一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液及细胞库的构建方法与流程

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液及细胞库的构建方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞存在于骨髓、胎盘、脐带、羊膜、脂肪等组织中。骨髓间充质干细胞是骨髓基质的主要成份，为骨髓的造血功能提供结构和功能上的支持。骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞，骨骼肌、软骨细胞平滑肌、肌腱细胞，造血支持基质等中胚层细胞分化的能力；同时可以向外胚层的星形胶质细胞、神经元、血管内皮细胞和心肌细胞分化。由于骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好，不论自体移植或异体移植免疫排斥反应弱等优点，还能分泌多种生长因子，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞，在临床中有着广阔的应用前景。
3.但是，骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，大约104～105个骨髓单核细胞中仅含有一个骨髓间充质干细胞，因此，仅仅通过自体或异体分离骨髓间充质干细胞显然无法满足临床需求，需要积极进行在体外培养骨髓间充质干细胞，并建立相应的细胞库保存细胞，以满足人们在应用上需求。
4.细胞库的建立过程中，需要将间充质干细胞和低温保护剂一起保存在
‑
196℃的气态液氮中，降温以及超低温的保存过程往往会对细胞造成不可逆的伤害，导致细胞库中的细胞在复苏后活性不能满足使用要求，因此需要改进冻存过程中用保存液，加强对细胞的保护，使细胞库中的细胞经复苏后能保持较好活性。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液，该保存液成分明确，安全，能有效提高细胞库中的细胞保存效率。
6.本发明的目的之二在于提供一种构建骨髓间充质干细胞库的方法。
7.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：海藻酸钠、铌酸钾纳、玉米幼芽提取物、菜豆素、白藜芦醇、肝素钠、谷胱甘肽。
8.进一步地，培养基中各成分的浓度为：海藻酸钠8
‑
13μg/ml、铌酸钾纳5
‑
10ng/ml、玉米幼芽提取物1
‑
5ng/ml、菜豆素4
‑
8 ng/ml、白藜芦醇10
‑
15μg/ml、肝素钠1
‑
5ng/ml、谷胱甘肽5
‑
10μg /ml。
9.进一步地，培养基中各成分的浓度为：海藻酸钠10μg/ml、铌酸钾纳7.5ng/ml、玉米幼芽提取物3ng/ml、菜豆素5 ng/ml、白藜芦醇12μg/ml、肝素钠3.5ng/ml、谷胱甘肽8μg /ml。
10.进一步地，所述培养基为dmem/f12培养基。
11.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种骨髓间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：取用于建库的骨髓间充质干细胞采用权利要求1至4任一项所述保存液重悬，分装在冻存管中，降温后转移至液氮中保存。
12.进一步地，所述用于建库的骨髓间充质干细胞为传代培养得到的p3代细胞。
13.进一步地，所述降温过程为：将冻存管预冷至4
‑
6℃后放入
‑
80℃的冰箱中保存24h，然后转移至液氮中。
14.进一步地，保存液中骨髓间充质干细胞的密度为1
‑8×
107个/ml。
15.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液，该保存液中成分明确，各成分协同作用，对骨髓间充质干细胞形成有效保护，提高细胞活性。保存液中添加的铌酸钾纳能有效降低在降温过程中细胞外形成冰晶尺寸，减小降温过程对细胞造成的损伤。保存液中还添加玉米幼芽提取物对细胞膜有保护作用，避免细胞膜中蛋白分子变性失去活性，和菜豆素一起稳定细胞状态，防止细胞在超低温的不适环境中失去活性而凋亡。
