用于控制昆虫害虫的组合物和方法与流程

用于控制昆虫害虫的组合物和方法
1.本技术是申请日为2015年7月28日、申请号为201580041557.2、发明名称为“用于控制昆虫害虫的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用和序列表的并入
3.本技术要求于2014年7月29日提交的美国临时专利申请第62/030,430号的优先权，所述临时专利申请通过引用整体并入本文。文件“40-21_60779_0000_us_st25.txt”(2098千字节，于2014年7月26日创建，于2014年7月29日以美国临时专利申请第62/030,430号提交)中包含的序列表通过引用整体并入本文。文件“40-21_60779_0000_wo_st25.txt”(2103千字节，于2015年7月8日创建)中包含的序列表随此提交，并且通过引用整体并入本文。
4.领域
5.本文公开了用于控制无脊椎害虫侵染(特别是在植物中)的方法，用于此类方法的组合物和多核苷酸以及对无脊椎动物害虫具有提高的抗性的植物。更具体地，公开了多核苷酸及其用于在昆虫害虫中修饰(特别是通过rna干扰)基因表达的使用方法。目标害虫物种包括跳甲，诸如菜跳甲属某些种(phyllotreta spp.)和蚤跳甲属某些种(psylliodes spp.)。
6.背景
7.商业作物通常是无脊椎动物害虫(诸如昆虫)攻击的目标。用于控制植物中昆虫侵染的组合物通常呈化学杀虫剂的形式。然而，使用化学杀虫剂存在几个不利方面。例如，化学杀虫剂通常不是选择性的，并且旨在控制作物植物中的昆虫害虫的化学杀虫剂的施加也可对非目标昆虫和其它无脊椎动物发挥其作用。化学杀虫剂通常在环境中持续存在，并且可能较慢降解，因此潜在地积累在食物链中。此外，持久性化学杀虫剂的使用可导致目标昆虫物种的抗性的发展。因此，长期以来一直需要更加环境友好的方法来控制或根除植物上或植物中的昆虫侵染，例如为物种选择性、环境惰性、非持久性和可生物降解的，并且很好地适合于害虫抗性管理方案的方法。
8.rna干扰(rnai，rna介导的基因抑制)是一种显示在环境友好的害虫控制中使用的有前景的方法。在无脊椎动物中，首先在线虫中证明了基于rnai的基因抑制(fire等，(1998)nature,391:806-811；timmons&fire(1998)nature,395:854)。随后，在许多物种中报道了使用重组核酸技术的基于rnai的无脊椎动物基因抑制，所述物种包括来自各种昆虫和线虫分类群的农业或经济上重要的害虫，诸如：根结线虫(根结线虫属某些种(meloidogyne spp.))，参见huang等(2006)proc.natl.acad.sci.usa,103:14302-14306,doi:10.1073/pnas.0604698103)；棉铃虫(棉铃虫(helicoverpa armigera))，参见mao等(2007)nature biotechnol.,25:1307-1313,doi:10.1038/nbt1352；西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(diabrotica virgifera leconte))，参见baum等(2007)nature biotechnol.,25:1322-1326,doi:10.1038/nbt1359；甜菜孢囊线虫(甜菜孢囊线虫(heterodera schachtii))，参见sindhu等(2008)j.exp.botany,60:315-324,doi:10.1093/jxb/ern289；蚊子(埃及伊蚊(aedes aegypti))，参见pridgeon等(2008)j.med.entomol.,45:414-420,
doi:full/10.1603/0022-2585％282008％2945％5b414％3ataadrk％5d2.0.co％3b2；果萧(黑腹果萧(drosophila melanogaster))、粉甲虫(赤拟谷盗(tribolium castaneum))、豌豆蚜虫(豌豆蚜(acyrthosiphon pisum))和烟草天蛾(烟草天蛾(manduca sexta))，参见whyard等(2009)insect biochem.mol.biol，39：824-832，doi：10.1016/j.ibmb.2009.09.00；钻背蛾(小菜蛾(plutella xylostella))，参见gong等(2011)pest manag.sci.,67:514-520,doi:10.1002/ps.2086；绿桃蚜(烟蚜(myzus persicae))，参见pitino等(2011)plos one,6:e25709,doi:10.1371/journal.pone.0025709；褐飞虱(褐稻虱(nilaparvata lugens))，参见li等(2011)pest manag.sci.,67:852-859,doi:10.1002/ps.2124；和粉虱(烟粉虱(bemisia tabaci))，参见upadhyay等人(2011)j.biosci.,36:153-161,doi:10.1007/s12038-011-9009-1。
9.概述
10.本实施方案涉及昆虫物种，特别是经济上或农业上重要的害虫的跳甲物种的控制。本文公开的组合物和方法包括重组多核苷酸分子，诸如用于制备抗昆虫物种侵染的转基因植物的重组dna构建体和用于控制或预防该昆虫物种侵染的多核苷酸试剂，诸如rna“触发剂”。本文所述的几个实施方案涉及被局部施加于昆虫物种或待被保护以免受昆虫物种侵染的植物、植物部分或种子的含多核苷酸的组合物(例如，含有用于抑制靶基因的dsrna触发剂的组合物)。其它实施方案涉及用于选择更可能是rnai介导的昆虫物种的控制的有效靶的优选昆虫靶基因的方法。
11.几个实施方案涉及用于控制植物的昆虫侵染的方法，其包括将所述昆虫与包含至少一个具有18个或更多个连续核苷酸的区段的dsrna接触，所述区段具有与所述昆虫的靶基因的片段具有约95％至约100％互补性的的序列。在一些实施方案中，dsrna包含至少一个具有与昆虫的靶基因的片段具有100％互补性的序列的21个连续核苷酸的区段。在一些实施方案中，所述靶基因选自act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi(外被体亚单位)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述靶基因具有选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列。在一些实施方案中，所述dsrna包含rna链，其具有与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一些实施方案中，所述dsrna包含rna链，其具有选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列。在各种实施方案中，昆虫的接触是通过经口递送或通过非经口接触，例如通过角质层的吸收，或通过经口与非经口递送的组合。在一些实施方案中，所述dsrna触发剂抑制昆虫中的靶基因并阻碍昆虫的生长、发育或繁殖，或杀死昆虫。
12.几个实施方案涉及在昆虫中引起死亡或生长迟缓的方法，包括在昆虫的饮食中提供至少一种包含至少一个沉默元件的多核苷酸，其中所述至少一个沉默元件与昆虫的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补，并且其中昆虫摄取多核苷酸导致昆虫死亡或生长迟缓。在一些实施方案中，所述靶基因选自由以下组成的组：act5c、精氨酸激酶、copi(外被
体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi亚基)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)，40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述靶基因序列选自由seq id no：1-859组成的组。在一些实施方案中，所述沉默元件包含rna链，其具有与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一些实施方案中，所述沉默元件包含具有选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列的rna链。在一些实施方案中，在昆虫的饮食中以含有多核苷酸的植物或细菌细胞的形式或作为合成多核苷酸分子或作为发酵产物(例如，在细菌中产生的dsrna的发夹形式)提供所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸是重组rna分子。在一些实施方案中，所述多核苷酸是双链rna分子。
13.几个实施方案涉及包含杀虫有效量的多核苷酸的杀虫组合物，其中所述多核苷酸包含与侵染植物的昆虫的靶基因的相应部分具有约95％至约100％互补性的18个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含具有与靶基因的相应部分100％互补的序列的21个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述靶基因选自由以下组成的组：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi亚基)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列或其片段具有约95％至约100％互补性的18个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含具有与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列或其片段具有100％互补性的序列的21个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸是重组rna。在一些实施方案中，所述多核苷酸是分子是dsrna。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少一个区段(例如，rna链或rna链的区段)，其具有与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少一个区段(例如，rna链或rna链的区段)，其具有选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段。在一些实施方案中，杀虫组合物还包含以下试剂的一种或多种：载体试剂、表面活性剂、有机硅氧烷、阳离子脂质、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂，杀真菌剂、安全剂、昆虫引诱剂和昆虫生长调节剂。杀虫组合物的实施方案包括非多核苷酸杀虫剂，例如，细菌产生的杀虫蛋白。
14.几个实施方案涉及提供具有提高的对昆虫的抗性的植物的方法，其包括在植物中表达重组dna构建体，其中所述重组dna构建体包含编码rna多核苷酸的dna，所述rna多核苷酸具有与昆虫的至少一个靶基因的片段基本上相同或基本上互补的序列，并且其中昆虫摄取所述多核苷酸导致昆虫死亡或生长迟缓。在一些实施方案中，所述靶基因选自act5c、精
氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi亚基)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述靶基因具有选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸是单链rna(ssrna)。在其它实施方案中，所述多核苷酸是双链rna(dsrna)，其可以包含单链部分，诸如茎-环结构中的环。在一些实施方案中，所述多核苷酸是具有与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列的rna(例如，rna链或rna链的区段)。在一些实施方案中，所述多核苷酸是具有选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段的rna(例如，rna链或rna链的区段)。
15.几个实施方案涉及重组dna构建体，其包含与编码rna转录物的dna可操作地连接的异源启动子，所述rna转录物包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。几个实施方案涉及种子的商业单位，诸如袋，其中所有或基本上所有种子包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与编码rna转录物的dna可操作地连接的异源启动子，所述rna转录物包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一些实施方案中，所述rna转录物是单链rna(ssrna)。在其它实施方案中，所述rna转录物是双链rna(dsrna)，其可以包含单链部分，诸如茎环结构中的环。在一些实施方案中，所述rna转录物包含具有与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列的rna(例如，rna链或rna链的区段)。在一些实施方案中，所述rna转录物包含具有选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段的rna(例如，rna链或rna链的区段)。
16.在相关方面，本文提供了人造组合物，其包含如本文所述的多核苷酸或触发剂，诸如用于向需要防止昆虫侵染的植物或物质局部施加的dsrna制剂；用于产生转基因植物细胞和转基因植物的重组构建体和载体；用于处理植物(包括植物种子或可繁殖部分诸如块茎)的制剂和包衣；植物种子或可繁殖部分诸如用本文所述的多核苷酸处理的或包含所述多核苷酸的块茎，以及从此类植物产生的商品和食品；种子或可繁殖部分(特别是具有可检测量的本文公开的多核苷酸的商品和食品)。几个实施方案涉及结合由选自由seq id no：1-859组成的组的序列或序列的片段编码的肽或蛋白质的多克隆或单克隆抗体。几个实施方案涉及结合由选自seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或序列的片段或其补体编码的肽或蛋白质的多克隆或单克隆抗体。此类抗体通过本领域普通技术人员已知的常规方法制备。
17.在以下详细描述和工作实施例中公开了其它方面和具体实施方案。
18.详述
19.本实施方案涉及用于控制昆虫害虫(特别是通常称为“跳甲”的鞘翅目昆虫的群，其中存在几个属)的方法和组合物。本文公开了鉴定为可用于设计用于预防或治疗跳甲侵
染(特别是商业上重要的植物的跳甲侵染)的多核苷酸试剂的靶基因。所述方法和组合物特别地可用于预防或治疗商业上重要的芸苔属(brassica)的种的跳甲侵染，所述芸苔属物种包括商业上用作油籽、食物或家畜饲料(例如，芥花籽、油菜籽、芜菁和田芥菜或芜菁油菜(turnip rape))。此类芸苔属物种包括甘蓝型油菜(b.napus)、芥菜(b.juncea)、埃塞俄比亚芥(b.carinata)、白菜型油菜(b.rapa)，甘蓝(b.oleracea)、褐芥(b.rupestris)、b.septiceps、黑芥(b.nigra)、塌棵菜(b.narinosa)、小松菜(b.perviridus)、地中海野芜菁(b.tournefortii)和地中海包心菜(b.fructiculosa)。还公开了用于抑制一种或多种跳甲靶基因的序列。几个实施方案涉及多核苷酸试剂(例如呈抑制跳甲靶基因的dsrna“触发剂”形式)。在一些实施方案中，提供了在控制昆虫害虫，特别是跳甲的方法中是有用的多核苷酸和重组dna分子以及构建体。几个实施方案涉及杀虫组合物，以及抗昆虫害虫侵染的转基因植物。几个实施方案涉及鉴定有效的多核苷酸试剂(例如用于防治昆虫害虫的双链rna分子)的方法，以及用于鉴定可能代表基本功能的靶基因，使这些基因成为用于昆虫害虫的rnai介导的沉默和控制的优选靶的方法。
20.几个实施方案涉及用于通过在跳甲中抑制选自由以下组成的组的一种或多种靶基因的表达来抑制或控制植物的跳甲侵染的方法和组合物：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi(外被体亚单位)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，抑制跳甲中的一种或多种靶基因的表达导致生长迟缓或死亡。
21.几个实施方案涉及多核苷酸分子，诸如dsrna，其包含一个或多个包含18个或更多个连续核苷酸(例如21个或更多个连续核苷酸)的区段，其与选自由以下组成的组的昆虫靶基因的片段具有95％至约100％(例如，约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)互补性：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi(外被体亚单位)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述多核苷酸(诸如dsrna)包含多个区段(每一个区段具有18个或更多个连续核苷酸)，其具有与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段具有约95％至约100％(例如，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约100％)互补性的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸(诸如dsrna)包含与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段具有100％互补性的21个连续核苷酸。例如，所述多核苷酸(诸如dsrna)包含对应于靶基因的不同区域的区段，或可包含多个拷贝的区段。在其它实施方案中，所述多核苷酸(例如dsrna)包含多个区段，每个区段具有18个或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与不同靶基因的片段具有约95％至约100％(例如约95％、约96％、约97％、约
98％、约99％或约100％)互补性的序列；这样，可以抑制多个靶基因或多种昆虫物种。
22.几个实施方案涉及dsrna分子(有时在本文中称为“触发剂”)，其抑制选自由以下组成的组的一种或多种靶基因的表达：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi(外被体亚单位)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。几个实施方案涉及具有大于典型的天然存在的调节性小rna(诸如内源产生的sirna和成熟mirna)的长度的长度的dsrna，例如，所述dsrna的长度为至少约30个连续碱基对。在一些实施方案中，所述dsrna具有约50至约500个碱基对的长度。在一些实施方案中，所述dsrna的长度为至少50个碱基对。在一些实施方案中，所述dsrna由两条分开的基本上互补的链(例如，其中每条链被分别提供，或其中每条链被编码在单独的dna分子上，或其中两条链被编码在dna的分开的区段上并被分别转录，或例如通过重组酶或核酸酶的作用分开)形成，其中至少一条rna链包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％(例如约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约100％)同一性或互补性的序列。在一些实施方案中，所述dsrna是平端的，例如两条分开的等长的rna链，其通过分子间杂交形成dsrna。在一些实施方案中，所述dsrna在一端或两端(末端)具有悬突，例如两条分开的不等长的rna链，其通过分子间杂交形成dsrna；所述悬突可以是单个核苷酸或2个、3个、4个、5个、6个或更多个核苷酸，并且可位于链的5'末端或3'末端。在一些实施方案中，所述dsrna包含至少一个茎-环，例如通过分子内杂交形成具有“发夹”二级结构的dsrna的单一rna分子。在一些实施方案中，所述dsrna由单个自杂交杂发夹转录本形成，其中发夹的一个“臂”包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％(例如约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约100％)同一性或互补性的序列。在实施方案中，形成发夹(或部分发夹)的自杂交转录物包含dsrna分子，其包含在有义序列与反义序列的dsrna形成互补“臂”之间的“间隔子”核苷酸或单链“环区”。在实施方案中，此类间隔子或环包含具有与相应于发夹的双链部分的靶基因无关(不互补或相同)的序列的核苷酸。间隔子或环的实例包括由seq id no：1719-1721编码的那些间隔子或环。在实施方案中，所述dsrna包含多个茎-环，在每个茎-环之间具有或没有间隔核子苷酸。在实施方案中，所述dsrna包含经修饰的茎环，诸如“稳定的反义”环或“稳定的有义”环；参见，例如，美国专利第7,855,323号和第9,006,414号，其通过引用整体并入本文。
23.dsrna可以化学合成(例如，通过体外转录，诸如使用t7聚合酶或其它聚合酶的转录)，或者可以通过在微生物中表达，通过在植物细胞中表达或通过微生物发酵产生。所述dsrna可以经化学修饰，例如，以改善稳定性，配制的容易性或功效。在一些实施方案中，所述dsrna分子提供于表达dsrna(诸如dsrna触发剂的发夹形式)的微生物或植物细胞中或在微生物发酵产物中。
24.用于设计和产生多种形式的dsrna的多种方法在本领域中是已知的，并且可用于本文公开的组合物和方法。参见，例如以下专利(其通过引用整体并入本文)：(1)属于
waterhouse等的美国专利第8,598,332号，其公开了重组dna构建体，所述构建体包含编码单一转录物中的有义rna和反义rna序列的dna，所述有义rna和反义rna序列通过有义与反义核苷酸序列之间的碱基配对形成具有双链rna茎的人工“发夹”rna结构；实施方案包括在有义和反义核苷酸序列之间具有间隔核苷酸的发夹；(2)属于rommens等的美国专利第8,158,414号，其公开了包含会聚定向的第一和第二启动子的重组dna构建体，所述构建体产生例如通过两个分开的rna转录物退火形成的rna双链体；和(3)属于huang等的美国专利第7,855,323号和第9,006,414号，其公开了重组dna构建体，其包含编码“稳定的反义”转录物的dna，所述转录物形成用于抑制一种或多种靶基因的反义定向的rna的环；重组dna构建体可被设计来类似地编码“稳定的有义”转录物，其形成用于抑制一种或多种靶基因的有义定向的rna的环。
