上或既定植物物种的组织 内的群体形式存在。微生物可按当与未用本公开的微生物或无细胞或非活性制剂处理 的参考植物相比时，可有效地引起在植物上或植物内发现的代谢物的量可检测增加的 量产生代谢物。由所述微生物群体产生的代谢物可对植物物种有益。
[0243]
植物生长调节剂和生物刺激剂
[0244]
在一些实施例中，本公开的农业组合物包含与所教示的微生物组合使用的植物生 长调节剂和/或生物刺激剂。
[0245]
在一些实施例中，根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物 群落可与农业领域中已知的植物生长调节剂组合，如：生长素、赤霉素、细胞分裂素、 乙烯产生剂、生长抑制剂以及生长阻滞剂。
[0246]
举例来说，在一些实施例中，本公开教示农业组合物，其包含以下活性成分中的 一种或多种，所述活性成分尤其包括：环丙嘧啶醇、比达宁(butralin)、醇、矮壮素、 细胞分
裂素、亚拉生长素、丁酰肼、艾斯芬(ethepohon)、呋嘧醇、赤霉酸、赤霉素混 合物、吲哚-3-丁酸(iba)、马来酸酰肼、美孚得(mefludide)、氯化壮棉素、五硼酸 壮棉素、萘-乙酸(naa)、1-萘乙酰胺(nad)、正癸醇、普拉布唑(placlobutrazol)、 调环酸钙、抗倒酯、烯效唑、水杨酸、脱落酸、乙烯、油菜素内固醇、茉莉酮酸酯、 多元胺、氧化氮、独脚金内酯或卡里金(karrikins)。
[0247]
在一些实施例中，根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物 群落可与农业领域中已知的种子接种体组合，尤其如：群落可与农业领域中已知的种子接种体组合，尤其如：在一些实施例中，短根瘤 菌接种体与本文中所公开的任何单一微生物或微生物聚生体组合使用。在具体方面中， 当组合一种前述接种体(例如或短根瘤菌)与本文中教示的微生物或 微生物聚生体时观察到协同作用。
[0248]
在一些实施例中，本公开的农业组合物包含植物生长调节剂，其含有：活动素、 赤霉酸和吲哚丁酸以及铜、锰和锌。
[0249]
在一些方面中，包含本公开的微生物(例如表1-3中的任何微生物或其组合)和 活动素、赤霉酸和吲哚丁酸以及铜、锰和锌的农业组合物呈现共同发挥协同作用的能 力。
[0250]
在一些实施例中，本公开教示农业组合物，其包含一种或多种市售植物生长调节 剂，包括(但不限于)包括(但不限于) earlyearly bollboll earlygreennpgrpgrpgrdipndipndipnturf armorarmor和
[0251]
在一些实施例中，本发明教示本发明所公开的微生物或微生物聚生体与植物生长 调节剂和/或刺激剂(如植物激素或影响植物生长调节剂的产生或破坏的化学物质)的 协同用途。
[0252]
在一些实施例中，本发明教示植物激素可包括：生长素(例如吲哚乙酸iaa)、赤 霉素、细胞分裂素(例如活动素)、脱落酸、乙烯(和其制剂，如由acc合成酶调节 和由acc脱氨
diehard
tm
solublekelp、diehard
tm
humatesp、foliarplus
tm
、plantplus
tm
、accomplishsoilbuilder
tm
、nutrilife、soilsolutiontm、seedcoattmpercplustm、plantpower、thrust
tm
、、以及
[0263]
在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与或其它类似的植物生长调节剂组合。描述为包含4.0％赤霉酸和96.00％其它成分。
[0264]
在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与或其它类似的植物生长调节剂组合。描述为包含10.0％赤霉酸和90.00％其它成分。
[0265]
在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与ryzup或其它类似的植物生长调节剂组合。ryzup描述为包含40.0％赤霉素a3和60.00％其它成分。
[0266]
在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与x-cyte
tm
或其它类似的植物生长调节剂组合。x-cyte
tm
描述为包含0.04％细胞分裂素(作为活动素)和99.96％其它成分。
[0267]
在一些实施例中，本公开教示根据所公开的方法研发的个别微生物或微生物聚生体或微生物群落(包括说明书的表1-3中所公开的任何单一微生物或微生物组合)可与n-large
tm
或其它类似的植物生长调节剂组合。n-large
tm
描述为包含4.0％赤霉素a3和96.00％其它成分。
[0268]
在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与活性化学试剂组合时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在其它实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与活性化学试剂组合时，可发现对相关植物表现型特性的协同作用。
[0269]
在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与肥料组合时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在其它实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与肥料组合时，可发现对相关植物表现型特性的协同作用。
[0270]
在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与植物生长调节剂时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与植物生长调节剂组合时，可发现协同作用。在一些方面中，本公开的微生物与组合并且观察到一种或多种相关表现型特性的协同作用。
[0271]
在一些实施例中，当根据所教示的方法鉴别的微生物或微生物聚生体与生物刺激剂组合时，可发现对相关植物表现型特性的加成作用。在一些实施例中，当根据所教示的
子出芽和幼苗出现之前不久种植种子的区域的优点。
[0283]
在其它实施例中，本公开还教示使用种子处理剂可使成功处理植物所需的微生物 或农业组合物的量最小化，并且与如在土壤上方或新出现的幼苗上方喷雾等施用技术 相比，进一步限制工人与微生物和组合物的接触。
[0284]
此外，在一些实施例中，本公开教示本文中所公开的微生物对于增强早期植物寿 命(例如在幼苗出现之后的第一个三十天内)是重要的。因此，在一些实施例中，以 种子处理剂形式传递本公开的微生物和/或组合物可在对于微生物活性来说重要的时间 将其放置在作用区域。
[0285]
在一些实施例中，本公开的微生物组合物配制成种子处理剂。在一些实施例中， 预期通过使用特别设计和制造成精确、安全以及有效地向种子施用种子处理剂产品的 处理剂施用设备，使用常规的混合、喷雾方法或其组合，可在种子上基本上均匀地涂 布本文中所公开的微生物和/或农业组合物一个或多个层。这类设备使用不同类型的涂 布技术，如旋转涂布器、滚筒涂布器、流体化床技术、喷泉床、旋转喷雾或其组合。 液体种子处理剂(如本公开的液体种子处理剂)可通过自旋“雾化器”盘或喷射嘴施用， 其在其以喷雾模式移动时将种子处理剂均匀地分布在种子上。在各方面中，接着再将 种子混合或滚揉一段时间以实现额外的处理剂分布和干燥。
[0286]
在用微生物组合物涂布之前，种子可经底涂或未经底涂以提高出芽和萌芽的均匀 性。在替代性实施例中，可将干粉配制物以计量方式置放于移动种子上并且进行混合 直到完全分布。
[0287]
在一些实施例中，种子的至少一部分表面区域涂有根据本发明的微生物组合物。 在一些实施例中，将包含微生物组合物的种子涂层直接施用于裸种子。在一些实施例 中，将包含微生物组合物的种子外涂层施用于上面已施用种子涂层的种子。在一些方 面中，种子可具有种子涂层，其包含例如可尼丁(clothianidin)和/或坚强芽孢杆菌 (bacillus firmus)-i-1582，在其顶部将以种子外涂层形式施用本发明的组合物。在一些 方面中，所教示的微生物组合物以种子外涂层形式施用于已用poncho
tm
votivo
tm
处理的种子。在一些方面中，种子可具有种子涂层，其包含例如灭达乐(灭达乐)和/ 或可尼丁和/或坚强芽孢杆菌-i-1582，在其顶部将以种子外涂层形式施用本发明的组合 物。在一些方面中，所教示的微生物组合物以种子外涂层形式施用于已用 acceleron
tm
处理的种子。
[0288]
在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓 度：每个种子约103到10
12
、103到10
11
、103到10
10
、103到109、103到108、103到107、 103到106、103到105或103到104。
[0289]
在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓 度：每个种子约104到10
12
、104到10
11
、104到10
10
、104到109、104到108、104到107、 104到106或104到105。
[0290]
在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓 度：每个种子约105到10
12
、105到10
11
、105到10
10
、105到109、105到108、105到107或105到106。
[0291]
在一些实施例中，经微生物处理的种子具有以下微生物孢子浓度或微生物细胞浓 度：每个种子约105到109。
[0292]
在一些实施例中，经微生物处理的种子具有每个种子至少约1
×
103或1
×
104或1
×
105或1
×
106或1
×
107或1
×
108或1
×
109的微生物孢子浓度或微生物细胞浓度。
[0293]
在一些实施例中，施用于种子的微生物和/或农业组合物中的一种或多种的量取决 于最终配制物，以及所利用的植物或种子的尺寸或类型。在一些实施例中，微生物中 的一种或多种以全部配制物的约2％w/w到约80％w/w存在。在一些实施例中，按重 量计，组合物中使用的微生物中的一种或多种是全部配制物的约5％w/w到约65％ w/w，或10％w/w到约60％w/w。
[0294]
在一些实施例中，种子也可以具有更多的孢子或微生物细胞/种子，例如每个种子 约102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
16
或10
17
个孢子或细胞。
[0295]
