一种肝细胞冷冻液的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体来说，涉及一种肝细胞冷冻液。


背景技术：

2.细胞冻存技术作为一种有效保存细胞的方法，在生物学领域有广泛的应用。正常情况下，直接冷冻细胞会产生冰晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡，所以在细胞冻存过程中，需要添加冻存保护液，来保证冻存过程中细胞的完好及功能的完整。
3.现阶段最常用的细胞冻存液主要为培养基、胎牛血清(fbs)和二甲基亚砜(dmso)组成。其中dmso为防冻液，可以提高细胞膜对水的通透性，减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。但随着人们对安全无毒的追求，而dmso对细胞具有一定的毒性，fbs存在病原污染的可能，所以越来越多不含血清、不含dmso的安全、有效冻存液被开发出来。
4.cn109843052a公开了一种用于细胞冷冻保存的组合物，其包含渗透性冷冻保护剂、糖类和大分子，还包括包含氨基酸、细胞因子、脂质、生长因子、抗生素、抗真菌剂、类固醇激素、蛋白质激素或其组合。冷冻保存组合物对细胞和组织具有低毒性，并且在冷冻保存期间促进生物材料的存活和活性保留。
5.cn110771599a公开了一种干细胞的冷冻液，包括培养液与冷冻液，其中，培养液为dmem/f12培养液，冷冻液包括二甲基亚砜、总黄酮、土豆粉提取物、人血清白蛋白、樱桃提取物、棕榈油提取物、小牛血清、海藻糖、链霉素和胰蛋白酶。该发明的冻存液结合传统冻存液配制方法，在原有的基础上进行了改进，降低了二甲基亚砜的用量，新添加了总黄酮，活化细胞的功能，具有抗氧化衰老的作用提高了脂肪干细胞的复苏比例。
6.肝脏作为人体最主要的排毒器官，且具有再生功能。因此对肝细胞的保护，尤其是良好的冷冻保存对于肝脏的恢复显得尤为重要，其决定着肝细胞复苏后的存活率。目前现有的冷冻液对于肝细胞复苏后的存活率不高，因此，亟需提供一种存活率高的肝细胞冷冻液。