25.包含多核苷酸(诸如本文所述的dsrna触发剂)的组合物的实施方案还包含一个或多个另外的组分或佐剂，例如载体试剂、包封剂、乳化剂、表面活性剂、有机硅氧烷、阳离子脂质、铺展剂、光保护剂、耐雨水剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀虫剂、非多核苷酸杀真菌剂、安全剂、诱饵、昆虫引诱剂、昆虫信息素和昆虫生长调节剂。在实施方案中，如果被跳甲摄入，这些另外的组分或佐剂是可食用的或可消化的。
26.在实施方案中，将本文公开的多核苷酸诸如dsrna触发剂与非核苷酸杀虫剂诸如小分子杀虫剂或蛋白质性质的杀虫剂同时或顺序地组合使用。非核苷酸杀虫剂的实例包括块茎素、植物凝集素、植物性蜕皮甾类和细菌杀虫蛋白(例如，来自以下细菌的杀虫蛋白：苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、致病杆菌属某种(xenorhabdus sp.)、发光杆菌属某种(photorhabdus sp.)、侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)(先前称为侧孢芽孢杆菌(bacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sphaericus)(先前称为球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus))、色杆菌属某种(chromobacterium sp.)、紫色色杆菌(chromobacterium subtsugae)、类芽孢杆菌属某种(paenibacillus sp.)、缓病类芽孢杆菌(paenibacillus lentimorbus)和金龟子类芽孢杆菌(paenibacillus popilliae))、产生杀虫蛋白的细菌和杀虫细菌物种。在实施方案中，包括用于跳甲控制的多核苷酸诸如本文所述的dsrna触发剂的组合物还可包含常规杀虫剂或与所述杀虫剂同时或顺序使用，所述常规杀虫剂是诸如螺甲螨、螺螨酯、螺虫乙酯、哒螨灵、吡螨胺、唑虫酰胺、霸螨灵、嘧虫胺、嘧螨醚、喹螨醚、鱼藤酮、腈吡螨酯、氟蚁腙、灭醌螨、嘧螨酯、磷化铝、磷化钙、磷化氢、磷化锌、氰化物、杀螨硫隆、三唑锡、三环锡、苯丁锡、快螨特、四氯杀螨砜、杀虫磺、杀虫环、杀虫双、氟啶虫酰胺、乙螨唑、四螨嗪、氟螨嗪、噻螨酮、定虫隆、双三氟虫脲、二氟苯隆、氟环脲、氟虫脲、氟铃脲、氯芬奴隆、双苯氟脲、诺福隆、氟苯脲、杀铃脲、噻嗪酮、环丙马秦、烯虫乙酯、烯虫炔酯、烯虫酯、苯氧威、百利普芬、吡嗪酮、氟虫吡喹、虫螨腈、溴螺腈、苏云金芽孢杆菌鲇泽变种(b.t.(苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)var.aizawai)、苏云金芽孢杆菌以色列变种(b.t.var.israelensis)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种(b.t.var.kurstaki)、苏云金芽孢杆菌球形变种(b.t.var.sphaericus)、苏云金芽孢杆菌粉甲变种(b.t.var.tenebrionensis)、苏云金芽孢杆菌作物蛋白(包括cry1ab、cry1ac、cry1fa、cry2ab、mcry3a、cry3ab、cry3bb、cry34/35ab1)、甲基溴化物和其它卤代烷、氯化苦、磺酰氟、异噻虫唑、灭螨猛、冰晶石、甲基新癸酰胺、苯螨特、噻螨胺、氟噻虫砜、印楝素、联苯肼酯、磺胺螨酯、杀螨醇、三氯杀虫酯、丁氟螨
酯、啶虫丙醚、球孢白僵菌(beauveria bassiana)gha、氟吡氰胺、乙基多杀菌素、多杀菌素、多杀菌素、甲胺基阿维菌素苯甲酸盐、雷皮菌素、米尔倍霉素、阿巴美丁、甲氧虫酰肼、环虫酰肼、氯虫酰肼、呋喃虫酰肼、阿米曲士、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫酰胺、α-硫丹、氯丹、硫丹、氟虫腈、乙酰虫腈、乙虫腈、吡嗪氟虫腈、吡啶氟虫腈、茚虫威(indoxacarb)和氰氟虫腙、氟丙菊酯、丙烯除虫菊、顺式-反式-丙烯除虫菊、反式-丙烯除虫菊、β-氟氯氰菊酯、β-氯氰菊酯、氟氯菊酯、生物丙烯菊酯、s-环戊烯基生物丙烯菊酯、生物苄呋菊酯、反式-丙烯除虫菊、β-氟氯氰菊酯、β-氯氰菊酯、联苯菊酯、生物烯丙菊酯、生物烯丙菊酯s-环戊烯基、生物苄呋菊酯、乙氰菊酯、氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、苯醚氰菊酯[(1r)-反式-异构体]、四氟甲醚菊酯、右旋烯炔菊酯[(ez)-(1r)-异构体])、杀灭阿菊酯、依芬普司、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰菊酯、氟氯苯菊酯、γ-氯氟氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、氯氟醚菊酯、甲氧苄氟菊酯、扑灭司林、苯氧司林[(1r)-反式-异构体]、炔丙菊酯、丙氟菊酯、普垂菊酯、灭虫菊、氟硅菊酯、τ-氟胺氰菊酯、七氟菊酯、胺菊酯、胺菊酯[(1r)-异构体]、四氟醚菊酯、θ-氯氰菊酯、四溴菊酯、四氟苯菊酯、δ-氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、溴氰菊酯、ddt和甲氧氯、疏双威、棉铃威、涕灭威、噁虫威、丙硫克百威、丁酮砜威、胺甲萘、虫螨威、丁硫克百威、乙硫苯威、仲丁威、伐虫脒、呋线威、异丙威、灭虫威、灭多虫、速灭威、杀线威、抗蚜威、甲基邻异丙氧基氨基甲酸苯酯、久效威、唑蚜威、混杀威、xmc、灭杀威、毒死蜱、马拉硫磷、高灭磷、甲基吡噁磷、乙基谷硫磷、甲基谷硫磷、硫线磷、氯氧磷、毒虫畏、氯甲磷、毒死蜱、库马磷、杀螟睛、内吸磷-s-甲基、敌匹硫磷、敌敌畏/ddvp、百治磷、乐果、甲基毒虫畏、乙拌磷、epn、乙硫磷、丙线磷、氨磺磷、苯线磷、杀螟松、倍硫磷、地虫磷、噻唑磷、新烟磷(imicyafos)、甲基异柳磷、灭蚜磷、甲胺磷、杀扑磷、速灭磷、久效磷、三溴磷、氧乐果、砜吸磷、对硫磷、对硫磷甲酯、稻丰散、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、肟硫磷、乙基嘧啶磷、丙溴磷、丙虫磷、胺丙畏、丙硫磷、吡唑硫磷、哒嗪硫磷、喹硫磷、治螟磷、丁基嘧啶磷、替美磷、特丁磷、杀虫畏、甲基乙拌磷、三唑磷、三氯磷酸酯、蚜灭多、吡虫啉、噻虫嗪、啶虫脒、噻虫胺、呋虫胺、烯啶虫胺、硝虫噻嗪(nithiozine)、烟碱、噻虫啉、氯虫酰胺和氰虫酰胺。在实施方案中，包含用于芸苔属物种(包括芥花籽)的跳甲控制的多核苷酸的组合物还包含叶面喷雾剂(包含选自由以下组成的组的一种或多种杀虫剂：溴氰菊酯、氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、扑灭司林、胺甲萘、虫螨威和马拉硫磷)或种子处理剂(包含选自由以下组成的组的一种或多种杀虫剂：噻虫嗪、吡虫啉和噻虫胺)或与叶面喷雾剂或种子处理剂同时或顺序使用。
[0027]
在实施方案中，包含用于跳甲控制的多核苷酸诸如本文所述的dsrna触发剂的组合物还可包含以下常规杀真菌剂或可与所述杀真菌剂同时或顺序地使用，所述常规杀真菌剂是诸如磺嘧菌灵、甲菌定、乙菌定、嘧菌环胺、嘧霉胺、嘧菌胺、拌种咯、咯菌腈；苯基酰胺、苯霜灵、呋霜灵、甲霜灵、r-甲霜灵、甲呋酰胺、恶霜灵、苯菌灵、多菌灵、咪菌威、麦穗宁、噻苯哒唑、乙菌利、菌核利、异菌脲、甲菌利、腐霉利、烯菌酮、萎锈灵、甲呋酰胺、氟酸胺、灭锈胺、氧化萎镑灵、噻氟菌胺、双辛胍胺、多果定、双胍辛胺、腈嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌胺或三氟敏、福美铁、代森锰锌、代森锰、代森联、丙森锋、福美双、代森锌、福美辞、敌菌丹、克菌丹、抑菌灵、氟氯菌核利、灭菌丹、对甲抑菌灵、氢氧化铜、氧氯化铜、硫酸铜、氧化亚铜、代森锰铜、喹啉铜、敌螨普、酞菌酯、稻瘟光、异稻瘟净、稻瘟灵、氯瘟磷、定菌磷、甲基托氯磷、阿拉酸式苯-s-甲基、超敏蛋白(harpin)、敌菌灵、灭瘟素s、灭螨猛、氯苯甲醚、百菌清、霜脲氰、dichione、哒菌清、氯硝胺、乙霉威、烯酰吗啉、二噻农、土菌灵、噁唑菌酮、咪唑菌酮、三苯
锡、胺苯吡菌酮、嘧菌腙、氟啶胺、磺菌胺、三乙膦酸铝、噁霉灵、春雷霉素、磺菌威、戊菌隆、四氯苯酞、多氧霉素、烯丙苯噻唑、霜霉威、咯喹酮、苯氧喹啉、五氯硝苯、硫黄、咪唑嗪、三环唑、有效霉素、阿扎康唑、联苯三唑醇、丙环唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、环丙唑醇、氟环唑、氟喹唑、氟硅唑、粉唑醇、己唑醇、烯菌灵、亚胺唑、种菌唑、戊唑醇、氟醚唑、腈苯唑、叶菌唑、腈菌唑、稻瘟酯、配那唑、糠菌唑、消斑肟、丙氯灵、三唑酮、三唑醇、氟菌唑、灭菌唑、嗪氨灵、嘧啶醇、乐必耕或氟苯嘧啶醇、十二环吗啉、苯锈啶、丁苯吗啉、葚孢菌素、十三吗啉和环酰菌胺。在实施方案中，包含用于在芸苔属物种(包括芥花籽)中控制跳甲的多核苷酸的组合物还包含叶面喷雾剂(包含选自由以下组成的组的一种或多种杀真菌剂：腈嘧菌酯、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)菌株qst2808、啶酰菌胺、氟唑菌酰胺、唑菌胺酯、叶菌唑、丙硫菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯和甲基硫菌灵)或种子处理剂(包含选自由以下组成的组的一种或多种杀真菌剂：腈嘧菌酯、甲霜灵、三氟敏、唑菌胺酯、环丙吡菌胺、戊苯吡菌胺、咯菌腈和精甲霜灵)或与叶面喷雾剂或种子处理剂同时或顺序使用。
[0028]
在实施方案中，包含用于跳甲控制的多核苷酸诸如本文所述的dsrna触发剂的组合物还可包含常规除草剂诸如草甘膦、植物生长激素样除草剂诸如麦草畏、草丁膦、草铵膦、2,2-二氯丙酸(茅草枯)、乙酰乳酸合酶抑制剂诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基苯甲酸酯和苯酞、溴苯腈、环己二酮(稀禾定)和芳氧基苯氧基丙酸酯(氟吡甲禾灵)、磺酰胺除草剂、三嗪除草剂、5-甲基色氨酸、氨基乙基半胱氨酸、哒嗪酮除草剂诸如达草灭、环丙基异噁唑除草剂诸如异噁唑酮、原卟啉原氧化酶抑制剂、含有芳氧基链烷酸酯(aryloxyalkanoate)部分的除草剂、苯氧基生长素诸如2,4-d和2,4-滴丙酸、吡啶氧基生长素(pyridyloxy auxins)诸如氟草烟和绿草定、芳氧基苯氧基丙酸酯(aopp)乙酰基辅酶a羧肽酶(acc酶)抑制剂诸如吡氟氯禾灵、喹禾灵和禾草灵(diclofop)，和5-取代的苯氧乙酸酯原卟啉原氧化酶ix抑制剂诸如吡草醚(pyraflufen)和氟烯草酸。在实施方案中，包含用于在芸苔属物种(包括芥花籽)中的跳甲控制的多核苷酸的组合物还包含一种或多种出苗后除草剂或与所述除草剂同时或顺序使用，所述出苗后除草剂选自由以下组成的组：除草喹啉、稀禾定、烯草酮和二氯吡啶酸。在实施方案中，包含用于在抗除草剂芸苔属物种(包括抗除草剂芥花籽)中进行跳甲控制的多核苷酸的组合物还包含选自由咪草啶酸、草甘膦和草铵膦组成的组的一种或多种除草剂或与所述除草剂同时或顺序使用。