在一些实施例中，本公开的种子涂层的厚度可以是最多10μm、20μm、30μm、 40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、 140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、 230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、 320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、 410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、 500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、 590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、 680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、 770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、 860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、 950μm、960μm、970μm、980μm、990μm、1000μm、1010μm、1020μm、1030μm、 1040μm、1050μm、1060μm、1070μm、1080μm、1090μm、1100μm、1110μm、1120 μm、1130μm、1140μm、1150μm、1160μm、1170μm、1180μm、1190μm、1200μm、 1210μm、1220μm、1230μm、1240μm、1250μm、1260μm、1270μm、1280μm、1290 μm、1300μm、1310μm、1320μm、1330μm、1340μm、1350μm、1360μm、1370μm、 1380μm、1390μm、1400μm、1410μm、1420μm、1430μm、1440μm、1450μm、1460 μm、1470μm、1480μm、1490μm、1500μm、1510μm、1520μm、1530μm、1540μm、 1550μm、1560μm、1570μm、1580μm、1590μm、1600μm、1610μm、1620μm、1630 μm、1640μm、1650μm、1660μm、1670μm、1680μm、1690μm、1700μm、1710μm、 1720μm、1730μm、1740μm、1750μm、1760μm、1770μm、1780μm、1790μm、1800 μm、1810μm、1820μm、1830μm、1840μm、1850μm、1860μm、1870μm、1880μm、 1890μm、1900μm、1910μm、1920μm、1930μm、1940μm、1950μm、1960μm、1970 μm、1980μm、1990μm、2000μm、2010μm、2020μm、2030μm、2040μm、2050μm、 2060μm、2070μm、2080μm、2090μm、2100μm、2110μm、2120μm、2130μm、2140 μm、2150μm、2160μm、2170μm、2180μm、2190μm、2200μm、2210μm、2220μm、 2230μm、2240μm、2250μm、2260μm、2270μm、2280μm、2290μm、2300μm、2310 μm、2320μm、2330μm、2340μm、2350μm、2360μm、2370μm、2380μm、2390μm、 2400μm、2410μm、2420μm、2430μm、2440μm、2450μm、2460μm、2470μm、2480 μm、2490μm、2500μm、2510μm、2520μm、2530μm、2540μm、2550μm、2560μm、 2570μm、2580μm、2590μm、2600μm、2610μm、2620μm、2630μm、2640μm、2650 μm、2660μm、2670μm、2680μm、2690μm、2700μm、2710μm、2720μm、2730μm、 2740μm、2750μm、2760μm、2770μm、2780μm、2790μm、2800μm、2810μm、2820 μm、2830μm、2840μm、2850μm、2860μm、2870μm、2880μm、2890μm、2900μm、 2910μm、2920μm、2930μm、2940μm、2950μm、2960μm、2970μm、2980μm、2990 μm或3000μm。
[0296]
在一些实施例中，本公开的种子涂层的厚度可以是0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、 2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。
[0297]
在一些实施例中，本公开的种子涂层可以是未经涂布的种子重量的至少0.5％、1％、 1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、 8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、 15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、 21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％、25％、25.5％、26％、26.5％、 27％、27.5％、28％、28.5％、29％、29.5％、30％、30.5％、31％、31.5％、32％、32.5％、 33％、33.5％、34％、34.5％、35％、35.5％、36％、36.5％、37％、37.5％、38％、38.5％、 39％、39.5％、40％、40.5％、41％、41.5％、42％、42.5％、43％、43.5％、44％、44.5％、 45％、45.5％、46％、46.5％、47％、47.5％、48％、48.5％、49％、49.5％或50％。
[0298]
在一些实施例中，微生物孢子和/或细胞可自由地涂布到种子上或其可在涂布到种 子上之前在液体或固体组合物中配制。举例来说，包含微生物的固体组合物可通过混 合固体载剂与孢子的悬浮液直到固体载剂浸渍有孢子或细胞悬浮液来制备。接着可干 燥这种混合物以获得所需粒子。
[0299]
在一些其它实施例中，预期本公开的固体液体微生物组合物还含有功能性试剂， 例如活性碳、营养物(肥料)，以及其它能够改良产物或其组合的出芽和质量的试剂。
[0300]
所属领域中已知的种子涂布方法和组合物在其通过添加本发明的实施例之一而经 修改时可尤其适用。这类涂布方法和其施用设备公开于例如：美国专利第5,916,029号； 第5,918,413号；第5,554,445号；第5,389,399号；第4,759,945号；第4,465,017号， 以及美国专利申请第13/260,310号，其中每一个以引用的方式并入本文中。
[0301]
种子涂料组合物公开于例如：美国专利第5,939,356号；第5,876,739号、第5,849,320 号；第5,791,084号、第5,661,103号；第5,580,544号、第5,328,942号；第4,735,015 号；第4,634,587号；第4,372,080号、第4,339,456号；以及第4,245,432号，其中每 一个以引用的方式并入本文中。
[0302]
在一些实施例中，可向包含本发明的组合物的种子处理剂配制物中添加多种添加 剂。可添加结合剂并且包括由对所涂布的种子无植物毒性作用的天然或合成粘合剂聚 合物组成的结合剂。结合剂可选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯乙酸乙 烯酯(eva)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基 纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素以及羧基甲基纤维素；聚乙烯基氢吡咯酮； 多糖，包括淀粉、变性淀粉、糊精、麦芽糊精、海藻酸酯以及壳聚糖；脂肪；油；蛋 白质，包括明胶和玉米蛋白；阿拉伯胶(gum arabics)；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙 烯共聚物；木质磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚乙烯基丙烯酸酯；聚氧化乙烯；丙烯酰胺 聚合物和共聚物；聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体；以及聚氯丁二烯。
[0303]
可使用多种着色剂中的任一种，包括有机发色团，其分类为亚硝基；硝基；偶氮 基，包括单偶氮、双偶氮和多偶氮；吖啶、蒽醌、吖嗪、二苯基甲烷、吲达胺(indamine)、 吲达酚(indophenol)、次甲基、噁嗪、酞菁、噻嗪、噻唑、三芳基甲烷、二苯并哌喃。 可添加的其它添加剂包括微量营养物，如铁、锰、硼、铜、钴、钼以及锌的盐。
[0304]
可施用聚合物或其它灰尘控制剂以使处理剂留存在种子表面上。
[0305]
在一些具体实施例中，除微生物细胞或孢子以外，涂层可进一步包含粘着剂层。 粘着剂应该是无毒性、可生物降解以及粘着性的。这类材料的实例包括(但不限于) 聚乙酸
乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，如甲基 纤维素、羟基甲基纤维素以及羟基甲基丙基纤维素；糊精；海藻酸酯；糖；糖蜜；聚 乙烯吡咯烷酮；多糖；蛋白质；脂肪；油；阿拉伯胶；明胶；糖浆剂；以及淀粉。更 多实例可见于例如美国专利第7,213,367号中，其以引用的方式并入本文中。
[0306]
种子处理剂配制物中还可以包括各种添加剂，如粘着剂、分散剂、表面活性剂和 营养物以及缓冲剂成分。其它常规种子处理剂添加剂包括(但不限于)：涂布剂、湿润 剂、缓冲剂以及多糖。可向种子处理剂配制物中添加至少一种农业上可接受的载剂， 如水、固体或干燥粉末。干燥粉末可来源于多种材料，如碳酸钙、石膏、蛭石、滑石、 腐殖质、活性炭以及多种磷化合物。
[0307]
在一些实施例中，种子涂料组合物可包含至少一种填充剂，其是有机或无机、天 然或合成组分，其中活性组分组合以促进其在种子上的施用。在各方面中，填充剂是 惰性固体，如粘土、天然或合成硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料(例如铵盐)、 天然土壤矿物质(如高岭土、粘土、滑石、石灰、石英、绿坡缕石、蒙脱石、膨润土 或硅藻土)或合成矿物质，替二氧化硅、氧化铝或硅酸盐，尤其是硅酸铝或硅酸镁。
[0308]
在一些实施例中，种子处理剂配制物可进一步包括以下成分中的一种或多种：其 它农药，包括仅在地面以下起作用的化合物；杀真菌剂，如盖普丹(captan)、福美双 (thiram)、灭达乐(metalaxyl)、氟二恶尼(fludioxonil)、欧杀斯(oxadixyl)以及这些 材料中的每一个的异构体等；除草剂，包括选自草甘膦、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸 酯、乙酰胺、三嗪、二硝基苯胺、甘油醚、哒嗪酮、尿嘧啶、含苯氧基的物质、尿素 以及苯甲酸；除草安全剂，如苯并噁嗪、二苯甲基衍生物、n,n-二烯丙基二氯乙酰胺、 各种二卤基乙酰基、噁唑啶基和噻唑烷基化合物、乙酮、萘二甲酸酐化合物以及肟衍 生物；化学肥料；生物肥料；以及生物控制剂，如其它天然存在的或重组型细菌和来 自根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属(pseudomonas)、沙雷氏菌属(serratia)、木 霉属(trichoderma)、脉络球属(glomus)、胶霉属(gliocladium)和菌根真菌的真菌。 这些成分可作为种子上单独的层添加，或可作为本公开的种子涂料组合物的一部分添 加。
[0309]
在一些实施例中，在本公开中用于处理种子的配制物可呈悬浮液；乳液；水性介 质(例如水)中粒子的浆料；可湿性粉末；可湿性颗粒(干燥可流动)；以及干燥颗粒 形式。如果配制成悬浮液或浆料，那么配制物中活性成分的浓度可以是约0.5％到约99 重量％(w/w)，或5-40％，或由所属领域的技术人员以其它方式配制。
[0310]
如上文所提及，可将其它常规非活性或惰性成分并入配制物中。这类惰性成分包 括(但不限于)：常规粘合剂；分散剂，如甲基纤维素，例如充当用于种子处理剂的组 合分散剂/粘合剂；聚乙烯醇；卵磷脂、聚合分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯)； 增稠剂(例如用于改良粘度和减少粒子悬浮液的沉降的粘土增稠剂)；乳液稳定剂；表 面活性剂；防冻剂化合物(例如尿素)、染料、着色剂等。本公开中适用的其它惰性成 分可见于mccutcheon,第1卷,《乳化剂和清洁剂(emulsifiers and detergents)》,mcpublishing company,美国新泽西州格伦罗克(glen rock,n.j.,u.s.a.),1996，其以引 用的方式并入本文中。
