一种提高金针菇赖氨酸含量的方法

1.本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种提高金针菇菌丝体及子实体赖氨酸含量的方法。


背景技术：

2.金针菇(flammulinavelutipes)是我国历史上人工栽培最久远的食用菌之一，又名朴菇、冬菇、构菌、金菇、青杠菌、毛柄金钱菇以及智力菇等，在分类地位上属于真菌界(mycota)、担子菌亚门(basidiomycotina)、层菌纲(hymenomycetes)、伞菌目(agaricales)、口蘑科(tricholomataceae)、金钱菌属(flammulina)。金针菇口感滑而鲜嫩、外形美观，是我国生产量和消费量最大的食药用真菌。金针菇中总氨基酸含量高于大部分食用菌品种，其中包括八种人体必需氨基酸，赖氨酸属于必需氨基酸，高含量的赖氨酸对儿童生长发育有增强作用，对记忆力和智力也有提高效果。而且赖氨酸可以促进人和动物对蛋白质的吸收，对机体的神经系统也有明显的保护作用，还可以提高机体的免疫机制和抗病能力。因此，通过各种方法培育出生长良好的具有高含量赖氨酸的金针菇对于提高金针菇的品质具有深远的意义。
3.通过添加外源诱导剂来改善食用菌中营养物质含量的积累，已经被前人大量研究，有些已用于生产实践。近几年大量研究表明壳聚糖在农业上具有广阔的前景，它可以调控植物的生长发育，可以增强农作物的抗逆性，还可以提高作物的产量以及改善农产品的质量。本发明采用水溶性壳聚糖来提高金针菇菌丝体及子实体中赖氨酸的含量，在金针菇的工厂化栽培中操作简单，提高了金针菇的食用品质及安全性。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供壳聚糖在提高金针菇赖氨酸含量中的应用。
5.本发明的另一目的在于提供一种提高金针菇菌丝体及子实体中赖氨酸含量的方法。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.壳聚糖在提高金针菇赖氨酸含量中的应用。
8.作为一种优选技术方案，在金针菇菌丝体液体发酵过程中，通过向发酵液中添加壳聚糖进行发酵来提高金针菇菌丝体中赖氨酸的含量；和/或者在子实体阶段，在子实体搔菌后通过喷洒壳聚糖溶液来提高金针菇子实体中赖氨酸的含量。
9.进一步优选的，所述的发酵液中壳聚糖的添加浓度为5～18μg/ml。添加壳聚糖进行发酵的发酵的时间为24～96h。更进一步优选的，所述的发酵液中壳聚糖的添加浓度为8～16μg/ml。添加壳聚糖进行发酵的发酵的时间为30～72h。更进一步优选的，所述的发酵液中壳聚糖的添加浓度为10～16μg/ml。添加壳聚糖进行发酵的发酵的时间为40～70h。最优选的，所述的发酵液中壳聚糖的添加浓度为10～15μg/ml。添加壳聚糖进行发酵的发酵的时间为40～65h。
10.进一步优选的，所喷洒的壳聚糖溶液的浓度为5～18μg/ml。更进一步优选的，所喷洒的壳聚糖溶液的浓度为8～16μg/ml。更进一步优选的，所喷洒的壳聚糖溶液的浓度为10～16μg/ml。最优选的，所喷洒的壳聚糖溶液的浓度为10～15μg/ml。所述壳聚糖溶液的喷洒量为每个栽培瓶中喷洒50ml壳聚糖溶液，栽培瓶的容量为1100ml。
11.一种提高金针菇赖氨酸含量的方法，在金针菇菌丝体液体发酵过程中，通过向发酵液中添加壳聚糖进行发酵来提高金针菇菌丝体中赖氨酸的含量；和/或者在子实体阶段，在子实体搔菌后通过喷洒壳聚糖溶液来提高金针菇子实体中赖氨酸的含量。
12.作为一种优选技术方案，该方法具体包括两个阶段：
13.第一阶段：向培养基中接入金针菇液体菌种进行第一阶段发酵促进菌丝迅速生长；
14.第二阶段：在第一阶段发酵的发酵液中添加壳聚糖继续进行发酵来诱导金针菇菌丝体提高赖氨酸的含量；和/或在子实体阶段，在搔菌后通过喷洒壳聚糖溶液来诱导提高金针菇子实体中赖氨酸的含量。
15.进一步优选的：金针菇液体菌种的接种量为3％～15％(v/v)；第一阶段发酵的发酵条件为：25℃，150r/min转速，发酵72～168小时。
16.该方法的详细的技术方案为：