[0029]
公开的组合物和方法可用于抑制或控制植物诸如芸苔属物种的跳甲侵染。在实施方案中，所述组合物和方法用于处理生长中的植物，诸如一片芸苔属植物。实施方案包括在以固体、液体、粉末、混悬剂、乳剂、喷雾剂、包封剂、微珠、载体颗粒、膜、基质、土壤浸液或种子处理组合物形式存在的组合物中包含本文公开的多核苷酸的组合物。在实施方案中，将此类组合物施加于需要保护以防跳甲侵染或治疗跳甲侵染的植物的表面，或直接施加于跳甲，或以可摄取的形式提供给跳甲。在实施方案中，将包含本文公开的多核苷酸的组合物直接施加于未发芽的种子(诸如未发芽的芸苔属物种种子)，提供从经处理的种子萌发的植物增加了对跳甲侵染的抗性；种子处理方法的实例公开于美国专利申请14/143,836，其通过引用整体并入本文。一个实施方案包括通过将种子与本文公开的多核苷酸(诸如dsrna触发剂)直接接触，然后萌发成表现出增加的对跳甲侵染的抗性的芸苔属植物进行处理的芸苔属种子。
[0030]
除非另有定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通
常理解的相同的含义。术语“包含”或“包括”被理解为意指“包括但不限于”。通常，所用的命名法和下述的制造或实验室程序是本领域公知的和常用的。常规方法用于这些程序，诸如本领域和各种一般参考文献中提供的那些方法。当术语以单数提供时，发明人还考虑由该术语的复数描述的方面。当在通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异时，本技术中使用的术语应具有给出的定义。所使用的其它技术术语具有它们在使用它们的本领域中的普通含义，如由各种专门技术词典所示例的，例如“the americanscience dictionary”(the american heritage dictionaries的编辑，2011，houghton mifflin harcourt，boston和new york)，“mcgraw-hill dictionary of scientific and technical terms”(第6版，2002，mcgraw-hill，new york)或“oxford dictionary of biology”(第6版，2008，oxford university press，oxford和new york)。发明人无意限于作用机制或模式。其提及仅用于说明目的。
[0031]
除非另有说明，当从左向右阅读时，本说明书的文本中的核酸序列以5'至3'方向给出。本领域技术人员将意识到，给定的dna序列应被理解为定义相应的rna序列，其与dna序列相同，除了用尿嘧啶(u)核苷酸替换dna的胸腺嘧啶(t)核苷酸。因此，提供特定的dna序列应被理解为定义确切的rna等同物。给定的第一多核苷酸序列(无论是dna还是rna)进一步定义了其精确补体(其可以是dna或rna)的序列，即通过形成沃尔森-克里克碱基对与第一多核苷酸完全杂交的第二多核苷酸。与靶基因或靶基因的片段“基本上相同”或“基本上互补”是指多核苷酸链(或双链多核苷酸的至少一条链)被设计来与靶基因或靶基因的片段或与靶基因靶基因的片段的转录物杂交(通常在生理条件，诸如在活的植物或动物细胞中发现的那些条件下)；本领域技术人员将理解，此类杂交不一定需要100％的序列同一性或互补性。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列“可操作地”联接或“连接”。例如，如果启动子提供dna的转录或表达，则所述启动子序列与dna“可操作地连接”。通常，可操作连接的dna序列是连续的。
[0032]
术语“多核苷酸”通常是指含有多个核苷酸的dna或rna分子，通常是指“寡核苷酸”(长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子)和26个或更多个核苷酸的更长的多核苷酸。多核苷酸还包括含有多个核苷酸(包括本领域通常实践的非经典核苷酸或化学修饰的核苷酸)的分子；参见，例如，技术手册“rna interference(rnai)and dsirnas”，2011(integrated dna technologies coralville，ia)中公开的化学修饰。一般地，本文所述的多核苷酸，无论是dna还是rna或两者，以及无论是单链的还是双链的，包含至少一个18个或更多个连续核苷酸(或者，在双链多核苷酸的情况下，至少18个连续碱基对)的区段，其与靶基因的dna或靶基因的rna转录物的等同大小的片段基本上相同或互补。在本公开中，“至少18个连续”是指“约18个至约10,000个，包括其间的每个整数点”。因此，实施方案包括包含具有18-25个核苷酸的长度的寡核苷酸(18-聚体、19-聚体、20-聚体、21-聚体、22-聚体、23-聚体、24-聚体或25-聚体)或具有26个或更多个核苷酸的长度的中等长度多核苷酸(26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个或约300
个核苷酸的多核苷酸)，或具有大于约300个核苷酸的长度的长多核苷酸(例如，长度在约300与约400个核苷酸之间，约400与约500个核苷酸之间，约500与约600个核苷酸之间，约600至约700个核苷酸之间，约700至约800个核苷酸之间，约800至约900个核苷酸之间，约900至约1000个核苷酸之间，约300至约500个核苷酸之间，约300至约600个核苷酸之间，约300至约700个核苷酸之间，约300至约800个核苷酸之间，约300至约900个核苷酸之间，或长度约1000个核苷酸，或长度甚至大于约1000个核苷酸，例如直至靶基因(包括靶基因的编码或非编码部分或编码和非编码部分)的整个长度的多核苷酸)。当多核苷酸是双链时，诸如在工作实施例中描述的dsrna触发剂，其长度可以类似地按照碱基对来描述。双链多核苷酸，诸如在工作实施例中描述的dsrna触发剂，还可根据一种或多种单链组分来进行描述。
[0033]
本文所述的多核苷酸可以是单链(ss)的或双链(ds)的。“双链”是指通常在生理相关条件下在足够互补的反平行核酸链之间发生以形成双链核酸结构的碱基配对。实施方案包括其中多核苷酸选自由以下组成的组：有义单链dna(ssdna)、有义单链rna(ssrna)、双链rna(dsrna)、双链dna(dsdna)、双链dna/rna杂交体、反义ssdna或反义ssrna；可以使用任何这些类型的多核苷酸的混合物。在一些实施方案中，所述多核苷酸是长度大于天然存在的调节性小rna(诸如内源产生的sirna和成熟mirna)的长度的双链rna。在一些实施方案中，所述多核苷酸是长度为至少约30个连续碱基对的双链rna。在一些实施方案中，所述多核苷酸是长度为约50至约500个碱基对的双链rna。在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含除标准核糖核苷酸外的组分，例如，一个实施方案是包含末端脱氧核糖核苷酸的rna。
[0034]
可在本文所述的各种方法和组合物中单独或组合地使用任何大小的有效多核苷酸。在一些实施方案中，使用单个多核苷酸触发剂来制备组合物(例如，用于局部施加的组合物或可用于制备转基因植物的重组dna构建体)。在其它实施方案中，使用不同多核苷酸触发剂的混合物或汇集物；在此类情况下，多核苷酸触发剂可针对单个靶基因或针对多个靶基因。
[0035]
在各种实施方案中，本文所述的多核苷酸包含天然存在的核苷酸，诸如存在于dna和rna中的那些核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合，例如主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸，或主要由脱氧核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含非经典核苷酸，诸如肌苷、硫尿苷或假尿苷。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含化学修饰的核苷酸。化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸的实例是本领域公知的；参见例如美国专利公开2011/0171287、美国专利公开2011/0171176、美国专利公开2011/0152353、美国专利公开2011/0152346和美国专利公开2011/0160082，其通过引用并入本文。示例性实例包括但不限于可以用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰部分或完全修饰的寡核苷酸或多核苷酸的天然存在的磷酸二酯主链，经修饰的核苷碱基或经修饰的糖可用于寡核苷酸或多核苷酸合成，并且寡核苷酸或多核苷酸可以用萦光部分(例如，萦光素或罗丹明)或其它标记物(例如，生物素)标记。
[0036]
用于指多核苷酸(诸如本文所述的重组rna分子或重组dna构建体)的术语“重组体”意指所述多核苷酸不是天然存在的分子，即，多核苷酸的存在需要人干预。使用重组核酸技术或通过化学合成产生重组多核苷酸，并且所述多核苷酸可包含非天然存在的序列的
组合(例如，异源启动子与编码待表达rna的dna的组合，或包含非天然地彼此相邻存在的靶基因的连接区段的rna分子)。重组多核苷酸可以在细胞(诸如细菌或植物或动物细胞)中生物地产生，例如当用编码重组多核苷酸的载体(例如，编码发夹形式的dsrna的载体，在细菌中产生的)转染或转化该细胞时。重组多核苷酸可包括使用适当的算法在计算机中设计的核苷酸序列。
[0037]
本文公开的多核苷酸或触发剂通常被设计来抑制或沉默一个或多个基因(“靶基因”)。术语“基因”是指提供转录物的表达或编码转录物，或是可遗传核酸序列的核酸的任何部分。“基因”可包括但不限于启动子区、5'非翻译区、可包括内含子区、3'非翻译区或这些区的组合的转录编码区。在实施方案中，靶基因可包括编码或非编码序列或两者。在其它实施方案中，靶基因具有与信使rna相同或互补的序列，例如，在靶基因是cdna的实施方案中。
[0038]
如本文所用，术语“分离的”是指将分子与通常以其自然或天然状态与其结合的其它分子分离。因此，术语“分离的”可以指已经与通常以其自然或天然状态与其结合的其它dna分子分离的dna分子。此类dna分子可以以重组状态(诸如重组dna分子)存在。因此，与通常不与它们结合的调节序列或编码序列融合(例如作为重组技术的结果)的dna分子被认为是分离的，即使当作为转基因整合至细胞的染色体中或与其它dna分子一起存在时亦如此。