[0311]
本公开的种子涂层配制物可通过多种方法施用于种子，包括(但不限于)：在容器 (例如瓶子或袋子)中混合、机械施用、翻滚、喷雾和浸没。多种活性或惰性材料可用 于使种
或所预测的益处的知识的个别微生物物种或品系的集合。举例来说，从植物组织分离 而无任何关于其改良植物生长或健康的能力的知识的未鉴别的微生物的集合，或经收 集以探索其用于产生可引起医药学药物发展的化合物的潜力的微生物的集合。
[0329]
在一个实施例中，微生物是从其天然存在的来源材料(例如土壤、岩石、水、空 气、灰尘、植物或其它生物体)获得。考虑到微生物在本公开的方法中的既定用途， 其可以任何适合的形式提供。然而，仅作为实例，微生物可以水性悬浮液、凝胶、均 质物、颗粒、粉末、浆料、活生物体或干燥材料形式提供。
[0330]
本公开的微生物可在基本上纯的或混合培养物中分离。其可被浓缩、稀释或以其 在发现其的来源材料中的天然浓度提供。举例来说，来自生理食盐水沉积物的微生物 可通过使沉降物悬浮在淡水中并且使沉降物下降到底部来分离以用于本公开。可在适 合的沉降期后通过倾析来移出含有微生物主体的水，并且直接施用于植物生长培养基， 或通过过滤或离心来浓缩，稀释到适合的浓度并且与所移出的盐的主体一起施用于植 物生长培养基。作为另一实例，可类似地处理来自矿化或有毒来源的微生物以回收微 生物以用于植物生长材料，以便最小化损害植物的可能性。
[0331]
在另一实施例中，微生物以粗物质形式使用，其中其未从其天然存在的来源材料 分离。举例来说，微生物与其驻存的来源材料组合提供；例如土壤，或植物的根、种 子或叶子。在这一实施例中，来源材料可包括微生物的一种或多种物种。
[0332]
在一些实施例中，本公开的方法中使用微生物的混合群体。
[0333]
在其中从来源材料(例如其中微生物天然驻存的材料)分离微生物的本公开的实 施例中，可使用所属领域的技术人员易知的许多标准技术中的任一种或组合。然而， 作为实例，这些通常使用可用于获得基本上纯形式的单一微生物的固体或液体培养物 的方法，通常通过固体微生物生长培养基表面上的物理分离或通过在液体微生物生长 培养基中的体积稀释分离。这些方法可包括从干燥材料、液体悬浮液、浆料或匀浆(其 中材料在适合的固体凝胶生长培养基上的薄层中传播)分离，或在无菌培养基中进行 的材料的连续稀释和接种到液体或固体培养基中。
[0334]
尽管非必需，但在一个实施例中，可在分离过程之前预先处理含有微生物的材料 以使材料中的所有微生物倍增，或通过用微生物营养物对材料进行富集(例如通过对 样品进行巴氏杀菌以选择对热暴露具有抗性的微生物(例如杆菌)，或通过使样品暴露 于低浓度的有机溶剂或灭菌剂(例如家用漂白剂)来选择某些部分的微生物群体，以 增强孢子形成或溶剂耐性微生物的存活期)。如上文所述，接着可从经富集的材料或经 处理以用于选择性存活的材料分离微生物。
[0335]
在本发明的一个实施例中，从植物材料分离内生或附生植物型微生物。可使用所 属领域中已知的多种标准技术并且可从植物中的任何适合的组织分离微生物，包括例 如根、茎干和叶子，以及植物生殖组织。作为实例，用于从植物进行分离的常规方法 通常包括相关植物材料(例如根或茎干长度、叶子)的无菌切除、用适合的溶液(例 如2％次氯酸钠)进行的表面灭菌，随后将植物材料置放于营养物培养基上以用于微生 物生长(参见例如strobel g和daisy b(2003)《微生物学和分子生物学综述 (microbiology and molecular biology reviews)》67(4):491-502；zinniel dk等人(2002), 《应用和环境微生物学(applied and environmental microbiology)》68(5):2198-2208)。
[0336]
在本公开的一个实施例中，从根组织分离微生物。用于从植物材料分离微生物的 另一种方法详细描述于下文中。
[0337]
在一个实施例中，使微生物群体暴露于(在方法之前或在方法中的任何阶段)选 择压力。举例来说，使微生物在其添加到植物生长培养基(优选是无菌的)之前暴露 于巴氏灭菌可能增强选择用于所需特性的植物将与可在不良条件下、在市售储存期中 或在不良环境中以涂层形式施用于种子的更易于存活的孢子形成微生物相关联的机 率。
[0338]
在某些实施例中，如上文中所提及，微生物可以粗物质形式使用并且无需从植物 或培养基分离。举例来说，可获得包括经鉴别对所选择的植物有益的微生物的植物材 料或生长培养基并且用作粗微生物来源以用于下一轮方法，或在方法结束时用作粗微 生物来源。举例来说，可获得完整的植物材料并且任选地处理，如覆盖或挤压。或者， 可从植物分离所选择的植物的个别组织或部分(如叶子、茎干、根和种子)并且任选 地处理，如覆盖或挤压。在某些实施例中，可从一种或多种所选择的植物移出与一种 或多种微生物的第二集合相关联的植物的一个或多个部分，并且其中进行方法的任何 连续重复，接枝到植物育种方法的任何步骤中使用的一种或多种植物上。
[0339]
能够从施用所公开的微生物、聚生体以及包含其的组合物获益的植物
[0340]
本公开的方法中可使用许多各种不同植物，包括藓类植物和地衣类植物和藻类植 物。在实施例中，植物具有经济、社会或环境价值。举例来说，植物可包括用作粮食 作物、纤维作物、油作物、用于林业、用于纸浆与造纸工业、用作生物燃料制剂的原 料和用作观赏植物的植物。
[0341]
在其它实施例中，植物可能在经济、社会或环保上不合乎需要，如野草。以下是 本公开的方法可适用的植物类型的非限制性实例的列表：
[0342]
粮食作物：
[0343]
谷类，例如玉米、大米、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦以及荞 麦；
[0344]
叶菜，例如十字花科植物，如甘蓝、椰菜、小白菜、火箭；沙拉绿叶菜，如菠菜、 水芹以及莴苣；
[0345]
果实和开花蔬菜，例如鳄梨、甜玉米、洋蓟；瓜类，例如笋瓜、黄瓜、甜瓜、小 胡瓜、南瓜；茄属蔬菜/果实，例如蕃茄、茄子以及辣椒；
[0346]
荚果蔬菜，例如落花生、花生、豌豆、大豆、菜豆、小扁豆、鸡豆、秋葵；
[0347]
球茎和茎菜类蔬菜，例如芦笋、芹菜、葱属作物(allium crops)，例如大蒜、洋葱 和韭菜；
[0348]
根和块茎植物，例如胡萝卜、甜菜、竹子芽、木薯、山药、姜、洋姜、防风草、 萝卜、马铃薯、甜马铃薯、芋头、芜菁以及山葵；
[0349]
糖作物，包括糖用甜菜(甜菜(beta vulgaris))、甘蔗(saccharum officinarum)；
[0350]
种植用于制备非酒精类饮品和刺激物的作物，例如咖啡、红茶、清凉茶和绿茶、 可可、大麻以及烟草；
[0351]
果实作物，如真正浆果果实(例如猕猴桃、葡萄、醋栗、鹅莓、番石榴、费约果 (feijoa)、石榴)、柑橘果实(例如橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚)、上位果实(例如香蕉、 酸果蔓、蓝莓)、聚合果(黑莓、覆盆子、博伊森莓)、复果(例如菠萝、无花果)、核 果类果实作物(例如杏、桃、樱桃、李子)、仁果(例如苹果、梨)等，如草莓、葵花 籽；
[0352]
烹调和医学草本植物，例如迷迭香、罗勒、月桂、芫荽、薄荷、莳萝、金丝桃(hypericum)、毛地黄、芦荟、蛭石以及大麻；
[0353]
产生香料的作物植物，例如黑胡椒、孜然肉桂、肉豆蔻、姜、丁香、番红花、小豆蔻、肉豆蔻衣、红辣椒、咖喱、大茴香；
[0354]
种植用于产生坚果的作物，例如杏仁和胡桃、巴西果、腰果、椰子、栗子、澳洲坚果、开心果、花生、山核桃；
[0355]
种植用于制备啤酒、葡萄酒和其它酒精类饮品的作物，例如葡萄和啤酒花；
[0356]
油籽作物，例如大豆、花生、棉花、橄榄、葵花、芝麻、羽扇豆物种和栗子作物(例如芥花/油菜)；以及可食用真菌，例如白蘑菇、香菇以及蚝蘑；
[0357]
用于田园农业的植物：
[0358]
豆科植物(legumes)：车轴草属(trifolium)物种、苜蓿属(medicago)物种以及莲藕(lotus)物种；白三叶草(白三叶(t.repens))；红三叶草(红三叶(t.pratense))；高加索三叶草(caucasianclover)(高加索三叶(t.ambigum))；地下三叶草(地三叶(t.subterraneum))；苜蓿/紫花苜蓿(紫花豌豆(medicagosativum))；一年生苜蓿(annualmedics)；蒺藜状苜蓿(barrelmedic)；天蓝苜蓿(blackmedic)；红豆草(红豆草(onobrychisviciifolia))；百脉根(birdsfoottrefoil/lotuscorniculatus)；大百脉根(花梗莲藕(lotuspedunculatus))；
[0359]
种子豆科植物/波浪状植物，包括豌豆(pisumsativum)、菜豆(phaseolusvulgaris)、蚕豆(viciafaba)、绿豆(vignaradiata)、豇豆(vignaunguiculata)、鹰嘴豆(cicerarietum)、羽扇豆(羽扇豆属物种(lupinusspecies))；谷类，包括玉米(zeamays)、高粱(高粱属(sorghumspp.))、小米(糜子(panicummiliaceum)、苏门答腊青霉(p.sumatrense))、大米(籼稻(oryzasativaindica)、粳稻(oryzasativajaponica))、小麦(小麦水稻(triticumsativa))、大麦(hordeumvulgare)、黑麦(secalecereale)、黑小麦(triticumxsecale)、燕麦(avenasativa)；
[0360]
草料和疏林草：温带草，如黑麦草属(lolium)物种；羊茅属(festuca)物种；剪股颖属(agrostis)物种、多年生的黑麦草(多年生黑麦草(loliumperenne))；杂交黑麦草(多花黑麦草(loliumhybridum))；一年生黑麦草(多花黑麦草(loliummultiflorum))、高羊茅(festucaarundinacea)；牛尾草(meadowfescue)(草甸羊茅(festucapratensis))；紫羊茅(festucarubra)；羊茅(festucaovina)；羊茅黑麦草(festuloliums)(羊茅黑麦草杂交物(loliumxfestucacrosses))；鸭茅(dactylisglomerata)；肯塔基早熟禾(kentuckybluegrasspoapratensis)；泽地早熟禾(poapalustris)；林地早熟禾(poanemoralis)；普通早熟禾(poatrivialis)；孔氏早熟禾(poacompresa)；雀麦属(bromus)物种；虉草属(phalaris)(梯牧草属(phleum)物种)；丽蚌草(arrhenatherumelatius)；冰草属(agropyron)物种；糙伏毛燕麦(avenastrigosa)；谷子(setariaitalic)；
[0361]
热带草(tropicalgrasses)，如：虉草属(phalaris)物种；臂形草属(brachiaria)物种；画眉草属(eragrostis)物种；黍属(panicum)物种；巴哈草(bahaigrass)(百喜草(paspalumnotatum))；短柄草属(brachypodium)物种；以及用于生物燃料制备的草，如柳枝稷(柳枝黍(panicumvirgatum)和芒草(miscanthus)物种；
[0362]
纤维作物：
[0363]
棉花、木棉、黄麻、椰子、剑麻、亚麻(亚麻属(linum)物种)、新西兰亚麻(newzealandflax)(新西兰麻(phormium)物种)；经收集用于纸张和经工程改造的木材纤维产物的种植和天然森林物种，如针叶和阔叶森林物种；
[0364]
种植林业和生物燃料作物中使用的树和灌木物种：
[0365]