17.第一阶段：向配置好的pda培养基中以3％～15％(v/v)的接种量接入金针菇液体菌种，在温度为25℃，转速为150r/min的条件下，进行第一阶段的发酵，发酵时间为72～168小时；优选为120小时。
18.第二阶段：第一阶段发酵结束后，在无菌条件下向发酵液中添加最终浓度为5～18μg/ml的壳聚糖，进行第二阶段发酵，发酵时间为24～96h。和/或在子实体阶段，在搔菌后通过喷洒5～18μg/ml壳聚糖溶液来诱导金针菇子实体中赖氨酸的含量。
19.1升所述pda培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，用去离子水定容至1升，115℃灭菌25～40分钟。
20.本发明提高金针菇液体发酵菌丝体及子实体赖氨酸含量的方法，在金针菇菌丝体液体发酵时添加壳聚糖或在搔菌后通过喷洒壳聚糖溶液来诱导金针菇产生更多的赖氨酸。所使用的诱导剂壳聚糖，具有成本低用量少的特点，安全而且价格低廉，可显著提高金针菇中赖氨酸的含量。本发明方法实用、简单、无污染。该方法中的壳聚糖具有成本低用量少的特点，可在金针菇大规模生产中被运用，对于金针菇品质有了进一步的提高。
21.本发明的有益效果：
22.通过本发明的方法，可以显著提高金针菇菌丝体液体发酵及子实体中赖氨酸的含量，而且安全可靠，成本低廉，方法简单。金针菇常规方法液体发酵的菌丝体中赖氨酸的含量达到25.52～26.78mg/g dw，而本发明方法可使金针菇液体发酵菌丝体中赖氨酸的含量达到28.5～29.66mg/g dw，提高了10.8％～11.7％。金针菇常规方法栽培子实体中赖氨酸的含量可达到9.27～9.89mg/g dw，而本发明方法可使金针菇子实体中赖氨酸的含量达到10.82～11.28mg/g dw，提高了14.1～16.7％。
附图说明
23.图1为响应面3d结果。
24.图2为金针菇子实体的生长速度统计结果。
具体实施方式
25.为了使本领域相关技术领域人员更好地理解本发明中的技术方案，下面结合优选实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述优先实施例的限制。
26.非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
27.实施例一
28.(1)培养基配置：
29.配置pda培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，用去离子水定容至1升，灭菌条件为115℃灭菌30分钟。
30.(2)向配置好的pda培养基中以5％(v/v)的接种量接入金针菇液体菌种，在温度为25℃，转速为150r/min的条件下，进行第一阶段的发酵，发酵时间为120小时。
31.(3)第一阶段发酵结束后，在无菌条件下分别向发酵液中添加最终浓度为0mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml的壳聚糖，进行第二阶段发酵，发酵时间为48h。
32.(4)第二阶段发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5～6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定赖氨酸含量。将烘干的菌丝用研钵磨成粉末，称取0.05g于2ml离心管中，加2ml去离子水，在超声波破碎仪中超声破壁2小时，期间每20分钟上下颠倒混匀一次，超声结束后取超声提取液12000r/min离心10min，上清液即为样品。在离心管中依次加入ph＝2的磷酸缓冲液100μl，浓度为5.5mol/l的乙二醇乙醚水溶液200μl，浓度为0.08mol/l的cucl2水溶液200μl，浓度为0.06mol/l的茚三酮水溶液300μl，最后加入100μl样品充分混匀后，沸水浴反应35min，取出立即冷却，取200μl反应物到酶标板中，使用酶标仪测定od为480nm处的吸光值，根据赖氨酸标准品测得线性方程换算后得到相应的赖氨酸含量。设置三组平行重复试验，检测结果见表1。
33.表1 不同浓度壳聚糖处理后赖氨酸含量(mg/g dw)
[0034][0035]
