建立放射性颌骨骨坏死动物模型的方法

1.本发明属于医学动物模型领域，具体发明涉及建立颌骨骨坏死动物模型的方法。


背景技术：

2.放射治疗是临床治疗头颈恶性肿瘤的重要方案，可大大提高肿瘤的治疗效果。但与辐射治疗有关的并发症却严重影响到病人的生活水平和后期恢复。放射性颌骨骨坏死(osteoradionecrosis of jaws，ornj)是最为严重并发症之一,至今颌骨放射性骨坏死的发病机制尚不完全清楚。理想的ornj动物模型，对于研究其发病机制、预防措施及治疗方案均具有重要意义。近年来，关于ornj动物模型构建研究出现不同方法，国内外尚缺乏一种理想高效的ornj动物模型。


技术实现要素：

3.本发明针对现有技术不同动物、放射部位和放射剂量对模型建立的效果区别较大，现有技术中存在成模率低、死亡率高、效率低、周期长等问题，提供了一种建立放射性颌骨骨坏死动物模型的方法，通过创造性设立建模条件，在多种建模条件并对比建模效果择优选出一种成模率高、死亡率低、建模时间短、效率高的ornj建模条件。
4.具体的，本发明提供了一种建立放射性颌骨骨坏死动物模型的方法，所述动物模型建立方法是先行拔牙术，一周后进行放射，放射结束后第7、14、21、28、35d进行下颌骨micro-ct扫描、组织病理学观察以确定构建放射性颌骨骨坏死模型。
5.更加优选的，本发明所述动物模型建立方法包括如下步骤：
6.(1)给大鼠在准备放射侧行拔牙术。
7.(2)拔牙术后大鼠适应性饲养1周，麻醉大鼠以做放射准备，用生物学辐照器的模拟定位仪定位放射范围。
8.(3)定位后，使用直线加速器进行放射，按照剂量分组进行放射，左侧为放射侧。
9.(4)放射后每周观察局部及全身情况，处死后行micro-ct扫描检测，取其下颌骨进行免疫组化染色。
10.(5)处死大鼠后利用micro-ct层距进行逐层扫描，以观察颌骨异常部位。
11.(6)取扫描后的大鼠左侧下颌骨，生理盐水冲洗后置于多聚甲醛液室温下固定24h-96h，流动水冲洗过夜后置于的edta脱钙液中，经脱钙、包埋、连续切片后行苏木精-伊红染色和masson三色染色，显微镜下观察其纤维化及骨破坏程度，以此来评估下颌骨骨组织及细胞的损伤情况。
12.(7)每七天通过取材组织皮质骨的病理学观察一次，至放射后第28天处死的大鼠骨髓腔失去原有形态，被大量增生的纤维组织充填。
13.具体地说，本发明所述直线加速器的放射线为x线，能量6mv，以放射总剂量70gy作为标准进行等效计算，得到7gy/次剂量并进行5次放射，隔日1次。
14.本发明所述处死大鼠后利用micro-ct，选择视野范围40*60mm、电压80kv、电流500
μa、19.54μm分辨率、19.54μm层距进行逐层扫描，以观察颌骨异常部位。
15.本发明所述步骤(6)生理盐水冲洗后置于4％多聚甲醛液室温下固定48h，流动水冲洗过夜后置于10％的edta脱钙液中，经脱钙、包埋、连续切片后行苏木精-伊红染色和masson三色染色，显微镜下观察其纤维化及骨破坏程度，每个样本在20倍镜下选择6张照片，由3个观察者进行空白骨陷窝及骨陷窝内骨细胞计数，以此来评估下颌骨骨组织及细胞的损伤情况。
16.本发明所述所述放射组大鼠在放射后第7d逐渐出现体重减轻、口内黏膜溃烂、放射区脱毛、咬合紊乱、颊部瘘道溢浓等临床症状，14d后放射区黏膜溃烂等症状减轻，脱毛区开始有新的毛发长出，放射组大鼠在整个实验过程中精神状态尚可，存活率达100％。
