多倍体水稻倍性循环育种方法与流程

1.本发明涉及一种多倍体水稻倍性循环育种方法，属于现代农业的作物新品种选育技术领域。


背景技术：

2.多倍体化是自然界植物进化的主要方式，主要粮棉油作物，小麦、棉花和油菜都是多倍体，在它们经由二倍体野生种进化到多倍体栽培种的过程中，产量成倍增加。这种自然现象蕴含着巨大的多倍体应用前景。为此，2001年蔡得田、袁隆平、卢兴桂提出“利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻”的新战略(作物学报，2001)。并且采用广泛远缘杂交和复合交的方法选育出“多倍体减数分裂稳定性”基因高结实品系(pmes)，突破了多倍体水稻育种结实率低的瓶颈问题(蔡得田等.中国科学c辑：生命科学，2007)，创建了五大技术体系，历时20多年，构建了5000多份多倍体水稻材料，选育出100多份多倍体优良品系，其中10多个优良品系展现出多倍体水稻茎秆粗壮、叶片厚实、穗大粒大、抗逆性强等优点。可是由于前期主要以理论研究为主、育种为辅，导致第一批选育的稳定品系虽然有高达75％以上的结实率和重达32～60g的千粒重(比二倍体18～30g的千粒重成倍增加)的优良特性和较强的抗逆境的优点，但抗稻瘟病能力不强，影响新品种的推广应用。多倍体水稻育种中，由于基因组的成倍增加，所载基因数目成倍增加，导致众多基因的完全纯合稳定需要时间很长。
3.基于四倍体水稻具有比二倍体成倍增加的基因组，包含着成倍增加的基因数，并且在每一个基因位点上具有4个相对性状基因。从遗传学分析看，4个等位基因涉及到配对、交换、分离之后全部纯合的过程，这比二倍体复杂得多，获得纯合稳定的品种，所需时间要长达16～20个世代。为此，需要进一步改进多倍体水稻育种方式，要扩大多倍体水稻育种范围，尽快将多倍体水稻应用于生产实践，以大幅度提高粮食产量，缓解世界粮食危机，急迫需要育种新思维与新技术，克服目前多倍体水稻纯合育种时间长、抗病能力差、推广应用难的难题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是，提出一种“多倍体水稻倍性循环育种方法”，用以解决多倍体水稻育种中，由于基因组的成倍增加，所载基因数目成倍增加，导致众多基因的完全纯合稳定，需要时间很长的难点。
5.本发明立足水稻基因组成倍增减而产生多倍体或单倍体，以进化与遗传学为基础，经连续二次利用去颖幼花单倍体培养而实现4x
→
2x
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1x的倍性由高到低更替，形成二倍体及单倍体；再利用体细胞有丝分裂，对处于体细胞有丝分裂中的二次枝梗原基至雌雄蕊形成期的幼穗连续两次染色体组离体培养加倍，实现1x
→
2x
→
4x倍性由低到高更替，所得植株再经农艺特征考察、倍性水平检测、米质检测和抗性分子标记辅选，快速选育出纯合四倍体水稻品系。
6.本发明的一种多倍体水稻倍性循环育种方法包括了如下阶段：
7.a.采用具有多种特性的多倍体籼稻、粳稻作为亲本；亲本中包含有高结实(pmes)、籽粒大、米质优、高产、抗逆、抗病等优良特性；
8.b.将具优良特性的籼稻、粳稻多倍体亲本相互杂交，获得四倍体籼/粳亚种间杂种(4x)；
9.c.采用四倍体籼粳亚种间杂种的成熟胚囊期包含花药和子房在一起的去颖幼花进行单倍体培养i；
10.d.在单倍体培养ⅰ中，应用特色的植物生长调节剂mcpa(2-甲基-4-氯苯氧乙酸)和酰胺的诱导愈伤组织培养基，经过愈伤组织诱导、分化出苗、壮根移植等单倍体培养过程；诱导愈伤组织的培养基为：n6+0.02％～0.05％mcpa+0.5mg/l～1.2mg/l naa(萘乙酸)+5mg/l～10mg/l天冬酰胺+5mg/l～10mg/l谷氨酰胺+5％～7％蔗糖(无琼脂)；将去颖幼花无菌转入诱导培养基中悬浮培养，诱导子房膨大，直至内含愈伤组织(约40～50天)和花药开裂内含有愈伤组织，将子房愈伤组织和花药愈伤组织转入分化培养基(ms+0.3mg/l～1.5mg/l kt+0.5mg/l～1.5mg/l naa+5mg/l～10mg/l天冬酰胺+5mg/l～10mg/l谷氨酰胺+3％～5％蔗糖+0.75％琼脂)中培养分化出苗；在1/2ms+0.2mg/l～0.3mg/l naa+100mg/l水解乳蛋白+0.01％～0.03％活性炭+0.8％琼脂培养基中生根壮苗培养；