16.本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞库的构建方法，采用本发明的保存液对参与建库的细胞形成保护，提高细胞库中细胞的活性，避免因超低温保存导致细胞增殖活性和分化活性不能满足临床需求。
附图说明
17.图1为本发明实施例1、对比例1至6中的骨髓间充质干细胞诱导分化培养后alp活性。
具体实施方式
18.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
19.实施例1一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中以下成分组成：海藻酸钠10μg/ml、铌酸钾纳7.5ng/ml、玉米幼芽提取物3ng/ml、菜豆素5 ng/ml、白藜芦醇12μg/ml、肝素钠3.5ng/ml、谷胱甘肽8μg /ml。
20.一种骨髓间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：（1）取正常健康人的骨髓样本登记个人信息后在无菌环境下加入等体积的生理盐水，混合均匀后加入淋巴细胞分离液中，1000rpm/min离心10min，吸取中间层的单核细胞转移至离心管中，用pbs清洗2次后加入完全培养基（dmem/f12+10%fbs）重悬细胞，接种在培养皿中在37℃，5%co2的培养箱中培养，24h后更换培养基，此后每3天还液一次，至细胞汇合度到80%；（2）向步骤（1）的培养液中加入0.25%胰酶消化，离心后收集细胞，记为p0代，将p0代细胞用完全培养基重悬后接种在培养瓶中进行传代培养，传代比例为1:2，收集培养得到的p3代细胞作为建库细胞；
（3）将收获的p3代细胞离心去除培养基后加入保存液重悬，存液中骨髓间充质干细胞的密度为1
×
107个/ml，分装至冻存管中，每管2
‑
3ml保存液，将冻存管预冷至4℃后放入
‑
80℃的冰箱中保存24h，然后转移至液氮中保存，详细登记细胞保存信息，即完成细胞库的构建。
21.实施例2一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中以下成分组成：海藻酸钠8μg/ml、铌酸钾纳5ng/ml、玉米幼芽提取物1ng/ml、菜豆素4 ng/ml、白藜芦醇10μg/ml、肝素钠1ng/ml、谷胱甘肽5μg /ml。
22.一种骨髓间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：（1）取正常健康人的骨髓样本登记个人信息后在无菌环境下加入等体积的生理盐水，混合均匀后加入淋巴细胞分离液中，1000rpm/min离心10min，吸取中间层的单核细胞转移至离心管中，用pbs清洗2次后加入完全培养基（dmem/f12+10%fbs）重悬细胞，接种在培养皿中在37℃，5%co2的培养箱中培养，24h后更换培养基，此后每3天还液一次，至细胞汇合度到85%；（2）向步骤（1）的培养液中加入0.25%胰酶消化，离心后收集细胞，记为p0代，将p0代细胞用完全培养基重悬后接种在培养瓶中进行传代培养，传代比例为1:3，收集培养得到的p3代细胞作为建库细胞；（3）将收获的p3代细胞离心去除培养基后加入保存液重悬，存液中骨髓间充质干细胞的密度为5
×
107个/ml，分装至冻存管中，每管2
‑
3ml保存液，将冻存管预冷至6℃后放入
‑
80℃的冰箱中保存24h，然后转移至液氮中保存，详细登记细胞保存信息，即完成细胞库的构建。
23.实施例3一种构建骨髓间充质干细胞库用保存液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中以下成分组成：海藻酸钠13μg/ml、铌酸钾纳10ng/ml、玉米幼芽提取5ng/ml、菜豆素8 ng/ml、白藜芦醇15μg/ml、肝素钠5ng/ml、谷胱甘肽10μg /ml。