松树(松属(pinus)物种)；冷杉(黄杉属(pseudotsuga)物种)；云杉(云杉属(picea)物种)；柏树(柏木属(cupressus)物种)；荆树(相思树(acacia)物种)；桤木(赤杨(alnus)物种)；橡树物种(栎属(quercus)物种)；红木(巨杉属(sequoiadendron)物种)；柳树(柳属(salix)物种)；桦树(桦属(betula)物种)；雪松(雪松属(cedurus)物种)；白蜡木(梣属(fraxinus)物种)；落叶松(落叶松属(larix)物种)；桉树(eucalyptus)物种；竹子(竹亚科(bambuseae)物种)和白杨(白杨属(populus)物种)。
[0366]
种植用于通过提取、生物、物理或生物化学处理来转化成能量、生物燃料或工业产物的植物：
[0367]
产油植物，如油棕、麻风树、大豆、棉花、亚麻籽；产乳胶植物，如帕拉橡胶树(pararubbertree)、橡胶树(heveabrasiliensis)和巴拿马橡胶树(panamarubbertree)弹性卡斯桑木(castillaelastica)；用作用于制备生物燃料(即在生物燃料、工业溶剂或化学产品(例如乙醇或丁醇、丙二醛或其它燃料或工业材料)制备期间的化学、物理(例如热或催化)或生物化学(例如酶促预处理)或生物(例如微生物发酵)转型作用之后)的直接或间接进料的植物，包括糖作物(例如甜菜、甘蔗)、产淀粉作物(例如c3和c4谷类作物和结节作物)、纤维素作物(如林木)(例如松树、桉树)以及禾本和禾本科植物，如竹子、柳枝稷、芒草；通过将气体气化和/或微生物或催化转化成生物燃料或其它工业原料(如溶剂或塑料，产生或不产生生物炭)来进行的能量、生物燃料或工业化学生产中使用的作物(例如生质作物，如针叶、桉树、热带或阔叶林木、和禾本科作物，如竹子、柳枝稷、芒草、甘蔗或木棉或软木，如白杨、柳树；以及用于制备生物炭的生质作物；
[0368]
产生适用于医药学、农业保健食品和药妆品工业的天然产物的作物：
[0369]
产生医药学前驱体或化合物或保健食品和药妆品化合物和材料的作物，例如大茴香(莽草酸(shikimicacid))、尖头蓼(白藜芦醇)、猕猴桃(可溶纤维、蛋白水解酶)；
[0370]
由于其美感或环境特性而种植的种花、观赏和礼仪性植物：
[0371]
花朵，如玫瑰、郁金香、菊花；
[0372]
观赏性灌木，如黄杨、赫柏、蔷薇、杜鹃花、常春藤
[0373]
礼仪性植物，如悬铃木、墨西哥橘、鼠刺、大戟、苔属植物
[0374]
藓类植物，如泥炭藓(sphagnummoss)
[0375]
种植用于生物修复的植物：
[0376]
向日葵、芸苔、柳、白杨、桉树
[0377]
杂交和gm植物改良
[0378]
在某些方面中，本公开的微生物施用于杂交植物以增加所述杂交物的有益特性。在其它方面中，本公开的微生物施用于经遗传修饰的植物以增加所述gm植物的有益特性。本文中教示的微生物能够适用于杂交物和gm植物，并且因此可最大化这些植物的优良遗传和特性技术。
组合将微生物转移到植物：接枝、插入外植体、抽吸、电致孔、卷绕、根修剪、诱导 气孔开口，或任何可提供使微生物进入植物细胞或胞间空间的机会的物理、化学或生 物处理。所属领域的技术人员可容易地了解许多可使用的替代性技术。
[0394]
在一个实施例中，微生物浸润植物的某些部分(如根、茎干、叶子和/或生殖植物 部分(变成内生))，和/或在根、茎干、叶子和/或生殖植物部分的表面上生长(变成附 生植物)和/或在植物根围中生长。在一个实施例中，微生物与植物形成共生关系。
[0395]
实例
[0396]
i.增加农业上重要的作物的产量
[0397]
在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在增加既定作物的产量。
[0398]
本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合 物)具有增加重要的农业作物的产量的潜力。这些产量增加可在无需进一步添加肥料 的情况下实现。
[0399]
实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加黑麦草生物质量
[0400]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0401]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于黑麦草(多 年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植 和培育黑麦草。
[0402]
也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0403]
预期由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物与对照性黑麦草植物相比将呈现 更高定量的生物质量。
[0404]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0405]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0406]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0407]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0408]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于黑麦草(多年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时， 将以标准方式种植和培育黑麦草。
[0409]
也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0410]
预期由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物与对照性黑麦草植物相比将呈现 更高定量的生物质量。
[0411]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0412]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0413]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0414]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0415]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予黑麦草种子。
[0416]
举例来说，预期农民将在将黑麦草种子播种到田间的同时向所述种子施用农业组 合物。这可例如通过向含有黑麦草种子并且配置成播种黑麦草种子的料斗或散播器施 用农业组合物来实现。
[0417]
也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。
[0418]
预期由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物与对照性黑麦草植物相比将呈 现更高定量的生物质量。
[0419]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0420]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0421]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0422]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0423]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予黑麦草种子。
[0424]
举例来说，预期农民将在将黑麦草种子播种到田间的同时向所述种子施用农业组 合物。这可例如通过向含有黑麦草种子并且配置成播种黑麦草种子的料斗或散播器施 用农业组合物来实现。
[0425]
也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。
[0426]
预期由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物与对照性黑麦草植物相比将呈 现更高定量的生物质量。
[0427]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0428]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0429]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0430]
实例2：用经分离的微生物和微生物聚生体增加玉米生物质量
[0431]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0432]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于玉米(玉蜀 黍)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育玉 米。
[0433]
也将绘制玉米种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
统计显著，但仍是可定量的。
[0453]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0454]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予玉米种子。
[0455]
举例来说，预期农民将在将玉米种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将玉米种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植玉米种子时喷雾到各行中。
[0456]
也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。
[0457]
预期由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物与对照性玉米植物相比将呈现更 高定量的生物质量。
[0458]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0459]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0460]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0461]
实例3：用经分离的微生物和微生物聚生体增加大豆生物质量
[0462]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0463]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于大豆(glycinemax)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育大 豆。
[0464]
也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0465]
预期由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物与对照性大豆植物相比将呈现更高 定量的生物质量。