[0039]“杀虫有效的”意指在诱导侵染植物的昆虫(例如，成虫或幼体跳甲)的生理或行为变化(诸如但不限于生长迟缓、死亡增加、繁殖能力下降或繁殖力降低、摄食行为或运动减少或停止，或变态阶段发育减少或停止)中是有效的。在一些实施方案中，将杀虫有效量的多核苷酸(诸如dsrna分子)施加于植物改善了植物对昆虫侵染的抗性。在一些实施方案中，将杀虫有效量的多核苷酸(诸如dsrna分子)施加于作物植物，与未用所述多核苷酸处理的作物相比，改善了该作物植物的产量(例如，增加的生物量、增加的种子或果实产量或增加的油、淀粉、糖或蛋白质含量)。尽管对可用于本文提供的方法和组合物的本文所述的多核苷酸的浓度和剂量没有上限，但通常将就功效和经济寻求较低的有效浓度和剂量。多核苷酸的有效量的非限制性实施方案包括约10纳克/毫升至约100微克/毫升的喷雾在植物上的呈液体形式的多核苷酸，或约10毫克/英亩至约100克/英亩施加至植物田间的多核苷酸，或约0.001至约0.1微克/毫升的用于饲喂昆虫的人工饮食中的多核苷酸。当向植物局部施加本文所述的组合物时，可考虑施加于植物叶或其它植物部分表面(诸如花瓣、茎、块茎、果实、花药、花粉、叶、根或种子)的喷雾或处理的体积来调整浓度。在一个实施方案中，使用本文所述的25聚体多核苷酸的草本植物的有用处理为每株植物约1纳摩尔(nmol)多核苷酸，例如每株植物约0.05至1nmol多核苷酸。草本植物的其它实施方案包括每株植物约0.05至约100nmol，或约0.1至约20nmol，或约1nmol至约10nmol多核苷酸的有用范围。在某些实施方案中，施加约40至约50nmol的如本文所述的单链多核苷酸。在某些实施方案中，施加约0.5nmol至约2nmol的如本文所述的dsrna。在某些实施方案中，施加含有约0.5至约2.0毫克/毫升或约0.14毫克/毫升的如本文所述的dsrna(或单链21聚体)的组合物。在某些实施方案中，施加约0.5至约1.5毫克/毫升的约50个至约200个或更多个核苷酸的如本文所述的dsrna多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，向植物施加约1nmol至约5nmol的如本文所述的dsrna。在某些实施方案中，向植物局部施加的多核苷酸组合物含有如本文所述的至少一种多核苷酸，其浓度为约0.01至约10毫克/毫升，或约0.05至约2毫克/毫升，或约0.1至约2
毫克/毫升。非常大的植物、树或藤本植物可需要相应较大量的多核苷酸。当使用可被加工成多个寡核苷酸(例如，由本文公开的单个重组dna分子编码的多个触发剂)的长dsrna分子时，可使用较低的浓度。有效多核苷酸处理方案的非限制性实例包括每株植物约0.1至约1nmol的多核苷酸分子，或每株植物约1nmol至约10nmol的多核苷酸分子，或每株植物约10nmol至约100nmol的多核苷酸分子的处理。
[0040]
引起昆虫死亡或控制昆虫侵染的方法
[0041]
几个实施方案涉及引起昆虫的死亡或生长迟缓的方法，包括在昆虫的饮食中提供至少一种重组rna，所述重组rna包含至少一个与昆虫的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自由seq id no：1-859组成的组，并且其中所述昆虫摄取重组rna导致昆虫死亡或生长迟缓。这些方法可用于控制植物的昆虫侵染，例如用于预防或治疗作物植物(特别是商业上重要的芸苔属物种)的跳甲侵染。
[0042]
在实施方案中，所述至少一个沉默元件包含rna链，所述rna链包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在实施方案中，所述至少一个沉默元件包含rna链，所述rna链包含至少一个具有与昆虫的靶基因的片段具有100％互补性的序列的18个或更多个连续核苷酸的区段，其中所述靶基因具有选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列。在实施方案中，所述至少一个沉默元件包含rna链，所述rna链包含至少一个选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的rna序列或其片段的18个或更多个连续核苷酸的区段。在实施方案中，所述至少一个沉默元件包含rna链，所述rna链包含选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段。在实施方案中，所述至少一个沉默元件包含dsrna，所述dsrna包含至少一条rna链，所述rna链包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。
[0043]
在实施方案中，所述重组rna提供于表达所述重组rna的微生物或植物细胞中，或提供于微生物发酵产物中，或经化学合成。在实施方案中，所述至少一个沉默元件包含dsrna。在实施方案中，所述dsrna是平端的，或在至少一个末端具有悬突，或包含至少一个茎环。所述dsrna通过常用的方便技术提供。在实施方案中，化学合成所述dsrna，通过在微生物中表达产生所述dsrna，通过在植物细胞中表达产生所述dsrna或通过微生物发酵产生所述dsrna。在实施方案中，所述dsrna由天然存在的核糖核苷酸制成；在其它实施方案中，化学修饰所述dsrna。
[0044]
在实施方案中，所述方法用于引起为商业上重要的作物植物的害虫(诸如芸苔属物种的昆虫害虫)的昆虫的死亡或生长迟缓。在实施中，所述昆虫是跳甲。在实施方案中，所述昆虫是选自由以下组成的组的属的物种：跳甲属(altica)、anthobiodes、侧刺跳甲属(aphthona)、aphthonaltica、刀刺跳甲属(aphthonoides)、apteopeda、瓢跳甲属(argopistes)、凹唇跳甲属(argopus)、arrhenocoela、圆肩跳甲属(batophila)、blepharida、凹胫跳甲属(chaetocnema)、啮跳甲属(clitea)、沟胸跳甲属(crepidodera)、derocrepis、二叶跳甲属(dibolia)、disonycha、毛跳甲属(epitrix)、hermipyxis、hermaeophaga、丝跳甲属(hespera)、hippuriphila、horaia、瘤爪跳甲属(hyphasis)、方胸跳甲属(lipromima)、长跳甲属(liprus)、长跗跳甲属(longitarsus)、寡毛跳甲属(luperomorpha)、lythraria、玛碧跳甲属(manobia)、曼跳甲属(mantura)、meishania、卵形
跳甲属(minota)、mniophila、neicrepidodera、九节跳甲属(nonarthra)、novofoudrasia、ochrosis、oedionychis、oglobinia、峨眉球跳甲属(omeisphaera)、直缘跳甲属(ophrida)、orestia、paragopus、曲胫跳甲属(pentamesa)、肿爪跳甲属(philopona)、粗角跳甲属(phygasia)、菜跳甲属(phyllotreta)、podagrica、潜跳甲属(podagricomela)、凹缘跳甲属(podontia)、双行跳甲属(pseudodera)、蚤跳甲属(psylliodes)、细角跳甲属(sangariola)、小跳甲属(sinaltica)、球跳甲属(sphaeroderma)、systena、长瘤跳甲属(trachyaphthona)、沟顶跳甲属(xuthea)和zipangia。在实施方案中，所述昆虫是选自由以下组成的组的种：栖肤跳甲(赤杨跳甲(alder flea beetle))、加拿大跳甲(altica canadensis)(草原跳甲(prairie flea beetle))、葡萄跳甲(altica chalybaea)(葡萄跳甲(grape flea beetle))、绿色跳甲(altica prasina)(杨桃跳甲(poplar flea beetle))、蔷薇跳甲(altica rosae)(玫瑰跳甲(rose flea beetle))、越橘跳甲(altica sylvia)((蓝莓跳甲(blueberry flea beetle))、榆跳甲(altica ulmi)(榆跳甲(elm flea beetle))、蚤凹胫跳甲(chaetocnema pulicaria)(玉米跳甲(corn flea beele))、chaetocnema conofinis(甘薯跳甲(sweet potato flea beetle))、黄瓜毛跳甲(epitrix cucumeris)(马铃薯跳甲(potato flea beetle))、systena blanda(浅条纹跳甲(palestripped fleabeetle))和systena frontalis(红头跳甲(redheaded flea beetle))。在实施方案中，所述昆虫是选自由以下组成的组的种：辣根莱跳甲(phyllotreta armoraciae)(山葵跳甲(horseradish flea beetle))、十字花菜跳甲(phyllotreta cruciferae)(芥花籽跳甲(canola flea beetle))、微小菜跳甲(phyllotreta pusilla)(西方黑跳甲(western black flea beetle))、绿胸菜跳甲(phyllotreta nemorum)(条纹芜菁跳甲(striped turnip flea beetle))、黑菜跳甲(phyllotreta atra)(芜菁跳甲(turnip flea beetle))、罗布斯菜跳甲(phyllotreta robusta)(菜园跳甲(garden flea beetle))、黄曲条菜跳甲(phyllotreta striolata)(条纹跳甲(striped flea beetle))、波条菜跳甲(phyllotreta undulate)、油菜蚤跳甲(psylliodes chrysocephala)和忽布蚤跳甲(psylliodes punctulata)(蛇麻跳甲(hop flea beetle))。
[0045]
所述方法的实施方案包括其中重组rna被设计来以属或种特异性方式沉默靶基因的方法，例如，其中(a)昆虫是菜跳甲属物种，并且所述靶基因具有选自由seq id no：1-551组成的组的dna序列；(b)所述昆虫是黑菜跳甲(芜菁跳甲)，并且所述靶基因具有选自由seq id no：1-296组成的组的dna序列；(c)所述昆虫是十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)，并且所述靶基因具有选自由seq id no：297-532组成的组的dna序列；(d)昆虫是黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)，并且所述靶基因具有选自由seq id no：533-551组成的组的dna序列；(e)所述昆虫是蚤跳甲属物种，并且所述靶基因具有选自由seq id no：552-859组成的组的dna序列；或(f)所述昆虫是油菜蚤跳甲，并且所述靶基因具有选自由seq id no：552-859组成的组的dna序列。所述方法的实施方案还包括其中(a)所述昆虫是菜跳甲属物种，并且所述沉默元件包含rna链，其含有选自由seq id no：860-1410组成的组的序列或其片段；(b)所述昆虫是黑菜跳甲(芜菁跳甲)，并且所述沉默元件包含rna链，其含有选自由seq id no：860-1155组成的组的序列或其片段；(c)所述昆虫是十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)，所述沉默元件包含rna链，其含有含选自由seq id no：1156-1391组成的组的序列或其片段；(d)所述昆虫是黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)，并且所述沉默元件包含rna链，其含有选自由seq id no：1392-1410组成