技术实现要素：

7.为了解决以上技术问题，本发明提供了一种肝细胞冷冻液，该细胞冷冻液不含dmso，避免了对细胞的毒性风险，并通过添加中药提取物为肝细胞冻存过程中提供糖分、氨基酸、蛋白质、生长因子等主要营养物质，显著提高了肝细胞的复苏存活率。
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.一种肝细胞冷冻液，其包含：
10.(1)50-70％v/v的基础培养基；
11.(2)10-20％v/v的甘油；
12.(3)10-40％v/v的活性成分。
13.优选地，所述肝细胞冷冻液中不含dmso。
14.优选地，所述基础培养基含0.8-1.2％v/v的抗生素，进一步优选为1％v/v。
15.优选地，所述活性组分，包含牛白蛋白、葡萄糖、18aa复方氨基酸、肝细胞生长因子和中药提取物。
16.进一步优选地，所述活性组分，包含牛白蛋白0.05-0.5g/ml、葡萄糖70％-80％v/v、18aa复方氨基酸10％-25％v/v、肝细胞生长因子1％-8％v/v和中药提取物1％-10％v/v。
17.优选地，所述中药提取物为枸杞提取物和当归提取物；进一步优选地，所述枸杞提取物和当归提取物的比例为(2-4)ml：1mg；最优选为3ml：1mg。
18.本发明还提供了一种肝细胞的冷冻保存方法，将肝细胞加入上述肝细胞冷冻液中，在-80℃下过夜保存后，转移至液氮中保存。
19.优选地，所述肝细胞的密度为1
×
106个/ml-5
×
106个/ml。
20.本发明还提供了上述肝细胞冷冻液在保存肝细胞中的应用。
21.本发明还提供了一种试剂盒，包含上述肝细胞冷冻液。
22.本发明的有益效果为：
23.本发明的肝细胞冷冻液，基础培养基(含0.8-1.2％v/v抗生素)在肝细胞冻存时提供基础营养物质，保持正常的细胞渗透压及细胞活性；冻存保护剂为甘油，替代了dmso，避免了对细胞的毒性风险；活性成分精选牛白蛋白、葡萄糖、18aa复方氨基酸、肝细胞生长因子和中药提取物，为肝细胞冻存过程中提供糖分、氨基酸、蛋白质、生长因子几大主要营养物质，同时，中药提取物中的枸杞有护肝、促进肝细胞再生的作用。相比现有技术，本发明的细胞冷冻液不含dmso，避免了对细胞的毒性风险，并通过添加中药提取物为肝细胞冻存过程中提供糖分、氨基酸、蛋白质、生长因子等主要营养物质，显著提高了肝细胞的复苏存活率。同时发现，当枸杞提取物和当归提取物的比例为3ml：1mg时，效果最佳。
具体实施方式
24.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
25.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
26.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
27.本发明对所采用原料的来源不作限定，如无特殊说明，本发明所采用的原料均为本技术领域普通市售品。枸杞提取物为实验室自行制备，具体方法为：以洗净干燥的枸杞果实为原料，加水至枸杞重量的15-20倍，粉碎，使其碎片大小为≤5μm，得到固液混合物浆液，再通过离心分离，得上清液后浓缩，至体积为原上清液体积的1/5-1/4，即可。
28.当归提取物为实验室制备，具体方法为：用清水洗干净当归，晒干切碎后得当归粗粉，用体积浓度70-95％的乙醇水溶液提取，滤过，提取液回收乙醇，浓缩干燥，得当归提取物。
29.实施例1一种肝细胞冷冻液
30.(1)60％v/v的基础培养基(含1％v/v抗生素)；
31.(2)15％v/v的甘油；
32.(3)25％v/v的活性成分；所述活性组分中包含，牛白蛋白0.3g/ml、葡萄糖78％v/v、18aa复方氨基酸10％v/v、肝细胞生长因子4v/v和中药提取物8％v/v；中药提取物为体积质量比3ml：1mg的枸杞提取物和当归提取物。
33.实施例2一种肝细胞冷冻液
34.(1)70％v/v的基础培养基(含1.5％v/v抗生素)；
35.(2)20％v/v的甘油；
36.(3)10％v/v的活性成分；所述活性组分中包含，牛白蛋白0.5g/ml、葡萄糖70％v/v、18aa复方氨基酸15％v/v、肝细胞生长因子1％v/v和中药提取物10％v/v；中药提取物为体积质量比2ml：1mg的枸杞提取物和当归提取物。
37.实施例3一种肝细胞冷冻液
38.(1)50％v/v的基础培养基(含0.8％v/v抗生素)；
39.(2)10％v/v的甘油；
40.(3)40％v/v的活性成分；所述活性组分中包含，牛白蛋白0.05g/ml、葡萄糖80％v/v、18aa复方氨基酸25％v/v、肝细胞生长因子8％v/v和中药提取物1％v/v；中药提取物为体积质量比4ml：1mg的枸杞提取物和当归提取物。
41.对比例1
42.本对比例于实施例1的区别在于，活性成分中，中药提取物用五味子提取物代替当归提取物。
43.对比例2
44.本对比例于实施例1的区别在于，活性成分中，中药提取物中枸杞提取物和当归提取物的体积质量比为6ml：1mg，中药提取物含量为20％v/v。
45.对比例3
46.cn109843052a中cpa-5的配方制备的冷冻液。
47.对比例4
48.cn110771599a中实施例2制备的冷冻液。
49.为了进一步理解本发明的技术方案所能达到的技术效果，本发明选用可增殖、传代的人体正常肝细胞株hl-7702为试验系统进行功效验证实验。
50.实施例4一种肝细胞冷冻方法，包括以下步骤：
51.(1)配置肝细胞冷冻液；
52.(2)取对数生长的细胞，离心、洗涤；
53.(3用步骤(1)制备的肝细胞冻存液调整细胞冻存密度为1
×
106个/ml-5
×
106个/ml，分装到单独冻存管，标明细胞名称、冻存日期及操作者；
54.(4)冻存：将置于梯度降温盒中的冻存管转移至-80℃冰箱，过夜保存后迅速转移至液氮中。
55.实施例5一种肝细胞冷冻复苏的方法，包括以下步骤：
56.(1)从液氮中将冻存管取出，快速进入37℃温水中，并不停摇晃使其融化；
57.(2)从37℃温水中取出冻存管，用移液器吸出细胞悬液，加到离心管中，1000rpm离心5min；
58.(3)弃去上清，加入提前制备好的新鲜培养基，计数，调整细胞密度后，装入培养皿中，各取10ul用台盼蓝进行细胞活性测定；
59.(4)将培养皿在37℃，5％co2培养箱中培养1d；
60.(5)次日更换新鲜培养基，继续培养2d，观察细胞生长情况。
61.按实施例4的冷冻对实施例1-3和对比例1-4制备的肝细胞冷冻液进行肝细胞冷冻保存1周，1周后采用实施例5的复苏方法，进行肝细胞复苏，并进行细胞活性测定，结果如表1所示。
62.表1
[0063][0064][0065]
以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。