[0466]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0467]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0468]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0469]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0470]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于大豆的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准方式种植和 培育大豆。
[0471]
也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0472]
预期由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物与对照性大豆植物相比将呈现更
高 定量的生物质量。
[0473]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0474]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0475]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0476]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0477]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予大豆种子。
[0478]
举例来说，预期农民将在将大豆种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将大豆种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植大豆种子时喷雾到各行中。
[0479]
也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。
[0480]
预期由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物与对照性大豆植物相比将呈现更 高定量的生物质量。
[0481]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0482]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳或更多。
[0483]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0484]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0485]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予大豆种子。
[0486]
举例来说，预期农民将在将大豆种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将大豆种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植大豆种子时喷雾到各行中。
[0487]
也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。
[0488]
预期由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物与对照性大豆植物相比将呈现更 高定量的生物质量。
[0489]
来自经处理的植物的生物质量可高约1-10％、高10-20％、高20-30％、高30-40％、 高40-50％、高50-60％、高60-70％、高70-80％、高80-90％或更高。
[0490]
来自经处理的植物的生物质量与对照物相比可等同每英亩增加约1蒲式耳，或每 英亩增加2蒲式耳，或每英亩增加3蒲式耳，或每英亩增加4蒲式耳，或每英亩增加5 蒲式耳
或更多。
[0491]
在一些方面中，生物质量增加是统计显著的。在其它方面中，生物质量增加不是 统计显著，但仍是可定量的。
[0492]
实例4：用经分离的微生物改变小麦幼苗生物质量
[0493]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0494]
在本实例中，小麦种子用个别微生物品系(bci)接种并且使其发芽(图5)。
[0495]
将种子接种并且置放于湿纸巾上，并且辊压。接着辊在盖有湿巾的塑料仓中，在25℃ 下培育。一式三份地测试图5中呈现的各品系，其中每次重复测试使用20个种子。
[0496]
在处理后第七天测量总生物质量。同时进行和测量未接种的
‘
水’对照处理。图5中 与x轴平行并且二等分y轴顶部附近的柱的实线表示未接种的对照种子。与未经活体 外处理的对照物相比，在接种后第七天(dpi)，一些经接种的品系显示生物质量的相 对增加。
[0497]
表11提供与仅用水处理对照物(h2o)和未经处理的(unt)对照物相比，如上 文所描述接种的小麦的生物质量增加的拐点。对于仅水处理对照物和未经处理的对照 物，紧靠物种的右侧两个管柱反映与对照物相比的百分比增加(％ioc)。表11的资料 中反映生物质的增加和减少。较小植物反映营养物和水的现场保留的潜力，其中这些 来源可由干旱或局部条件限制，因此假设降低是产量相关的。
[0498]
结果表明与活体外仅水和未经处理的对照物相比，在接种后第七天(dpi)，约19 种品系引起小麦的整体生物质量的相对增加。与两种对照物相比，八种品系展示大于 5％的增加，而与水对照物相比，19种品系展示大于5％的生物质量降低。
[0499]
表11
[0500]
所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并且一些品系与活体外水对照物相比在接种 后第4天(dpi)引起根和/或芽长度的相对增加(参见图6和7)。
[0508]
对于30个种子，各自一式两份地测试施用于小麦种子的每个品系。在处理后第4 天测量根和芽长度。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的(》90％)， 并且一些品系与活体外水对照物相比在接种后第4天(dpi)引起根和/或芽长度的相 对增加(参见图8和9)。
[0509]
对于50个种子，各自一式两份地测试施用于番茄种子的每个品系。在接种后第4 天(dpi)测量根和芽长度。结果表明尽管所测试的所有品系的出芽率都是良好的，并 且一些品系与活体外水对照物相比在接种后第4天(dpi)引起根和/或芽长度的相对 增加(参见图10和11)。
[0510]
表12提供与仅水处理对照物(h2o)相比，在如上文所描述接种之后，根和芽长 度增加(mm)的拐点。对于仅水处理对照物，紧靠物种的右侧管柱反映与对照物相比 的增加百分比(％ioc)。资料中反映增加和降低。较小植物反映营养物和水的现场保 留的潜力，其中这些来源可由干旱或局部条件限制，因此假设降低是产量相关的。
[0511]
结果表明与水对照物相比，在接种后第四天(dpi)，许多从优良植物分离的品系 引起根和/或芽长度的显著增加(p《0.1，费雪lsd(fisher's lsd))。与水对照物相比， 二十个从优良植物分离的品系引起玉米根长度的显著增加，并且19个引起玉米芽长度 的显著增加。与对照物相比，四个品系引起小麦的根和芽长度的显著增加。与对照物 相比，四个品系引起番茄的根和芽长度的显著增加。
[0512]
表12
[0513]
[0514][0515]
在表12中，评定根和芽长度以评估微生物处理剂对早期植物发育的作用。已注意 生物质量的增加和降低以反映假设降低是产量相关的可能性；举例来说，较小植物反 映营养物和水的现场保留的潜力，其中营养物和水可由干旱或局部条件限制。结果表 明与活体外水对照物相比，在所测试的所有品系中，某40个品系在接种后第4天(dpi) 引起根长度的相对增加并且35个品系引起芽长度的相对增加。四个番茄品系、三个小 麦品系和17个玉米
品系引起芽长度和根长度的显著增加(p《0.1，费雪最小均方差)。
[0516]
ii.农业上重要的作物中增加的耐旱性和h2o使用效率
[0517]
在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在增加既定作物的耐旱性和水使用效 率。
[0518]
本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合 物)具有增加重要的农业作物的耐旱性和水使用效率的潜力。这将实现更加可持续的 农业系统并且增加适用于生长重要作物的世界区域。
[0519]
实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加黑麦草耐旱性和h2o使用效率
[0520]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0521]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于黑麦草(多 年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植 和培育黑麦草。
[0522]
也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0523]
与对照性黑麦草植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物将呈 现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0524]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0525]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0526]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于黑麦草(多年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时， 将以标准方式种植和培育黑麦草。
[0527]
也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0528]
与对照性黑麦草植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物将呈 现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0529]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0530]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0531]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予黑麦草种子。
[0532]
举例来说，预期农民将在将黑麦草种子播种到田间的同时向所述种子施用农业组 合物。这可例如通过向含有黑麦草种子并且配置成播种黑麦草种子的料斗或散播器施 用农业组合物来实现。
[0533]
也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。
[0534]
预期与对照性黑麦草植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物将 呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0535]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和