的组的序列或其片段；(e)所述昆虫是蚤跳甲属物种，并且所述沉默元件包含rna链，其含有选自由seq id no：1411-1718组成的组的序列或片段；或(f)所述昆虫是油菜蚤跳甲，并且所述沉默元件包含rna链，其含有选自由seq id no：1411-1718的序列或其片段链。
[0046]
所述方法的实施方案包括其中在包含所述至少一种重组rna的组合物中提供至少一种重组rna的那些方法，其中将所述组合物施加于昆虫的表面或需要保护以免受昆虫侵染的种子或植物的表面。此类组合物的实施方案包括其中组合物包括固体、液体、粉末、混悬剂、乳剂、喷雾剂、包封剂、微珠、载体颗粒、膜、基质、土壤浸液或种子处理剂的那些实施方案。在许多实施方案中，将所述组合物配制成被昆虫摄取的形式。在实施方案中，所述组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种组分：载体试剂、表面活性剂、有机硅氧烷、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、杀真菌剂、安全剂、肥料、微量营养素、昆虫引诱剂和昆虫生长调节剂。在实施方案中，所述组合物还包含至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌(bacillus laterosporous)杀虫蛋白、球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus)杀虫蛋白、产生杀虫蛋白的细菌、杀虫细菌物种、球形赖氨酸芽孢杆菌(球形芽孢杆菌)、侧孢短芽孢杆菌(侧孢芽孢杆菌)、色杆菌属物种、紫色色杆菌、类芽孢杆菌属物种、缓病类芽孢杆菌和金龟子类芽孢杆菌。
[0047]
几个实施方案涉及用于控制植物的昆虫侵染的方法，包括使所述植物和/或侵染植物的昆虫与双链rna(dsrna)接触，其中所述dsrna包含至少一个18个或更多个连续核苷酸的区段，其具有与昆虫的靶基因的片段具有约95％至约100％(例如，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或约100％)互补性的序列，所述靶基因选自由以下组成的组：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi(外被体亚单位)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述dsrna包含至少一个18个或更多个连续核苷酸的区段，所述区段具有与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段具有约95％至约100％互补性的序列。在一些实施方案中，所述dsrna包含至少一个21个连续核苷酸的区段，其具有与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段具有100％互补性的序列。在本说明书中，“控制”包括诱导昆虫(成虫或幼虫或若虫)中的生理或行为变化(诸如但不限于生长迟缓、死亡增加、繁殖能力下降、摄食行为或运动减少或停止，或变态阶段发育减少或停止)。在一些实施方案中，所述dsrna包含选自由seq id no：860-1155组成的组的序列或其片段或其补体。
[0048]
在各种实施方案中，所述昆虫是跳甲，例如，选自由以下属组成的组的属的物种：跳甲属、anthobiodes、侧刺跳甲属、aphthonaltica、刀刺跳甲属、apteopeda、瓢跳甲属、凹唇跳甲属、arrhenocoela、圆肩跳甲属、blepharida、凹胫跳甲属、啮跳甲属、沟胸跳甲属、derocrepis、二叶跳甲属、disonycha、毛跳甲属、hermipyxis、hermaeophaga、丝跳甲属、hippuriphila、horaia、瘤爪跳甲属、方胸跳甲属、长跳甲属、长跗跳甲属、寡毛跳甲属、
lythraria、玛碧跳甲属、曼跳甲属、meishania、卵形跳甲属、mniophila、neicrepidodera、九节跳甲属、novofoudrasia、ochrosis、oedionychis、oglobinia、峨眉球跳甲属、直缘跳甲属、orestia、paragopus、曲胫跳甲属、肿爪跳甲属、粗角跳甲属、菜跳甲属、podagrica、潜跳甲属、凹缘跳甲属、双行跳甲属、蚤跳甲属、细角跳甲属、小跳甲属、球跳甲属、systena、长瘤跳甲属、沟顶跳甲属和zipangia。在一些实施方案中，所述昆虫选自由以下组成的组：栖肤跳甲(赤杨跳甲)、加拿大跳甲(草原跳甲)、葡萄跳甲(葡萄跳甲)、绿色跳甲(杨桃跳甲)、蔷薇跳甲(玫瑰跳甲)、越橘跳甲(蓝莓跳甲)、榆跳甲(榆跳甲)、蚤凹胫跳甲(玉米跳甲)、chaetocnema conofinis(甘薯跳甲)、黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲)、systena blanda(浅条纹跳甲)和systena frontalis(红头跳甲)。在一些实施方案中，所述昆虫选自由以下组成的组：辣根莱跳甲(山葵跳甲)、十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)、微小菜跳甲(西方黑跳甲)、绿胸菜跳甲(条纹芜菁跳甲)、黑菜跳甲(芜菁跳甲)、罗布斯菜跳甲(菜园跳甲)、黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)、波条菜跳甲、油菜蚤跳甲和忽布蚤跳甲(蛇麻跳甲(蛇麻跳甲))。
[0049]
植物可以是受可被本文公开的多核苷酸控制的昆虫侵染的任何植物。特定目标植物包括商业上重要的植物，包括行载作物植物、蔬菜和水果，以及其它农业或装饰用植物。合适的植物的实例在标题“植物”下提供。所述方法对于控制观赏植物或作物植物的昆虫侵染尤其有用。所述方法的各种实施方案包括其中所述植物是十字花科中的植物的那些实施方案，所述植物包括选自由以下组成的组的芸苔属物种：甘蓝型油菜(b.napus)、芥菜(b.juncea)、埃塞俄比亚芥(b.carinata)、白菜型油菜(b.rapa)、甘蓝(b.oleracea)、褐芥、b.septiceps、黑芥(b.nigra)、塌棵菜(b.narinosa)、小松菜(b.perviridus)、地中海野芜菁(b.tournefortii)和地中海包心菜(b.fructiculosa)。在其它实施方案中，所述植物选自由以下组成的组：大豆(glycine max)、亚麻(linum usitatissimum)、玉米(zea mays)、红花(carthamus tinctorius)、向日葵(helianthus annuus)、烟草(nicotiana tabacum)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、巴西坚果(betholettia excelsa)、蓖麻(ricinus communis)、椰子(cocus nucifera)、芜荽(coriandrum sativum)、棉属某些种gossypium spp.)、花生(arachis hypogaea)、加州希蒙得木(simmondsia chinensis)、马铃薯(solanum tuberosum)、油棕(elaeis guineensis)、油橄榄(olea europaea)、水稻(oryza sativa)、笋瓜(cucurbita maxim)、大麦(hordeum vulgare)和小麦(triticum aestivum)。
[0050]
方法包括针对对于给定植物的特定跳甲害虫(例如，其中所述植物是马铃薯并且所述昆虫是黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲))开发的那些方法。在一些实施方案中，将特定靶基因鉴定为用于给定的昆虫物种的rnai介导的控制的靶。所述方法的各种实施方案包括其中(a)所述昆虫是黑菜跳甲(芜菁跳甲)并且所述靶基因具有选自由seq id no：1-296组成的组的dna序列；(b)所述昆虫是十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)，并且靶基因具有选自由seq id no：297-532组成的组的dna序列；(c)所述昆虫是黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)并且所述靶基因具有选自由seq id no：533-551组成的组的dna序列；或(d)所述昆虫是油菜蚤跳甲，并且所述靶基因具有选自由seq id no：552-859组成的组的dna序列的那些实施方案。
[0051]
在一些实施方案中，针对给定的昆虫物种中的特定靶基因开发特异性dsrna“触发剂”。所述方法的实施方案包括其中(a)所述昆虫是黑菜跳甲(芜菁跳甲)，并且所述dsrna包含选自由seq id no：860-1155组成的组的至少一个rna序列或其片段；(b)所述昆虫是蔬菜黄瓜毛跳甲(芥花籽跳甲)，并且所述dsrna包含至少一个选自由seq id no：1156-1391组成
的组的rna序列或其片段；(c)所述昆虫是黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)，并且所述dsrna包含至少一个选自由seq id no：1392-1410组成的组的rna序列或其片段；或(d)所述昆虫是油菜蚤跳甲，并且所述dsrna包含至少一个选自由seq id no：1411-1718组成的组的rna序列或其片段的那些实施方案。
[0052]
所述方法包括将昆虫，诸如跳甲与双链rna(dsrna)接触。实施方案包括通过至昆虫的经口递送，或至昆虫的非经口递送，或至昆虫经口和非经口递送至昆虫的组合的接触。实施方案包括在成体阶段、幼虫阶段或在卵阶段接触昆虫。在一些实施方案中，接触导致昆虫的死亡(mortality)(死亡(death))或生长迟缓(生长迟缓或变态阶段发育的减少或停止)，从而预防或治疗昆虫对植物的侵染。在一些实施方案中，接触导致昆虫(成年或幼虫或若虫)的生理或行为变化的诱导，所述生理或行为变化导致昆虫侵染或损害植物的能力降低，例如生殖能力下降，或摄食行为或运动的减少或停止。
[0053]
在所述方法的一些实施方案中，接触包括将包含dsrna的组合物施加于昆虫表面或被昆虫侵染的植物表面。所述组合物可包括固体、液体、粉末、混悬剂、乳剂、喷雾剂、包封剂、微珠、载体颗粒、膜、基质、土壤浸液或种子处理剂或以所述的形式存在。在一些实施方案中，接触包括在组合物中提供dsrna，所述组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种组分：载体试剂、表面活性剂、有机硅氧烷、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、杀真菌剂、安全剂、昆虫引诱剂和昆虫生长调节剂。在一些实施方案中，接触包括在组合物中提供dsrna，所述组合物还包含至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白、产生杀虫蛋白的细菌、杀虫细菌物种、球形赖氨酸芽孢杆菌(球形芽孢杆菌)、侧孢短芽孢杆菌(侧孢芽孢杆菌)、色杆菌属物种、紫色色杆菌、类芽孢杆菌属物种、缓病类芽孢杆菌和金龟子类芽孢杆菌。
[0054]
