氯烷酰基氟喹诺酮在制备用于防治柑橘溃疡病的药物中的应用

1.本发明属于病害防治技术领域，具体涉及氯烷酰基氟喹诺酮在制备用于防治柑橘溃疡病的药物中的应用。


背景技术：

2.柑橘作为世界上的第一大水果，其产量和经济价值决定了它在整个果树产业中的主导地位。近年来，中国柑橘产业发展迅速，栽培面积和年产量已超过美国和巴西，成为世界第一大柑橘生产国；与此同时，柑橘产业已经逐渐成为促进农村经济发展和保障农民增收的重要支柱产业。然而，柑橘果实在生长和贮藏运输等过程中常易受到病虫害的侵染，特别是柑橘溃疡病的侵害。
3.柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(xanthomonas axonopodis pv.citri，xac)引起的为害全世界柑橘种植业的重要细菌病害，主要侵染芸香科柑桔属、枳属及金柑属植物的叶片、树梢、果实、皮刺、树干等地上部分，可造成萎黄环包围的溃疡及果实或叶片表面坏死，叶片上的水浸状病变，叶片木栓化等；除了叶片症状外，还能导致果实脱落、果树老化，且使感染果实失去商品价值。目前中国各主要柑橘产区皆有柑橘溃疡病发生，造成柑橘产业的严重损失。
4.柑橘溃疡病防治和根除的费用很高，而且根除效果不明显，目前国内外主要以预防为主，通过在非柑橘溃疡病区域育苗、喷洒铜制剂和农用抗生素来预防和减少溃疡病的蔓延。然而，长期使用铜制剂易产生耐药性、通过病菌间的水平转移引起重金属耐受性和使铜离子在土壤中积累成为潜在的植物性毒素且影响环境等缺点，且铜制剂对于果实也是一种危害，特别是在干热环境下使用。最近农用链霉素的使用被禁止，对溃疡病菌有效的控制药剂严重缺乏，迫切需要新的药剂来代替。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的第一目的在于提供氯烷酰基氟喹诺酮在制备用于防治柑橘溃疡病的药物中的应用。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
7.式(i)所示化合物在制备用于防治柑橘溃疡病的药物中的应用：
8.9.式中，r1为r2为-h、-cl或-och3，r3为为
10.本发明的第二目的还在于提供用于防治柑橘溃疡病的药物，所述药物包括式(i)所示化合物：
[0011][0012]
式中，r1为r2为-h、-cl或-och3，r3为为
[0013]
其中，所述药物为水分散粒剂，包括式(i)所述化合物10wt％、润湿剂2wt％-6wt％、分散剂7％-15％、崩解剂4wt％-11wt％和填料余量。
[0014]
或者，所述药物为可湿性粉剂，包括式(i)所述化合物10wt％、润湿剂2wt％-6wt％、分散剂7％-15％和填料余量。
[0015]
其中，所述润湿剂为十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠；和/或，所述分散剂为聚缩酸盐分散剂；和/或，所述填料包括高岭土和硅藻土。
[0016]
优选的，高岭土和硅藻土的质量比为1-1.5:1。
[0017]
优选的，所述崩解剂为氯化钠。
[0018]
本发明的有益效果在于：
[0019]
本发明的药物，不仅室内测试活性优秀，而且大田评估也表明，其对柑橘溃疡病具有良好的防治效果。
[0020]
本发明的药物不易引起耐受性问题。
[0021]
本发明的药物不存在安全隐患。
附图说明
[0022]
图1为化合物1的核磁共振谱图1hnmr；
[0023]
图2为化合物1的高效液相色谱图；
[0024]
图3为化合物2的核磁共振谱图1hnmr；
[0025]
图4为化合物3的核磁共振谱图1hnmr。
具体实施方式
[0026]
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。除特别说明外，本发明所述“％”为质量百分含量，所述比例为质量比。
[0027]
本发明中，核磁共振氢谱和质谱委托重庆大学进行检测；
[0028]
本发明中，高效液相色谱委托重庆市食品药品检验所进行检测。