生长模式的表现型。
[0536]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0537]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予黑麦草种子。
[0538]
举例来说，预期农民将在将黑麦草种子播种到田间的同时向所述种子施用农业组 合物。这可例如通过向含有黑麦草种子并且配置成播种黑麦草种子的料斗或散播器施 用农业组合物来实现。
[0539]
也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。
[0540]
预期与对照性黑麦草植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物将 呈现可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0541]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0542]
实例2：用经分离的微生物和微生物聚生体增加玉米耐旱性和h2o使用效率
[0543]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0544]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于玉米(玉蜀 黍)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育玉 米。
[0545]
也将绘制玉米种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0546]
与对照性玉米植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的玉米植物将呈现可 定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0547]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0548]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0549]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于玉米(玉蜀黍)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准 方式种植和培育玉米。
[0550]
也将绘制玉米种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0551]
与对照性玉米植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的玉米植物将呈现可 定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0552]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0553]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0554]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予玉米种子。
[0555]
举例来说，预期农民将在将玉米种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将玉米种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的
主体箱中并且在种植玉米种子时喷雾到各行中。
[0556]
也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。
[0557]
预期与对照性玉米植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物将呈现 可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0558]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0559]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0560]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予玉米种子。
[0561]
举例来说，预期农民将在将玉米种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将玉米种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植玉米种子时喷雾到各行中。
[0562]
也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。
[0563]
预期与对照性玉米植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物将呈现 可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0564]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0565]
实例3：用经分离的微生物和微生物聚生体增加大豆耐旱性和h2o使用效率
[0566]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0567]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于大豆的种子。 在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育大豆。
[0568]
也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0569]
与对照性大豆植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物将呈现可 定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0570]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0571]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0572]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于大豆的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准方式种植和 培育大豆。
[0573]
也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0574]
与对照性大豆植物相比，预期由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物将呈现可 定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0575]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和
生长模式的表现型。
[0576]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0577]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予大豆种子。
[0578]
举例来说，预期农民将在将大豆种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将大豆种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植大豆种子时喷雾到各行中。
[0579]
也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。
[0580]
预期与对照性大豆植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物将呈现 可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0581]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0582]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0583]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予大豆种子。
[0584]
举例来说，预期农民将在将大豆种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将大豆种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植大豆种子时喷雾到各行中。
[0585]
也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。
[0586]
预期与对照性大豆植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物将呈现 可定量和优良的耐干旱条件能力和/或呈现优良的水使用效率。
[0587]
耐旱性和/或水使用效率可基于所属领域中的任何次数的标准测试，例如叶子保水 性、肿胀损失点、光合率、叶子颜色和其它指示干旱胁迫、产量性能以及多种根形态 和生长模式的表现型。
[0588]
iii.增加农业上重要的作物的氮使用效率
[0589]
在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在降低必须沉积在既定农业系统中的 氮的量，并且仍实现既定作物的相同或更好的产量。
[0590]
本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合 物)具有可降低由氮浸透到空气、土壤和水路中而引起的每年农民损失的氮肥料的量 的潜力。这将实现更加可持续的农业系统，其仍能够产生符合当今农业期望的产量。
[0591]
实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加黑麦草nue
[0592]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0593]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于黑麦草(多 年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植 和培育黑麦草。
[0594]
也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0595]
预期与对照性黑麦草植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物将呈 现可定量和优良的利用氮的能力。