在所述方法的一些实施方案中，接触包括在由昆虫摄取的组合物中(诸如在施加于昆虫进食的植物上的液体、乳剂或粉末中)或以诱饵的形式提供dsrna。此类组合物还可包含选自由以下组成的组的一种或多种组分：载体试剂、表面活性剂、有机硅氧烷、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、杀真菌剂、安全剂、昆虫引诱剂和昆虫生长调节剂。此类组合物还可包含至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白、产生杀虫蛋白的细菌、杀虫细菌物种、球形赖氨酸芽孢杆菌(球形芽孢杆菌)、侧孢短芽孢杆菌(侧孢芽孢杆菌)、色杆菌属物种、紫色色杆菌、类芽孢杆菌属物种、缓病类芽孢杆菌和金龟子类芽孢杆菌。在实施方案中，所述dsrna与所述杀虫剂的组合提供了大于单独测试时的dsrna和杀虫剂组分的作用之和的昆虫控制水平。
[0055]
杀虫组合物
[0056]
几个实施方案涉及包含杀虫有效量的多核苷酸诸如dsrna分子的杀虫组合物，其中所述多核苷酸包含至少18个或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与选自由以下组成的组的昆虫靶基因的片段具有约95％至约100％(例如，约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)互补性的序列：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体
亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi亚基)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少18个或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段具有约95％至约100％互补性。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段具有100％互补性的21个连续核苷酸。在实施方案中，所述多核苷酸包含选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段。
[0057]
在杀虫组合物的各种实施方案中，所述昆虫是跳甲，例如选自由以下属组成的组的属的物种：跳甲属、anthobiodes、侧刺跳甲属、aphthonaltica、刀刺跳甲属、apteopeda、瓢跳甲属、凹唇跳甲属、arrhenocoela、圆肩跳甲属、blepharida、凹胫跳甲属、啮跳甲属、沟胸跳甲属、derocrepis、二叶跳甲属、disonycha、毛跳甲属、hermipyxis、hermaeophaga、丝跳甲属、hippuriphila、horaia、瘤爪跳甲属、方胸跳甲属、长跳甲属、长跗跳甲属、寡毛跳甲属、lythraria、玛碧跳甲属、曼跳甲属、meishania、卵形跳甲属、mniophila、neicrepidodera、九节跳甲属、novofoudrasia、ochrosis、oedionychis、oglobinia、峨眉球跳甲属、直缘跳甲属、orestia、paragopus、曲胫跳甲属、肿爪跳甲属、粗角跳甲属、菜跳甲属、podagrica、潜跳甲属、凹缘跳甲属、双行跳甲属、蚤跳甲属、细角跳甲属、小跳甲属、球跳甲属、systena、长瘤跳甲属、沟顶跳甲属和zipangia。在一些实施方案中，所述昆虫选自由以下组成的组：栖肤跳甲(赤杨跳甲)、加拿大跳甲(草原跳甲)、葡萄跳甲(葡萄跳甲)、绿色跳甲(杨桃跳甲)、蔷薇跳甲(玫瑰跳甲)、越橘跳甲(蓝莓跳甲)、榆跳甲(榆跳甲)、蚤凹胫跳甲(玉米跳甲)、chaetocnema conofinis(甘薯跳甲)、黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲)、systena blanda(浅条纹跳甲)和systena frontalis(红头跳甲)。在一些实施方案中，所述昆虫选自由以下组成的组：辣根莱跳甲(山葵跳甲)、十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)、微小菜跳甲(西方黑跳甲)、绿胸菜跳甲(条纹芜菁跳甲)、黑菜跳甲(芜菁跳甲)、罗布斯菜跳甲(菜园跳甲)、黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)、波条菜跳甲、油菜蚤跳甲和忽布蚤跳甲(蛇麻跳甲)。
[0058]
所述杀虫组合物可用于处理植物或植物附近的区域，以提供针对昆虫(特别跳甲)的保护或治疗。相关方面是用如本文所述的杀虫组合物处理的植物或经处理的植物的种子，其中所述植物表现出改善的对昆虫的抗性(例如，改善的对跳甲的抗性)。在一些实施方案中，当与未用杀虫组合物处理的植物相比时，表现出改善的对昆虫的抗性的植物的特征在于提高的产量。在一个实施方案中，通过施加杀虫有效量的多核苷酸(诸如dsrna分子)来提高芥花籽或油籽油菜植物中的产量(油籽生物量或油含量)，所述多核苷酸靶向一个或多个从十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)鉴定的基因；在具体实施方案中，所述靶基因具有选自由seq id no：297-532组成的组的dna序列。所述植物可以是受可被杀虫组合物控制的昆虫侵染的任何植物。特定目标植物包括商业上重要的植物，包括行栽作物植物、蔬菜和水果，以及其它农业或装饰用植物。合适的植物的实例在标题“植物”下提供。所述方法对于控制观赏植物或作物植物的昆虫侵染尤其有用。各种实施方案包括其中所述植物是十字花科中的植物的那些实施方案，所述植物包括选自由以下组成的组的芸苔属物种：甘蓝型油菜、芥
菜、埃塞俄比亚芥、白菜型油菜、甘蓝、褐芥、b.septiceps、黑芥、塌棵菜、小松菜、地中海野芜菁和地中海包心菜。在其它实施方案中，所述植物选自由以下组成的组：大豆、亚麻、玉米、红花、向日葵、烟草、拟南芥、巴西坚果、蓖麻、椰子、芜荽、棉属某些种、花生、加州希蒙得木、马铃薯、油棕、油橄榄、水稻、笋瓜、大麦和小麦。
[0059]
在一些实施方案中，开发针对对于给定植物的特定跳甲害虫(例如，其中所述植物是马铃薯植物并且所述昆虫是黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲))的杀虫组合物。在一些实施方案中，针对给定的昆虫物种中的特定靶基因开发所述杀虫组合物。所述杀虫组合物的具体实施方案包括其中(a)所述昆虫是黑菜跳甲(芜菁跳甲)并且所述靶基因具有选自由seq id no：1-296组成的组的dna序列；(b)所述昆虫是十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)，并且所述靶基因具有选自由seq id no：297-532组成的组的dna序列；(c)所述昆虫是黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)并且所述靶基因具有选自由seq id no：533-551组成的组的dna序列；或(d)所述昆虫是油菜蚤跳甲并且所述靶基因具有选自由seq id no：552-859组成的组的dna序列的那些实施方案。
[0060]
在一些实施方案中，在所述方法中使用的dsrna分子作为分离的dsrna分子(不是表达构建体的一部分，例如缺少另外的元件，诸如启动子或终止子序列)提供。此类dsrna分子可以是相对短的，诸如约18个至约300个或约50个至约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或约18个至约300个或约50个至约500个碱基对(对于双链多核苷酸)的单链或双链rna分子。在实施方案中，所述多核苷酸是dsrna，其包含包含选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段的区段。
[0061]
在一些实施方案中，所述杀虫组合物呈选自由以下组成的组的形式：固体、液体、粉末、混悬剂、乳剂、喷雾剂、包封剂、微珠、载体颗粒、膜、基质、土壤浸液、昆虫饮食或昆虫诱饵及种子处理剂。在一些实施方案中，以被昆虫摄取的形式(诸如在施加于昆虫进食的植物上的液体、乳剂或粉末中)或以诱饵的形式提供所述杀虫组合物。所述杀虫组合物还可包含选自由以下组成的组的一种或多种组分：载体试剂、表面活性剂、有机硅氧烷、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、杀真菌剂、安全剂、昆虫引诱剂和昆虫生长调节剂。所述杀虫组合物还可包含至少一种选自由以下组成的组的杀虫剂：块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白、产生杀虫蛋白的细菌、杀虫细菌物种、球形赖氨酸芽孢杆菌(球形芽孢杆菌)、侧孢短芽孢杆菌(侧孢芽孢杆菌)、色杆菌属物种、紫色色杆菌、类芽孢杆菌属物种、缓病类芽孢杆菌和金龟子类芽孢杆菌。在实施方案中，所述重组rna与所述杀虫剂的组合提供了大于单独测试时的所述重组rna和所述杀虫剂组分的作用之和的昆虫控制水平。
[0062]
组合物的实施方案任选地包括有效叶面覆盖所需的合适的粘着剂和润湿剂以及保护多核苷酸诸如dsrna免受uv损伤的uv保护剂。此类添加剂通常用于生物杀虫剂工业中，并且是本领域技术人员已知的。用于土壤施加的组合物可包括用作昆虫幼虫的诱饵的颗粒制剂。实施方案包括载体试剂、表面活性剂、有机硅氧烷、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、杀真菌剂、安全剂、昆虫引诱剂和昆虫生长调节剂。
[0063]
组合物的实施方式可包括一种“转移剂”(一种当与被局部施加于生物体的表面上的包含本文公开的多核苷酸的组合物组合时，使得所述多核苷酸进入该生物体的细胞的试
剂)。可将此类转移剂作为包含本文公开的多核苷酸的组合物的一部分掺入，或者可在施加包含本文所述多核苷酸的组合物之前，同时或之后施加其。在一些实施方案中，转移剂是改善昆虫对多核苷酸的摄取的试剂。在一些实施方案中，转移剂是调节植物组织例如种子、叶、茎、根、花或果实的表面的试剂，以使多核苷酸渗透入植物细胞中。在一些实施方案中，转移剂使得多核苷酸能够通过角质层蜡质屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障进入植物细胞中。
[0064]
合适的转移剂包括增加生物体外部的渗透性或增加生物体细胞对多核苷酸的渗透性的试剂。合适的转移剂包括化学试剂或物理试剂或其组合。用于调节或转移的化学试剂包括(a)表面活性剂，(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或水性混合物，(c)氧化剂，(d)酸，(e)碱，(f)油，(g)酶或其组合。在一些实施方案中，多核苷酸和转移剂的应用任选地包括温育步骤、中和步骤(例如，中和酸、碱或氧化剂或使酶失活)、漂洗步骤或其组合。合适的转移剂可呈乳剂、反相乳剂、脂质体或其它胶束样组合物的形式，或可以使多核苷酸组合物采取乳剂、反相乳剂、脂质体或其它胶束的形式样组合物的形式。转移剂的实施方案包括抗衡离子或已知与核酸分子缔合的其它分子，例如阳离子脂质、无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺诸如精胺、亚精胺或腐胺，以及其它阳离子。转移剂的实施方案包括有机溶剂诸如dmso、dmf、吡啶、n-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇或与水混溶或在非水系统(诸如用于合成反应)中溶解磷酸核苷酸的其它溶剂。转移剂的实施方案包括具有或不具有表面活性剂或乳化剂的天然衍生的或合成的油，例如，植物来源的油、作物油(诸如可公开地在herbicide.adjuvants.com上在线获得的9