[0029]
实施例：
[0030]
本实施例分别提供了三种化合物的合成方式及其活性检测数据，还提供了该三种化合物所制成的药物以及所述药物的活性检测数据。另外，还分别对三种化合物所制成的药物进行了田间试验，现本实施例中针对其中一种化合物制成的药物，提供了具体的田间实验数据，具体内容如下：
[0031]
一、化合物合成
[0032]
1.1编号223分子即化合物1(简称3c-clx)的合成
[0033][0034]
向100ml圆底烧瓶中加入克林沙星(clx)盐酸盐1mmol和二氯甲烷(dcm)2ml，冰盐浴冷却，磁力搅拌，倒入nahco
3 4mmol，搅拌20min后用恒压滴液漏斗滴加3-氯丙酰氯2.5mmol的dcm溶液(5ml，滴加速度约为1d/4s)，滴毕，冰浴中持续搅拌反应，薄层层析(tlc)跟踪监测至反应结束。停止搅拌，加入冰冷饱和食盐水15ml和dcm 20ml,搅拌下用2mol/l hcl溶液调节h＝2-3。移至分液漏斗，分液，dcm萃取(20ml
×
2)，合并有机相，以0.5mol/l hcl溶液(10ml
×
3)、饱和食盐水(20ml
×
2)、水(10ml
×
1)依次洗涤，无水na2so4干燥，旋蒸。粗产物加乙酸乙酯(ea)5ml溶解，加入石油醚(pe)10ml后有大量白色固体析出，抽滤，固体采用pe+ea(体积比1.1-1.8:1)分散，得到纯品0.40g，收率81％。
[0035]
表1化合物1合成实验结果
[0036][0037]
工艺优化后合成此分子的实验结果见表2。
[0038]
表2化合物1的合成及其结果
[0039][0040][0041]
共计得到230克左右样品。
[0042]
对制得的样品进行核磁氢谱检测、高效液相色谱检测和高分辨质谱检测，结果如图1、图2和表3所示。
[0043]
表3化合物1的高分辨质谱数据
[0044][0045]
1.2编号221化合物即化合物2(简称4c-sar)的合成
[0046][0047]
向100ml圆底烧瓶中加入2mmol沙拉沙星(sar)盐酸盐和2ml dcm，冰盐浴冷却，磁力搅拌，加入8mmol nahco3，20min后用恒压滴液漏斗滴加5.0mmol 4-氯丁酰氯的dcm溶液(滴加速度约为1d/4s)，滴毕，冰浴下持续搅拌反应，tlc跟踪监测至反应结束。停止搅拌，加入冰冷饱和食盐水15ml和dcm 20ml，搅拌下用2mol/l hcl溶液调节ph＝2-3,有乳化固体，静置，抽滤，滤饼用dcm洗3次，滤液移至分液漏斗，分液，水相用dcm萃取(20ml
×
2)，合并有机相，饱和食盐水洗涤(20ml
×
2)、少量水洗涤(10ml
×
1)，收集有机相，无水na2so4干燥，旋蒸，将粗产物用pe/ea溶液分散后有白色固体析出，抽滤得白色固体，用pe-ea分散2次，真空干燥得到0.78g白色固体纯品，收率85％。合成实验结果见表4。
[0048]
表4化合物2合成实验结果
[0049][0050][0051]
对所得的样品进行核磁氢谱检测，结果如图3所示。
[0052]
1.3编号204分子即化合物3(简称2c-gat)的合成
[0053][0054]
向100ml圆底烧瓶中加入加替沙星(gat)、dcm，磁力搅拌，加入nahco3粉末，转入-10℃低温反应器。20mi后用恒压滴液漏斗滴加氯乙酰氯的dcm溶液，控制滴加速度约为1d/4-7s。滴毕，持续-10℃搅拌反应，tlc跟踪监测至反应结束。若加替沙星没有反应完全，补加氯乙酰氯的dcm溶液。反应毕，停止搅拌,加入冰冷饱和食盐水和dcm，搅拌下用2mol/l hcl溶液调节ph＝4-5，静置，分液漏斗分液，饱和食盐水洗涤、少量水洗涤，收集有机相，无水na2so4干燥，旋蒸得黄色油状液体，加入dcm和石油醚打浆处理，冷藏后旋干，可得到淡黄色固体，然后采用乙酸乙酯和石油醚分散处理，有白色固体析出，抽滤得白色固体，真空干燥
得到纯品。合成实验结果见表5。
[0055]
表5化合物3合成实验结果
[0056][0057]
对本实施例制得的样品进行核磁氢谱检测检测，结果如图4所示。