由表1看出，金针菇发酵过程中，第二阶段处理48h后，处理浓度为0.01mg/ml后赖氨酸的含量相较于对照组(0mg/ml)增加了6.4％。
[0036]
实施例二
[0037]
(1)培养基配置同实施例一
[0038]
(2)向配置好的pda培养基中以5％(v/v)的接种量接入金针菇液体菌种，在温度为25℃，转速为150r/min的条件下，进行第一阶段的发酵，发酵时间分别为72-168小时。
[0039]
(3)第一阶段发酵结束后，在无菌条件下向发酵液中添加最终浓度为0.01mg/ml的壳聚糖，进行第二阶段的发酵，发酵时间分别为0，24，48，72，96小时。
[0040]
(4)第二阶段发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5～6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定赖氨酸含量。将烘干的菌丝用研钵磨成粉末，称取0.05g于2ml离心管中，加2ml去离子水，在超声波破碎仪中超声破壁2小时，期间每20分钟上下颠倒混匀一次，超声结束后取超声提取液12000r/min离心10min，上清液即为样品。在离心管中依次加入ph＝2的磷酸缓冲液100μl，浓度为5.5mol/l的乙二醇乙醚水溶液200μl，浓度为0.08mol/l的cucl2水溶液200μl，浓度为0.06mol/l的茚三酮水溶液300μl，最后加入100μl样品充分混匀后，沸水浴反应35min，取出立即冷却，取200μl反应物到酶标板中，使用酶标仪测定od为480nm处的吸光值，根据赖氨酸标准品测得线性方程换算后得到相应的赖氨酸含量。设置三组平行重复试验，检测结果见表2。
[0041]
表2 壳聚糖处理不同时间后赖氨酸含量(mg/g dw)
[0042][0043][0044]
由表2看出，金针菇发酵过程中，在0.01mg/ml壳聚糖的处理下，处理时间为24h、48h、72h、96h后，赖氨酸的含量相较于对照组(处理0h)分别增加5.5％、16.2％、9.6％、6％。其中，处理时间为48h后赖氨酸的含量增加最高。
[0045]
实施例三
[0046]
不同浓度和不同时间的壳聚糖处理对金针菇赖氨酸含量的提高均有明显影响，因此我们采用中心组合设计法(ccd)进行两因素设计试验优化壳聚糖处理对金针菇赖氨酸含量的影响，以壳聚糖处理时间和处理浓度两个因素分别作为自变量，以金针菇赖氨酸含量为响应值，得出分析结果见表3和图1：
[0047]
表3 ccd设计和响应
[0048][0049]
壳聚糖处理时间和处理浓度作为独立变量(x)，金针菇赖氨酸含量为因变量(y)，通过对两个因素进行寻优，最终得到优化结果：壳聚糖处理浓度为14.61μg/ml，壳聚糖处理时间为52.90h，分析结果表明响应值y的理论值为30.95mg/g。而后根据优化得到的实验处理条件组合进行实验验证，三次重复实验的金针菇菌丝体赖氨酸含量的平均值为30.92mg/gdw，与理论值相近，说明理论结果较为准确。
[0050]
实施例四
[0051]
在生产金针菇的工厂中进行金针菇子实体阶段的壳聚糖诱导实验。无菌接种金针菇后在工厂培养30天左右，菌丝长满菌包后进行搔菌，搔菌后为促进原基生成进行喷水阶段，保持湿度达到90％左右，这时将壳聚糖应用于试验，待菇柄长到一定长度及时采收。对照组用自来水，在需要喷水阶段，分别添加10μg/ml、14.61μg/ml、20μg/ml和30μg/ml的壳聚糖溶液50ml进行喷洒处理(从搔菌后喷洒到现蕾)，每个实验重复8瓶。当原基形成菇盖分化完全，降低生育室温度至4-8度。当小菇长出瓶口2cm左右，生育室控制在5度左右，套袋抑制，待金针菇菌柄长到15cm左右时及时采收，统计分析金针菇子实体的生长速度，结果如图2和表4。采收后，对于收获的金针菇在105℃下进行杀青，然后在60℃下烘干，用小型粉碎机进行粉碎，最后用研钵研细，过60目筛，最后采用与实施例一相同的方法对金针菇子实体中的赖氨酸含量进行测定，并且记录。
[0052]
表4 不同浓度壳聚糖溶液诱导对金针菇子实体赖氨酸含量和生长速度的影响
[0053][0054]
注：表中不同字母表示处理间存在显著性差异(p《0.05)。