24.一种骨髓间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：（1）取正常健康人的骨髓样本登记个人信息后在无菌环境下加入等体积的生理盐水，混合均匀后加入淋巴细胞分离液中，1000rpm/min离心10min，吸取中间层的单核细胞转移至离心管中，用pbs清洗2次后加入完全培养基（dmem/f12+10%fbs）重悬细胞，接种在培养皿中在37℃，5%co2的培养箱中培养，24h后更换培养基，此后每3天还液一次，至细胞汇合度到90%；（2）向步骤（1）的培养液中加入0.25%胰酶消化，离心后收集细胞，记为p0代，将p0代细胞用完全培养基重悬后接种在培养瓶中进行传代培养，传代比例为1:2，收集培养得到的p3代细胞作为建库细胞；（3）将收获的p3代细胞离心去除培养基后加入保存液重悬，存液中骨髓间充质干细胞的密度为8
×
107个/ml，分装至冻存管中，每管2
‑
3ml保存液，将冻存管预冷至4℃后放入
‑
80℃的冰箱中保存24h，然后转移至液氮中保存，详细登记细胞保存信息，即完成细胞库的构建。
25.对比例1
对比例1提供一种保存液，和实施例1的区别为：省去铌酸钾纳，其余均和实施例1相同。
26.对比例2对比例2提供一种保存液，和实施例1的区别为：省去玉米幼芽提取物，其余均和实施例1相同。
27.对比例3对比例3提供一种保存液，和实施例1的区别为：省去菜豆素，其余均和实施例1相同。
28.对比例4对比例4提供一种保存液，和实施例1的区别为：省去玉米幼芽提取物和菜豆素，其余均和实施例1相同。
29.对比例5对比例5提供一种保存液，和实施例1的区别为：省去铌酸钾纳、玉米幼芽提取物和菜豆素，其余均和实施例1相同。
30.从液氮中取出冻存12个月的细胞，实施例1至3和对比例1至5中各取3管，立即放入预热至37℃的水浴中，待细胞复苏后，离心后收集细胞，用pbs制成悬液，取1ml细胞悬液置于ep管中，加入0.2ml0.5%台盼蓝染色，计算台盼蓝拒染率，得出细胞存活率，取三管的平均值。结果如表1所示。
31.表1样品细胞活率（%）实施例192.17实施例290.08实施例390.95对比例168.76对比例272.18对比例375.84对比例465.38对比例561.55由表1可以看出实施例1至3中的细胞在保存12个月后细胞活率均在90%以上，对比例1至5中调整了保存液的组成后细胞的活率均有不同程度的下降。
32.对比例1中省去了铌酸钾纳，在保存12个月后，细胞存活率仅为68.76%，下降显著，这是因为在保存液中添加的铌酸钾纳能有效降低在降温过程中细胞外形成冰晶尺寸，减小降温过程对细胞造成的损伤，进而提高细胞的活率。
33.对比例2至3中分别省去玉米幼芽提取物、菜豆素，对比例4中同时省去上述两种成分，对比例5中同时省去了铌酸钾纳、玉米幼芽提取物和菜豆素，细胞活率均有不同程度的下降，这是因为保存液中的玉米幼芽提取物对细胞膜有保护作用，避免细胞膜中蛋白分子变性失去活性，和菜豆素一起稳定细胞状态，防止细胞在超低温的不适环境中失去活性而凋亡。本发明保存液中各成分协同作用，对骨髓间充质干细胞形成有效保护，提高细胞活性。
34.取实施例1，对比例1的冻存液30μl滴加至
‑
60℃预冷的硅片表面，利用冷热台以20℃/min升温至
‑
6℃，在该温度下退火30min，利用偏光显微镜及高度摄像机观察记录冰晶的大小，每个样品重复三次，取平均值，结果如表2所示。
35.表2样品冰晶尺寸（μm）实施例1179
±
44对比例1764
±
95由表2可以看出对比例1中的冰晶尺寸远远大于实施例1，说明铌酸钾纳能有效降低在降温过程中细胞外形成冰晶尺寸。
36.取未经冻存的p3代细胞作为对比例6，取实施例1，对比例1至5中保存12个月后的细胞复苏后离心，采用完全培养基重悬实施例1，对比例1至6中的细胞，培养24h后更换为诱导培养基（dmem/f12+地塞米松10mmol/l+β
‑
甘油磷酸钠8mmol/l+抗坏血酸40μmol/l），每3天换液一次，连续培养14天，将细胞裂解于ph7.4的tris
‑
hcl缓冲液中，12000r/min离心5min，收集上清液，采用alp试剂盒检测各组细胞的alp活性，结果如图1所示。由图1可知实施例1和对比例6中细胞的alp活性相差不大，向成骨方向分化的骨髓间充质干细胞较多，对比例1至5中均有不同程度的下降，说明本发明的保存液可以更好的维持骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，保持细胞的分化潜能。
37.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。