11.e.经农艺特征考察、流式细胞分析仪检测染色体倍性，用抗稻瘟病、抗白叶枯病等dna分子标记检测，获得接近育种目标的不同单株(2x)；
12.f.将所选单株(2x)种植田间生长至胚囊成熟期，采取去颖幼花单倍体培养ⅱ，再按c、d相同的方法培养，获得不同的1x植株，实现染色体组从4x
→
2x
→
1x的倍性由高到低的更替过程；
13.g.所选的单倍体(1x)植株的第二次枝梗原基至雌雄蕊形成期的幼穗，经愈伤组织诱导，添加秋水仙素的离体染色体加倍，获得纯合二倍体植株(2x)；愈伤组织诱导培养基为：n6+1.0mg/l～2.5mg/l 2,4-d+0.5mg/l～1.5mg/l naa+100mg/l水解乳蛋白+0.5％～0.6％蔗糖+0.8％琼脂，分化培养基是ms+1.5mg/l～2.5mg/l kt+0.5mg/l～1.5mg/l naa+0.1mg/l～0.5mg/l iaa+100mg/l水解乳蛋白+0.01％～0.03％活性炭+0.3％蔗糖+0.8％琼脂；诱导愈伤组织细胞染色体加倍的培养基是：n6+1.5mg/l～2.0mg/l kt+0.5mg/l～0.75mg/l naa+0.5mg/l iaa+0.3％蔗糖+50mg/l～150mg/l秋水仙素(无琼脂)。诱导愈伤组织35～50d，诱导染色体加倍培养48～60h，处理结束后，用ms基本培养基清洗愈伤组织，然后转入诱导愈伤组织培养基中恢复培养8d～10d，再转入分化培养基，直至分化出苗，经壮根培育后转入田间栽植。
14.h.经农艺性状观察、倍性检测和抗性基因标记辅选后的植株，采用上述g步骤进行染色体组离体培养再加倍，获得纯合四倍体(4x)；经农艺性状观察、倍性检测、米质与抗病性检测及抗病性分子标记辅选，完成染色体组由低到高的1x
→
2x
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4x的技术程序；这样立足于减数分裂使染色体组成倍减少，而体细胞有丝分裂经秋水仙素处理后，染色体组成倍增加的原理。采用连续二次减数分裂后的去颖幼花单倍体培养ⅰ、ii，从4x的籼粳亚种间杂种培育形成2x及1x的单倍体植株，完成4x
→
2x
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1x染色体组由高到低的技术程序与倍性更替。另外由幼穗培养离体染色体组加倍ⅰ形成纯合二倍体(2x)，再经幼穗培养离体染色体组加倍ii形成纯合四倍体(4x)，完成染色体组从1x
→
2x
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4x的从低到高的技术程序和倍性更替，将两者融为一体，形成多倍体水稻倍性循环育种方法。
15.本发明多倍体水稻倍性循环育种方法。可以按4x
→
2x
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1x和1x
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2x
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4x的倍性更替快速选育纯合四倍体水稻品系；也可以按4x
→
2x
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1x和1x
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2x的倍性更替快速选育纯合二倍体水稻品系。
16.本发明具有明显的优势，利用“多倍体水稻倍性循环育种方法”快速选育出纯合四倍体水稻品系。经倍性循环育种形成的纯合四倍体水稻品系具有明显的纯合育种时间短、高产、优质、多抗病能力的特点。
17.本发明的主要创新点是：(1)根据生物减数分裂和有丝分裂的特点，采用连续二次去颖幼花单倍体培养形成从4x
→
2x