[0596]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0597]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0598]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于黑麦草(多年生黑麦草)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时， 将以标准方式种植和培育黑麦草。
[0599]
也将绘制黑麦草种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0600]
预期与对照性黑麦草植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的黑麦草植物将呈 现可定量和优良的利用氮的能力。
[0601]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0602]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0603]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予黑麦草种子。
[0604]
举例来说，预期农民将在将黑麦草种子播种到田间的同时向所述种子施用农业组 合物。这可例如通过向含有黑麦草种子并且配置成播种黑麦草种子的料斗或散播器施 用农业组合物来实现。
[0605]
也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。
[0606]
预期与对照性黑麦草植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物将 呈现可定量和优良的利用氮的能力。
[0607]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0608]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0609]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予黑麦草种子。
[0610]
举例来说，预期农民将在将黑麦草种子播种到田间的同时向所述种子施用农业组 合物。这可例如通过向含有黑麦草种子并且配置成播种黑麦草种子的料斗或散播器施 用农业组合物来实现。
[0611]
也绘制未被投予农业组合物的黑麦草种子的对照曲线。
[0612]
预期与对照性黑麦草植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的黑麦草植物将 呈现可定量和优良的利用氮的能力。
[0613]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0614]
实例2：用经分离的微生物和微生物聚生体增加玉米nue
[0615]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0616]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于玉米(玉蜀 黍)的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育玉 米。
[0617]
也将绘制玉米种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0618]
预期与对照性玉米植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的玉米植物将呈现可 定量和优良的利用氮的能力。
[0619]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0620]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0621]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于玉米(玉蜀黍)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准 方式种植和培育玉米。
[0622]
也将绘制玉米种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0623]
预期与对照性玉米植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的玉米植物将呈现可 定量和优良的利用氮的能力。
[0624]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨
酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0625]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0626]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予玉米种子。
[0627]
举例来说，预期农民将在将玉米种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将玉米种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植玉米种子时喷雾到各行中。
[0628]
也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。
[0629]
预期与对照性玉米植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物将呈现 可定量和优良的利用氮的能力。
[0630]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0631]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0632]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予玉米种子。
[0633]
举例来说，预期农民将在将玉米种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将玉米种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植玉米种子时喷雾到各行中。
[0634]
也绘制未被投予农业组合物的玉米种子的对照曲线。
[0635]
预期与对照性玉米植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的玉米植物将呈现 可定量和优良的利用氮的能力。
[0636]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0637]
实例3：用经分离的微生物和微生物聚生体增加大豆nue
[0638]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0639]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于大豆的种子。 在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标准方式种植和培育大豆。
[0640]
也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0641]
预期与对照性大豆植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物将呈现可 定量和优良的利用氮的能力。
[0642]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0643]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0644]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于大豆的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标准方式种植和 培育大豆。
[0645]
也将绘制大豆种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0646]
预期与对照性大豆植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的大豆植物将呈现可 定量和优良的利用氮的能力。
[0647]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0648]
c.用包含经分离的微生物的农业组合物进行处理
[0649]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以农业组合物形式施用，在播种时 投予大豆种子。
[0650]
举例来说，预期农民将在将大豆种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将大豆种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植大豆种子时喷雾到各行中。
[0651]
也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。
[0652]
预期与对照性大豆植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物将呈现 可定量和优良的利用氮的能力。
[0653]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变
化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0654]
d.用包含微生物聚生体的农业组合物进行处理
[0655]
在本实例中，包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体将以农业组合物 形式施用，在播种时投予大豆种子。
[0656]
举例来说，预期农民将在将大豆种子种植到田间的同时向所述种子施用农业组合 物。这可例如通过在标准16行种植器上向含有玉米种子并且配置成将大豆种子种植到 各行中的料斗/主体箱施用农业组合物来实现。或者，农业组合物可包含于种植器上单 独的主体箱中并且在种植大豆种子时喷雾到各行中。
[0657]
也绘制未被投予农业组合物的大豆种子的对照曲线。
[0658]
预期与对照性大豆植物相比，由用农业组合物处理的种子生长的大豆植物将呈现 可定量和优良的利用氮的能力。
[0659]
氮使用效率可通过记录同化路径中主要氮代谢池尺寸中的任一个的可测量的变化 (例如以下中的一个或多个中的可测量的变化：硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬 氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、白氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、 酪氨酸、植物部分的总蛋白含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)来定量，或 其中证实与对照植物相比，经处理的植物在较低氮施肥量下提供相同或升高的生物质 量或可收获产量，或其中证实与对照植物相比，经处理的植物在相同氮施肥量下提供 升高的生物质量或可收获产量。
[0660]
iv.农业上重要的作物中增加的代谢物表达
[0661]
在本发明的某些实施例中，本发明的方法旨在增加既定作物的相关代谢物的产生。
[0662]
本文中呈现的方法(基于利用所公开的经分离的微生物、聚生体和包含其的组合 物)具有增加既定作物的相关代谢物的产生的潜力。