[0058]
表6第一批样品信息
[0059][0060][0061]
表7第二批样品信息
[0062][0063]
注：表6和表7中的纯品b是指化合物纯度≥98.5％。
[0064]
二、化合物的活性检测
[0065]
检测化合物1-3对地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(xanthomonas axonopodis pv.citri,xac)的活性，结果如表8和表9所示。
[0066]
其中，化合物抑制柑橘溃疡病菌的活性测试方法为：
[0067]
材料与试验菌株：
[0068]
柑橘溃疡病菌rl菌株(xanthomonas campestris pv.citri,rl strain，保存在西
南大学柑桔研究所综合防治课题组)。
[0069]
培养基的配制：实验选用lb液体培养基。
[0070]
菌悬液的制备：将柑橘溃疡病菌rl菌株在pda培养基上活化，28℃培养3天以后，在超净工作台上用蓝枪头管口轻轻刮取少量菌落于无菌水中，于摇床上28℃，200r震荡培养2h制成菌悬液。
[0071]
对照药剂采用农用噻霉酮(smt)、喹啉酮(klt)或链霉素(lms)。制剂和阳性对照噻霉酮母液的配制：准确称取化合物，溶于无菌水或有机溶剂中配置成1mg/ml的母液备用。
[0072]
测试方法：实验在96孔板上进行，每种原药设置6个稀释浓度，见表8，按照标准梯度稀释法稀释；充分混匀后于28℃恒温培养箱中培养48h；使用分光光度计测定od
600
时的吸光值，并按照以下公式计算抑菌率：
[0073]
抑菌率％＝ckod
600
–
(化合物od
600
–
该化合物ck1 od
600
)/ckod
600
*100
[0074]
数据分析采用测定毒力回归方程，计算lc50和95％置信限。
[0075]
表8化合物对柑橘溃疡病菌的抑制活性(％)
[0076][0077]
表9化合物抑制柑橘溃疡病菌的复筛数据
[0078][0079]
三、药物的制备
[0080]
本实施例中分别提供药物的两种剂型的制备方法，分别为可湿性粉剂和水分散粒剂，具体如下：
[0081]
3.1水分散粒剂制备
[0082]
每一原药样品取0.5克，按照表10所示配方制备水分散粒剂。
[0083]
表10制剂配方
[0084][0085][0086]
wg为水分散粒剂的简称。水分散粒剂的制备方法为：按配方将助剂和原药混匀，在万能粉碎机中粉碎30s，取出后再次充分混匀；向粉碎混匀的样品中加适量的水(水量以刚好能够挤出颗粒为最佳)，然后将样品在挤压造粒机中挤压造粒；将造粒所得的样品烘干、整粒、筛分，制得水分散粒剂。
[0087]
3.2可湿性粉剂制备
[0088]
每一原药样品取0.5克，按照表11所示配方制备其可湿性粉剂。
[0089]
表11制剂配方
[0090][0091]
其中，wp为可湿性粉剂的简称。可湿性粉剂的制备方法为按照配方称取原药、润湿
剂、分散剂及填料，在万能粉碎机中进行预混合、粗粉碎，然后再按气流粉碎机粉碎流程进行细粉碎，筛分后得到可湿性粉剂。
[0092]
四、药物的活性检测
[0093]
检测表10和表11所述制剂对地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(xanthomonas axonopodis pv.citri，xac)的活性，结果如表12-表15所示；
[0094]
其中，制剂对柑橘溃疡病菌的活性检测方法如下：
[0095]
4.1材料与试验菌株
[0096]
柑橘溃疡病菌rl菌株(xanthomonas campestris pv.citri,rl strain，保存在西南大学柑桔研究所综合防治课题组)；
[0097]
4.2试验方法
[0098]