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1x的染色体组由高到低的更替，以及连续两次通过细胞有丝分裂中的秋水仙素处理离体加倍染色体，快速形成1x
→
2x
→
4x的植株；(2)采用mcpa特色植物生长调节物质提高诱导愈伤组织效率；(3)去颖幼花包括花药和子房，发挥组织培养中有益的聚集效应，提高诱导率和避免组培中最易出现的基因型影响。(4)发明将可以开启四倍体和二倍体水稻育种新途径，并且可以大大缩短育种周期，促进早日选育新品种，逐步应用于生产实践，而且也为植物多倍体研究提供宝贵资源材料和育种方法。
附图说明
18.图1倍性循环法选育新品种“多超69”系谱图
具体实施方式
19.下面以多倍体水稻多超69的选育对本发明进一步说明。
20.a.选用具有多种重要特性的多倍体籼稻、粳稻作为亲本。以具pmes(多倍体减数分裂稳定性)高结实基因的籼稻品系dt66四倍体为母本，具抗稻瘟病、具pmes基因的106b
×
psr120四倍体倾粳型材料为父本；
21.b.将多倍体亲本进行pmes、非pmes、优质、高产、抗病等性状的亲本间杂交，获得四倍体籼/粳亚种间杂种。将四倍体粳稻、具抗稻瘟病、pmes的dt66，与具pmes基因、抗稻瘟病、抗白叶枯病的四倍体106b/psr120籼粳稻进行杂交，获得四倍体复合交籼粳亚种间杂种；
22.c.采用四倍体亚种间杂种的成熟胚囊期的去颖幼花，进行单倍体培养i。采取四倍体亚种间杂种孕穗中处于成熟胚囊期、幼花颖壳已达正常谷壳大小、其尖端浅绿色、颖片浅黄白时期的幼穗，经消毒后用尖镊子无菌除去幼花的两片颖壳，保持完整的花药、花丝和子房，着生于花托上，接种于愈伤组织诱导培养基上。
23.d.应用特色的诱导愈伤培养基，经愈伤组织诱导、分化出苗、壮根移植的单倍体培养过程。采用n6+0.02％～0.05％mcpa(2-甲基-4-氯苯氧乙酸)+0.5mg/l～1.2mg/l naa(萘乙酸)+5mg/l～10mg/l天冬酰胺+5mg/l～10mg/l谷氨酰胺+5％～7％蔗糖培养基中悬浮培养去颖幼花，诱导子房膨大，内含愈伤组织和裂开花药中含有愈伤组织，将胚囊愈伤组织和花药愈伤组织转入分化培养基中(ms+0.3mg/l～1.5mg/l kt+0.5mg/l～1.5mg/l naa+5mg/l～10mg/l天冬酰胺+5mg/l～10mg/l谷氨酰胺+3％蔗糖+0.75％琼脂)分化出苗；在1/2ms+0.2mg/l～0.3mg/l naa+100mg/l水解乳蛋白+0.01％～0.03％活性炭+0.8％琼脂中生根壮苗培养至小苗移植田间。
24.e.农艺特征观察、流式细胞分析仪倍性测定和抗病基因的分子标记辅助选育。农艺特征观察重点考察穗数、结实率、千粒重和米质；倍性测定采用嫩叶通过流式细胞分析仪
检测。通过抗稻瘟基因pi1、pi2和pi9，抗白叶枯基因xa23等的分子标记，筛选出接近育种目标的植株(2x)。
25.f.完成去颖幼花单倍体培养ⅱ，实现染色体组从2x
→
1x,总体实现4x
→
2x
→
1x的倍性由高到低的更替。将所选单株种植田间生长至胚囊成熟期，采取去颖幼花单倍体培养ⅱ(其过程如去颖幼花单倍体培养ⅰ)，获得不同的单倍体(1x)植株，完成四倍体水稻育种的从4x到2x再到1x的染色体组倍性由高到低更替的技术途径。
26.g.采用幼穗进行染色体组离体培养加倍ⅰ，获得纯合二倍体植株(2x)。将所选的单倍体(1x)植株的第二次枝梗原基至雌雄蕊形成期的幼穗进行染色体组离体培养加倍ⅰ，而获得纯合的不同二倍体植株(2x)。
27.h.对所选二倍体植株采用上述g步骤进行染色体组离体培养ⅱ，获得纯合四倍体(4x)，完成染色体组由低到高的1x
→
2x
→
4x，经农艺性状观察、倍性检测和抗性分子标记辅选，获得符合育种目标的植株。
28.这样，从4x籼粳亚种间杂种经去颖幼花单倍体培养ⅰ形成2x，再次去颖幼花单倍体培养ⅱ形成1x，而由幼穗培养离体染色体组加倍ⅰ形成纯合二倍体2x，再经幼穗培养离体染色体组加倍ⅱ而形成纯合4x。从株系选择、品种比较发现dts69具有整齐、穗多、籽粒多、优质、抗病能力较强且粒大饱满的优良特征，命名为“多超69”。并且在选育该品种的过程中创造了大批四倍体和二倍体水稻新种质材料，应用于新品种的选育和理论研发。