17.本发明所述步骤(2)放射位置为前界臼齿前缘、后界下颌骨升支后缘、上界下颌骨牙槽嵴、下界为下颌骨下缘。
18.本发明所述步骤(1)行放射侧拔牙术时，采用吸痰器吸去术中及术后产生的出血、唾液痰液等减少阻塞呼吸致缺氧死亡的现象。
19.本发明中，放射结束后每次饲喂同步服用黄烷-3-醇。饲喂的黄烷-3-醇来源于荔枝核，每次饲喂食用1/8-1/16荔枝核。
20.本发明的有益效果:
21.本发明提供的建立放射性颌骨骨坏死动物模型的方法，采用基础研究应用广泛的sd大鼠使得实验成本较低、易于操作且对放射敏感，成模率高、死亡率低、建模时间短、效率高的ornj建模条件。
附图说明
22.图1是本发明放射后第14d前对照组大鼠micro-ct三维扫描并重建的动态结果显示图。
23.图2是本发明放射后第14d前放射组大鼠micro-ct三维扫描并重建的动态结果显示图。
24.图3是本发明第21d时放射组大鼠micro-ct三维扫描并重建的动态结果显示图。
25.图4是本发明第28d时放射组大鼠micro-ct三维扫描并重建的动态结果显示图。
26.图5是本发明he染色结果显示图。
27.图5中，a空白对照组骨组织；b箭头所示为放射组骨髓腔中出现空白骨陷窝，方框所示为骨陷窝内骨细胞核缩小即死骨；c方框所示为放射组骨髓腔内出现明显纤维化。
28.图6是本发明masson染色结果显示图。
29.图6中，d对照组骨髓腔；e放射组骨髓腔内出现大量的纤维组织增生，空白骨陷窝增多。
30.图7是对照组和放射组大鼠体重变好曲线图。
具体实施方式
31.下面结合附图1-7和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。
32.一、实验动物及分组。
33.sd雄性大鼠20只(由空军军医大学大学实验动物中心提供)，无特定病原体动物(spf级)，鼠龄12周，体重280～320g。所有大鼠饲养于实验室动物房，室温(22
±
2)℃；湿度50％～70％，自由进食、饮水。适应性饲养1周后将其随机分为放射组(a组)和对照组(b组)，每组10只。
34.二、放射方案
35.1.取a组大鼠在准备放射侧行拔牙术:全麻后常规消毒铺巾,拔除左侧下颌第一及第二磨牙,拔除后消毒棉抵住拔牙窝以减少出血,局部压迫止血10min,观察无出血后放回笼中自然苏醒，b组为对照组做相同处理。
36.2.拔牙术后大鼠适应性饲养1周，麻醉大鼠以做放射准备,首先采用陕西省核工业二一五医院放疗科varian cx5762型x线生物学辐照器的模拟定位仪(acuity)定位放射范围:前界臼齿前缘、后界下颌骨升支后缘、上界下颌骨牙槽嵴(包括牙冠)、下界为下颌骨下缘。定位后,使用直线加速器进行放射，按照剂量分组进行放射,左侧为放射侧。直线加速器(clinac cx,美国)的放射线为x线,能量6mv，按照外放射源高分割多次放射的理念，根据生物学等效公式：bed＝nd[1+d/(α/β)]，n表示放射次数，d为每次放射剂量，α/β头颈鳞状细胞癌的放疗常数值取10，正常组织取3，以放射总剂量70gy作为标准进行等效计算，得到7gy/次剂量并进行5次放射，隔日1次。对照组仅带至放射地点但不接受放射处理。放射后分别于第7、14、21、28、35d处死2只放射组大鼠及对照组大鼠。
[0037]
本发明中，在行照射侧拔牙术时，采用吸痰器吸去术中及术后产生的血液、唾液和痰液。在多次实验中发现相比没有使用自制吸痰器吸痰的，使用吸痰器会减少阻塞呼吸致缺氧死亡的现象，使造模动物的存活率更高。
[0038]