实验在96孔板上进行，每个原药制成的药剂设置6个(分别配置成2000、4000、8000、16000、32000和64000倍稀释液，亦即0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.015625mg/kg浓度)，每个浓度5次重复，不同浓度对应设置不加菌悬液的对照ck1(以此排除化合物自身颜色影响)，并同时设置不加药剂只加菌的对照(ck)。采用标准倍比稀释法依次稀释样品溶液，最后制成总体积200μl的混合菌液，使得各样品最终浓度分别为a(0.5μg/ml)、b(0.25μg/ml)、c(0.125μg/ml)、d(0.0625μg/ml)、e(0.03125μg/ml)、f(0.015625μg/ml)；ck1中菌悬液体积用20μl lb培养基代替，ck中则利用灭菌水补足化合物体积；充分混匀后于28℃恒温培养箱中培养48h；
[0099]
使用分光光度计测定od
600
时的吸光值，并按照以下公式计算抑菌率；
[0100]
抑菌率％＝ckod
600
–
(化合物od
600
–
该化合物ck1 od
600
)/ckod
600
*100
[0101]
数据分析采用测定毒力回归方程，计算lc50和95％置信限。
[0102]
表12可湿性粉剂不同浓度细菌生长量平均值概括表(2019-02-19数据)
[0103][0104]
表13可湿性粉剂毒力回归方程表(2019-02-19数据)
[0105]
[0106][0107]
表14水分散粒剂抑制柑橘溃疡病活性数据(2021-03-17数据)
[0108]
[0109][0110]
表15水分散粒剂毒力方程(2021-03-17数据)
[0111]
[0112][0113]
五、化合物1所制成的可湿性粉剂的田间试验防效评估
[0114]
检测可湿性粉剂的田间防效，具体如下：
[0115]
5.1试验条件
[0116]
5.1.1试验对象、作物和品种的选择
[0117]
柑桔溃疡病xanthomonas campestris
[0118]
柑桔(塔罗科血橙)
[0119]
5.1.2作物栽培及环境条件
[0120]
果园为坡地。肥水管理水平基本一致，光照条件好。枳橙砧，树龄6年生，株行距3
×
4m,亩栽55株，平均株高1.8m、冠幅1.2m。近年来柑桔溃疡病发生较严重，试验开始时零星发病。试验期间未施肥也未灌溉。
[0121]
5.2试验设计和安排
[0122]
5.2.1药剂
[0123]
试验药剂
[0124]
制得的10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂，具体制备步骤如下；
[0125]
按照硅藻土34.5％、高岭土34.5％、润湿剂sds 6％、聚缩酸盐9％、nacl 6％、原药10％的配比，称量硅藻土255.3g、高岭土255.3g、润湿剂sds 44.4g、聚缩酸盐66.6g、nacl 44.4g，加入至机器中搅拌研磨均匀，然后投入化合物1即3c-clx 74g；再按气流粉碎机粉碎流程进行细粉碎，获得可湿性粉剂约695g。
[0126]
对照药剂
[0127]
细刹(3％噻霉酮可湿性粉剂，陕西西大华特生产)；
[0128]
可杀得3000(46％氢氧化铜水分散粒剂，美国杜邦公司生产)；
[0129]
5.2.2药剂用量与处理编号
[0130]
表16供试药剂试验设计
[0131]
[0132]
5.2.3小区排列
[0133]
随机区组排列。
[0134]
小区面积和重复
[0135]
小区面积(或植株数)：每个小区为8株树，4次重复，小区间留保护树。
[0136]
5.3施药方法
[0137]
5.3.1使用方法
[0138]
喷雾。先往电动喷雾器里加入所需用水量的一半；药剂直接用量杯量取，直接倒入喷雾器内；再加水到方案所需用水量，摇匀，对柑桔树进行均匀喷雾。
[0139]
5.3.2施药器械
[0140]
试验用利农hd-400手动喷雾器。该喷雾器施药能保证药量准确、分布均匀。
[0141]
5.3.3施药时间和次数
[0142]
试验第一次于4月13日春梢期，梢长5-10cm时进行，新梢叶片零星发病。第二次于5月8日幼果期喷药。
[0143]
5.3.4使用容量
[0144]