[0663]
实例1：用经分离的微生物和微生物聚生体增加罗勒中的糖含量
[0664]
a.用经分离的微生物进行种子处理
[0665]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将以种子涂层形式施用于罗勒(灌木 罗勒(ocium basilicum))的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物时，将以标 准方式种植和培育罗勒。
[0666]
也将绘制罗勒种子(其未施用种子涂层形式的经分离的微生物)的对照曲线。
[0667]
预期与对照性罗勒植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的罗勒植物将呈现水 溶性碳水化合物含量的可定量增加。
[0668]
b.用微生物聚生体进行种子处理
[0669]
在本实例中，将包含至少两种来自表1-3的微生物的微生物联合体以种子涂层形 式施用于罗勒(灌木罗勒)的种子。在以种子涂层形式施用微生物联合体时，将以标 准方式
种植和培育罗勒。
[0670]
也将绘制罗勒种子(其未施用种子涂层形式的微生物联合体)的对照曲线。
[0671]
预期与对照性罗勒植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的罗勒植物将呈现水 溶性碳水化合物含量的可定量增加。
[0672]
v.可用微生物和的组合实现的协同作用
[0673]
a.用经分离的微生物与的组合进行种子处理
[0674]
在本实例中，来自表1-3的经分离的微生物将与组合并且以种子涂层形式 施用于植物的种子。在以种子涂层形式施用经分离的微生物/组合时，将以标 准方式种植和培育植物。
[0675]
也将绘制不具有以种子涂层形式施用的经分离的微生物/组合的植物种子 的对照曲线。
[0676]
预期与对照植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的植物将呈现相关表现型特 性的可定量增加。预期可观察到相关表现型特性的协同作用。
[0677]
b.用微生物聚生体与的组合进行种子处理
[0678]
在本实例中，微生物联合体(包含至少两种来自表1-3的微生物)将与组合，并且接着以种子涂层形式施用于植物的种子。在以种子涂层形式施用微生物联 合体/组合时，将以标准方式种植和培育植物。
[0679]
也将绘制不具有以种子涂层形式施用的微生物联合体/组合的植物种子的 对照曲线。
[0680]
预期与对照植物相比，由用种子涂层处理的种子生长的植物将呈现相关表现型特 性的可定量增加。预期可观察到相关表现型特性的协同作用。
[0681]
vi.微生物聚生体
[0682]
实例中利用的微生物聚生体以非限制性物质呈现于表13中，同时认识到微生物聚 生体可包含表1-3中呈现的任一种或多种微生物。
[0683]
表13：聚生体组合物
[0684]
[0685]
[0686]
[0687][0688]
vii.微生物聚生体对植物表现型的作用
[0689]
实例1：在美国试验中评估暴露于微生物聚生体的植物的表现型
[0690]
表14中公开的植物在167ml根体积下在受控环境中，并且通常在土壤基质中生长。 对于所有物种，所有实验的腔室光周期设定成16小时。由于植物高度在实验期间增加， 光强度范围是180μmol par m-2
s-1
到约mol par m-2
s-1
。
[0691]
对于玉蜀黍、大豆和双色高粱实验，空气温度在光周期期间通常是28℃，在夜间 降低到23℃。对于小麦实验，空气温度在光周期期间通常是24℃，在夜间降低到20℃。
[0692]
在早期无性繁殖生长期间，通常在v3发育期之前测量表现型。
[0693]
使用可提供叶绿素含量指数的计量器，非相消地沿最嫩的完全扩增树叶在中间位 置测量叶绿素含量(ccm-200，opti sciences，美国新罕布什尔州赫德森(hudson,nh, us))。
[0694]
在植物在设定成80℃的干燥箱中干燥到恒重之后测量完整植物、芽和根干重。对 于在每次实验中测量的每个表现型，测量至少10个重复植物。
[0695]
在各实验中进行未接种的种子的对照处理，以用于与由用微生物聚生体接种的种 子生长的植物进行比较。
[0696]
表14
[0697]
[0698]
[0699][0700]
表14中呈现的资料描述与相同实验中对照性操作相比，具体联合体改变相关表现 型的时间百分比(功效)。所测量的表现型是完整植物干重(植物)、芽干重(芽)、根 干重(根)、叶绿素含量(叶绿素)以及叶子温度(tleaf)。
[0701]
所呈现的资料是针对对照物测试的特定联合体的次数的平均值(评估值)。对于在 不同编号的评估中测量不同表现型的聚生体，在资料点旁边置放星号以使表现型与评 估编号匹配。已分解和显示特定作物物种(作物)的评估值。
[0702]
所呈现的资料鉴别在超过60％的评估值中增加相关表现型(命中率》59)的聚生体， 和在超过60％的评估值中降低相关表现型(命中率《41)的聚生体。记录相关表现型中 的增加和降低以反映相关选择表现型的降低与产量相关性的可能性。通过降低的叶绿 素进行的雨棚光合成改良和通过降低的芽生物质量进行的耐旱性改良组成两个实例。
[0703]
实例2：在新西兰试验中评估暴露于微生物聚生体的植物的表现型
[0704]
由以在25℃下培育48到72小时的r2a上的传播培养盘形式生长的分离物制备接 种体。通过与无菌蒸馏水(sdw)掺合来收集群落，其接着转移到无菌容器中。将所 收集的细胞的连续稀释物涂布并且在25℃下培育24小时，以评估各悬浮液中集落形成 单位(cfu)的数目。使用个别分离物或分离物的掺合物(聚生体)制备稀释物以传 递约1
×
105cfu/微生物/种子，并且通过在液体悬浮液中渗吸或通过用5％植物胶和油过 度处理来接种种子。
[0705]
在农业土壤中，在24到48小时处理内种植对应于表15中的植物的种子，灌注培 养基或惰性生长培养基。植物在小盆(28ml到200ml)中，在受控环境或温室中生 长。对于所有物种，所有实验的腔室光周期设定成16小时。空气温度通常保持在22-24℃ 之间。
[0706]
除非另有说明，否则所有植物用自来水每周浇水2到3次。生长条件根据相关特 性变化并且包括如下施用肥料、灌溉制度和盐胁迫的操作：
[0707]
●
低n-在灌注培养基或惰性生长培养基的土壤中种植种子，其中不施用n肥料
[0708]
●
中等n-在补充有市售n肥料达到135kg/ha所施用的n的当量的土壤或生长 培养基中种植种子
[0709]
●
不溶解的p-在灌注培养基或惰性生长基质中种植种子并且用含有三磷酸钙作 为唯一磷酸盐肥料形式的四分之一强度皮氏液体培养基(pikovskaya's liquid medium) 浇灌。
[0710]
●
冷胁迫-在土壤、灌注培养基或惰性生长培养基中种植种子并且在10℃下培 育
一周，随后转移到植物生长室中。
[0711]
●
盐胁迫-在土壤、灌注培养基或惰性生长培养基中种植种子并且用含有100 到200mg/l nacl的溶液浇灌。
[0712]
制备用于各实验的未经处理的(未施用微生物)对照物。在整个生长环境中，在 塔盘上随机分配植物。对于各实验中的每次处理，制备10到30个重复植物。在早期 无性繁殖生长期间，通常在v3发育期之前并且在播种之后的3到6周测量表现型。修 剪叶子并且称重。洗涤根，以印迹方式干燥并且称重。结果表明针对未经处理的对照 物的处理的性能。
[0713]
表15
[0714]
[0715]
[0716][0717]
表15中呈现的资料描述与相同实验中的对照性操作相比，微生物物种或品系改变 相关表现型的效率。对于植物生长，所测量的表现型是在不存在或存在胁迫情况下的 芽鲜重和根鲜重(分析法)。对于各微生物物种，整体效率评分表明在独立评估中所述 物种的品系使芽和根鲜重增加的时间百分比。对于各物种，提供各独立分析法的特殊 性，提供品系
id(品系)和进行分析法的作物物种(作物)。对于各独立分析法，提供 与对照物相比的芽和根鲜重的增加百分比。
[0718]
实例3：在美国田间试验评估暴露于微生物聚生体的玉米的产量影响
[0719]
表16中呈现的资料概述在美国中西部的八个地区测试的六种聚生体与对照物相比 的最终产量变化。还呈现来自在美国加利福尼亚进行的两个干旱试验的最终产量资料。 资料表示成试验百分比，其中观察具体量值的每英亩的产量影响(蒲式耳)。所有田间 试验是根据标准农艺操作进行。
[0720]
表16
[0721][0722]
实例4：在新西兰田间试验评估暴露于微生物聚生体的玉米的产量影响
[0723]
表17中呈现的资料概述选择聚生体的新西兰田间试验的结果。所呈现的资料描述 其中已相对于对照物测试具体聚生体的试验数，和其中聚生体处理相对于对照处理增 加最终产量的试验数。所有田间试验是根据标准农艺操作进行。
[0724]
表17
[0725][0726]
实例5：由nrrl-农业研究机构培养物保藏中心(nrrl)保藏的微生物
[0727]
在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种。表18详 细描述已由nrrl-农业研究机构培养物保藏中心(united states department ofagriculture ars culture collection；nrrl)保藏的本公开的微生物物种。
[0728]
表18
[0729]
[0730]
[0731][0732]
实例6：由nrrl-农业研究机构培养物保藏中心(nrrl)保藏的新型微生物物 种
[0733]
在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种。
[0734]
表19
[0735]
[0736]
[0737][0738]
实例7：保藏的农业上新型微生物物种
[0739]
在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种。表20说 明已由nrrl、atcc和/或dsmz保藏中心以各别寄存编号保藏的本公开的微生物生 物体。
[0740]
表20
[0741]
[0742]
[0743][0744]
实例8：微生物聚生体实施例
[0745]
在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物聚生体。表21 说明本公开的微生物聚生体d1、a1、d6、d7、d12以及a15。每个聚生体名称下是 鉴别每个聚生体中存在的微生物的特定品系数。
[0746]
表21
[0747][0748]
实例9：微生物品系和微生物物种实施例
[0749]
在一个实验实施例中，本发明人在本公开的应用中利用以下微生物物种和/或品系。 表22说明实验研究中利用的特定微生物物种和品系，其在农业上是新型的并且在本公 开的受控环境筛检实验中呈现正性结果。
[0750]
表22
[0751]
说明的个别物种品系品系 说明的个别物种品系物种bdnz#bci编号 物种bdnz编号维氏杜擀氏菌66361
ꢀꢀ
嗜麦芽窄食单胞菌54073赛氏芽生杆菌54522703 红串赤球菌54093尼氏马赛菌551841217 瓦氏泛菌55529
金氏极单胞菌66373
ꢀꢀ
稻皮假单胞菌55530食树脂新鞘氨醇菌 557
ꢀꢀꢀ
维氏杜擀氏菌 2204
ꢀꢀꢀ
金橙黄微小杆菌 50
ꢀꢀꢀ
西伯利亚微小杆菌 116
ꢀꢀꢀ
金氏贪噬菌 3078
ꢀꢀꢀ
瑞氏地杆菌 598
ꢀꢀꢀ
雷氏菌 31
ꢀꢀꢀ
解葡聚糖类芽胞杆菌 418
ꢀꢀꢀ
烟酸芽胞杆菌 1718
ꢀꢀꢀ
[0752]
以引用的方式并入
[0753]
本文中所引用的所有参考文献、论文、公开、专利、专利公开以及专利申请以全 文引用的方式并入以用于所有目的。
[0754]
然而，提及本文引用的任何参考文献、论文、公开案、专利、专利公开案以及专 利申请案不是并且不应认为是承认或以任何形式暗示其构成有效现有技术或形成世界 上任何国家的公共常识的部分。
[0755]
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