本发明中，放射结束后每次饲喂同步服用黄烷-3-醇。饲喂的黄烷-3-醇来源于荔枝核，每次饲喂食用1/8-1/16荔枝核。在多次实验中发现相比没有饲喂荔枝核的，饲喂荔枝核的放射组大鼠各个症状出现时间提前3-5天左右，放射更敏感，成模率高。
[0039]
3主要观察指标
[0040]
放射后每周观察局部及全身情况,处死后行micro-ct扫描检测，取其下颌骨进行免疫组化染色。
[0041]
3.1micro-ct扫描
[0042]
处死大鼠后利用micro-ct(siemens inveon micro ct，germany)，选择视野范围(ccd-fov)40*60mm、电压80kv、电流500μa、19.54μm分辨率、19.54μm层距进行逐层扫描，以观察颌骨异常部位。
[0043]
3.2组织病理学观察
[0044]
取扫描后的大鼠左侧下颌骨，生理盐水冲洗后置于4％多聚甲醛液室温下固定48h，流动水冲洗过夜后置于10％的edta(ph 7.2)脱钙液中，经脱钙、包埋、连续切片后行苏木精-伊红染色和masson三色染色。显微镜(eclipse 55i)下观察其纤维化及骨破坏程度，每个样本在20倍镜下选择6张照片，由3个观察者进行空白骨陷窝及骨陷窝内骨细胞计数，以此来评估下颌骨骨组织及细胞的损伤情况。
[0045]
3.3统计学方法
[0046]
使用spss 18.0进行统计学分析。
[0047]
下颌骨病理变化与放射后的时间存在交互作用，因此对配对样本两组间采用完全
随机设计两因素方差分析(twowayanova)；配对样本组内采用完全随机单因素方差分析(one-wayanova)，p＜0.05为差异有统计学意义。
[0048]
1.临床大体动态评价。
[0049]
放射组大鼠在放射后第7d逐渐出现体重减轻、口内黏膜溃烂、放射区脱毛、咬合紊乱、颊部瘘道溢浓等临床症状。14d后放射区黏膜溃烂等症状减轻，脱毛区开始有新的毛发长出。放射组大鼠在整个实验过程中精神状态尚可，存活率达100％。
[0050]
2.micro-ct三维重建动态评价。
[0051]
micro-ct三维扫描并重建的动态结果显示，放射后第14d前放射组大鼠较对照组大鼠并未见明显的影像学改变(如图1和图2所示)，至第21d时放射组大鼠开始出现皮质骨表面粗糙，牙槽间隔轻微破损(如图3所示)，至第28d时才出现明显的牙槽间隔破坏，皮质骨缺损(如图4所示)。
[0052]
3组织病理学动态评价。
[0053]
通过取材组织皮质骨的病理学观察：he染色结果显示，放射后第7天即可见空白骨陷窝增多，骨细胞减少，放射后第21天处死的大鼠拔牙窝与门齿牙根周围均可见局部骨坏死，放射后第28天处死的大鼠皮质骨坏死程度进一步加重，大量纤维组织充填骨缺损区域，死骨呈游离状(如图5所示)。masson染色结果显示放射后第14天骨髓腔内开始出现纤维化组织，至放射后第28天处死的大鼠骨髓腔失去原有形态，被大量增生的纤维组织充填(如图6所示)。
[0054]
放射组大鼠在放射后第7d体重日减5g以上，逐渐出现体重减轻、口内黏膜溃烂、放射区脱毛、咬合紊乱、颊部瘘道溢浓等临床症状。至第14天后体重开始逐步上升，同时放射区黏膜溃烂等症状减轻，脱毛区开始有新的毛发长出。组织病理切片在20倍镜下每个样本选择6张镜下照片，观察空白骨陷窝及骨陷窝内骨细胞计数，以此来评估下颌骨骨组织损伤情况。
[0055]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。