10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂稀释400倍、800倍和1600倍；3％噻霉酮可湿性粉剂(对照)稀释1000倍；46％氢氧化铜水分散粒剂稀释1500倍。每株树喷药液量1l，具体如表16所示。
[0145]
5.4调查、记录和测量方法
[0146]
5.4.1气象及土壤资料
[0147]
气象资料
[0148]
表17气象情况
[0149][0150][0151]
表18施药当日试验地天气状况表(2021)
[0152][0153]
土壤资料
[0154]
土壤为红黄壤土，ph值为7.0，土壤肥力中等(有机值含量0.85g/
㎏
)。
[0155]
5.4.2调查方法、时间和次数
[0156]
调查时间和次数
[0157]
药前新梢叶片零星发病，未作病情基数调查。于6月25日，对夏梢叶片进行分级调
查。共调查1次。
[0158]
调查方法
[0159]
每小区调查10株树，每株树按东、南、西、北、中5点取样，每点分级调查4个当年生夏梢上的全部叶片，10株共查200个梢。
[0160]
叶片分级方法：
[0161]
0级：无病；
[0162]
1级：每叶有病斑1～5个；
[0163]
3级：每叶有病斑6～10个；
[0164]
5级：每叶有病斑11～15个；
[0165]
7级：每叶有病斑16～20个；
[0166]
9级：每叶有病斑20个以上。
[0167]
5.5药效计算方法
[0168][0169][0170]
对作物的直接影响
[0171]
无。
[0172]
产品的产量和质量
[0173]
不需要提供。
[0174]
对其他生物影响
[0175]
对其他病虫害的影响
[0176]
未发现有影响。
[0177]
对其他非靶标生物的影响
[0178]
对天敌安全。
[0179]
5.6结果与分析
[0180]
显著性测定采用邓肯氏新复极差(dmrt)法。
[0181]
表19 10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂防治柑橘溃疡病田间药效实验(2021)
[0182][0183][0184]
表20 10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂防治柑橘溃疡病田间药效实验
[0185][0186]
由表19和表20可知，10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂对柑橘柑橘溃疡病具有较好的防治效果，末次药后48天防效在89％以上。10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂稀释800倍的防效可达90.23％，与46％氢氧化铜水分散粒剂1500倍效果相当，优于3％噻霉酮可湿
性粉剂1000倍液防效。10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂稀释1600倍的防效可达89.05％，与46％氢氧化铜水分散粒剂1500倍效果相当，优于3％噻霉酮可湿性粉剂1000倍液防效，不及10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂稀释800倍的防效。在试验过程中发现该药剂高浓度对柑桔嫩梢叶片和果实没有药害，对天敌也安全，因此在田间可喷洒高浓度的10％氯丙酰基克林沙星可湿性粉剂来防治柑橘溃疡病。
[0187]
通过在田间对柑桔叶片进行防治柑橘溃疡病的药剂试验，证明本本发明的药剂高稀释浓度下对柑桔溃疡病的防治效果较好。在田间实验建议喷洒高浓度药剂进行防治柑橘溃疡病。采用喷雾方法，晴天露水干后进行，将药液稀释后均匀周到地喷于嫩梢叶片上。最好在发病前进行，每10天左右施1次，连施2～3次，可减轻柑桔溃疡病对新梢叶片的为害。为延缓抗药性的产生，建议多种药剂交替使用。
[0188]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。