th compendium of herbicide adjuvants中列出的那些作物油)、石蜡油、多元醇脂肪酸酯或具有用酰胺或多胺诸如聚乙烯亚胺或n-吡咯烷修饰的短链分子的油。
[0065]
转移剂的实施方案包括有机硅氧烷制剂。例如，合适的转移剂是有机硅氧烷制剂，其可作为silwet商标表面活性剂商购获得，其具有cas号27306-78-1和epa号：cal.reg.no.5905-50073-aa，并且目前可从momentive performance materials，albany，new york获得。在其中silwet牌表面活性剂有机硅氧烷制剂以植物叶或其它植物表面的喷雾处理剂(在施加包含本文公开的多核苷酸的组合物之前，同时或之后施加％的形式用作转移剂的实施方案中，在约0.015至约2重量％(wt％)的范围内的新制备的浓度(例如，约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)在制备叶或其它植物表面以用于将本文公开的多核苷酸从表面上的局部施加转移入植物细胞中是有效的。一个实施方案包括包含多核苷酸和转移剂的组合物，所述转移剂包含在约0.015至约2重量％(wt％)的范围内(例如，约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、
2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)的有机硅氧烷制剂诸如silwet l-77。一个实施方案包括包含多核苷酸和转移剂的组合物，所述转移剂包含在约0.3至约1重量％(wt％)或约0.5至约1重量％(wt％)的范围内的silwet牌表面活性剂。
[0066]
可用作用于在本文公开的组合物和方法中的转移剂的有机硅氧烷化合物包括但不限于包括以下的化合物：(a)三硅氧烷头基，其共价连接至(b)烷基接头，所述接头包括但不限于正-丙基接头，其共价连接至(c)聚乙二醇(polyglycol)链，其共价连接至(d)末端基团。此类有机硅化合物的三硅氧烷头基包括但不限于七甲基三硅氧烷。烷基接头可包括但不限于正-丙基接头。聚乙二醇链包括但不限于聚乙二醇或聚丙二醇。聚乙二醇链可包括提供约“7.5”的平均链长“n”的混合物。在某些实施方案中，平均链长“n”可在约5至约14之间变化。末端基团可包括但不限于烷基，诸如甲基。可用作用于本文公开的组合物和方法的转移剂的有机硅氧烷化合物包括但不限于三硅氧烷乙氧基化物表面活性剂或聚环氧烷修饰的七甲基三硅氧烷。用于本文公开的组合物和方法的转移剂的实例是化合物i：
[0067][0068]
(化合物i：聚环氧烷七甲基三硅氧烷，平均n＝7.5)。
[0069]
使用可用作用于本文公开的组合物和方法的转移剂的有机硅氧烷化合物，例如作为在约0.015至约2重量％(wt％)的范围内的新制备浓度(例如，约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)。
[0070]
转移剂的实施方案包括在包含本文公开的多核苷酸的组合物中提供的或与其一起使用的一种或多种盐，诸如氯化铵、四丁基溴化鏻和硫酸铵。在一些实施方案中，氯化铵、四丁基溴化鏻和/或硫酸铵以约0.5％至约5％(w/v)，或约1％至约3％(w/v)，或约2％(w/v)的浓度使用。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含浓度大于或等于300毫摩尔的铵盐。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含浓度为约0.015至约2重量％(wt％)的有机硅氧烷转移剂以及浓度为约80至约1200毫摩尔或约150毫摩尔至约600毫摩尔的硫酸铵。
[0071]
转移剂的实施方案包括磷酸盐。可用于包含多核苷酸的组合物的磷酸盐包括但不限于磷酸钙、磷酸镁、磷酸钾或磷酸钠。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含浓度为至少约5毫摩尔浓度，至少约10毫摩尔浓度或至少约20毫摩尔浓度的磷酸盐。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含在约1毫摩尔至约25毫摩尔范围内或在约5毫摩尔至约25毫摩尔范围内的磷酸盐。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含浓度为至少约5毫摩尔，至少约10毫摩尔或至少约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施方案中，包含多核苷
酸的组合物包含浓度为约5毫摩尔，约10毫摩尔或约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含在约1毫摩尔至约25毫摩尔范围内或在约5毫摩尔至约25毫摩尔范围内的磷酸钠盐。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含在约10毫摩尔至约160毫摩尔范围内或在约20毫摩尔至约40毫摩尔范围内的磷酸钠盐。在某些实施方案中，包含多核苷酸的组合物包含ph约6.8的磷酸钠缓冲液。
[0072]
转移剂的实施方案包括表面活性剂和/或其中包含的有效分子。表面活性剂和/或其中包含的有效分子包括但不限于脂肪酸(诸如牛脂或牛脂胺或磷脂)的钠盐或锂盐和有机硅氧烷表面活性剂。在某些实施方案中，用抗衡离子或已知与核酸分子缔合的其它分子配制包含多核苷酸的组合物。非限制性实例包括四烷基铵离子、三烷基铵离子、锍离子、锂离子和多胺诸如精胺、亚精胺或腐胺。在某些实施方案中，用非多核苷酸除草剂配制包含多核苷酸的组合物，所述非多核苷酸除草剂是例如草甘膦、生长素样苯甲酸除草剂，包括麦草畏、草灭平和tba、草铵膦、植物生长激素样除草剂，包括苯氧基羧酸除草剂、吡啶羧酸除草剂、喹啉羧酸除草剂、嘧啶羧酸除草剂和草除灵乙酯除草剂、磺酰脲、咪唑啉酮、溴苯腈、茅草枯(delapon)、环庚二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和4-羟基苯基-丙酮酸-双加氧酶抑制性除草剂。在某些实施方案中，用非多核苷酸杀虫剂配制包含多核苷酸的组合物，所述非多核苷酸杀虫剂是例如块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
[0073]
提供具有改善的昆虫抗性的植物的方法
[0074]
一些实施方案涉及提供具有改善的对昆虫的抗性的植物，包括在所述植物中表达重组dna构建体的方法，其中所述重组dna构建体包括编码rna的dna，所述rna具有与选自由以下组成的组的至少一个昆虫靶基因的片段基本上相同或基本上互补的序列：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi亚基)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述dna构建体包含编码rna的dna，所述rna包含与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段基本上相同或基本上互补的序列。几个实施方案涉及通过此类方法产生的植物。在一些实施方案中，所述dna构建体包含编码rna的dna，所述rna与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％(例如，约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)同一性或互补性。
[0075]
在一些实施方案中，所述重组dna构建体还包含与编码rna的dna可操作地连接的异源启动子，其中所述异源启动子在植物细胞中有功能。“异源的”是指在自然或天然存在的基因组中通常不是可操作地连接的核酸序列；“异源启动子”是指启动子不与编码rna的dna天然可操作地连接。在植物细胞中有功能的启动子包括在标题“启动子”下列出的那些启动子。
[0076]
在一些实施方案中，通过转基因表达或瞬时表达在植物中表达所述重组dna构建体。在一些实施方案中，所述方法还包括在植物中表达至少一种选自由以下组成的组的杀
虫剂：块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白、产生杀虫蛋白的细菌、杀虫细菌物种、球形赖氨酸芽孢杆菌(球形芽孢杆菌)、侧孢短芽孢杆菌(侧孢芽孢杆菌)、色杆菌属物种、紫色色杆菌、类芽孢杆菌属物种、缓病类芽孢杆菌和金龟子类芽孢杆菌。所述杀虫剂可以从包含编码rna的dna的相同重组dna构建体或从不同的重组dna构建体表达。
[0077]
相关方面是具有改善的对昆虫的抗性(例如，改善的对跳甲的抗性)的植物或此类植物的种子，其中所述植物通过包括在植物中表达重组dna构建体的方法提供，其中所述重组dna构建体包含编码rna的dna，所述rna具有与昆虫的至少一个靶基因的片段基本上相同或基本上互补的序列，其中所述靶基因选自由以下组成的组：act5c、精氨酸激酶、copi(外被体亚单位)α、copi(外被体亚单位)β、copi(外被体亚单位)βprime、copi(外被体亚单位)δ、copi(外被体亚单位)ε、copi(外被体亚单位)γ、copi(外被体亚单位)δ、rpl07、rpl19、rpl3、rpl40、rps21、rps4、rpn2、rpn3、rpt6、rpn8、rpn9、rpn6-pb样蛋白、sar1、sec6、sec23、sec23a、shrb(snf7)、微管蛋白γ链、prosα2、prosβ5、蛋白酶体α2、蛋白酶体β5、vatp酶e、vatp酶a、vatp酶b、vatp酶d、vps2、vps4、vps16a、vps20、vps24、vps27、vps28、vha26(v-atp酶a)、vha68-2(v-atp酶d/e)、40s核糖体蛋白s14和60s核糖体蛋白l13。在一些实施方案中，所述重组dna构建体包含编码rna的dna，所述rna包含与选自由seq id no：1-859组成的组的dna序列的片段基本上相同或基本上互补的序列。在一些实施方案中，当与不表达所述重组dna构建体的植物相比时，表现出改善的对昆虫的抗性的植物的特征在于提高的产量。在一个实施方案中，通过例如在芥花籽或油籽油菜植物中表达靶向一个或多个十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)的基因的多核苷酸(诸如dsrna分子)，来提高芥花籽或油籽油菜植物中的产量(油籽生物量或油含量)，其中所述靶基因具有选自由seq id no：297-532组成的组的dna序列。几个实施方案涉及通过该方法提供的并表现出改善的对昆虫的抗性的植物的果实、种子或可繁殖部分。所述植物可以是受可通过根据该方法在植物中表达重组dna构建体来控制的昆虫侵染的任何植物。特定的目标植物包括商业上重要的植物，包括行栽作物植物、蔬菜和水果，以及其它农业或装饰用植物。合适的植物的实例在标题“植物”下提供。所述方法对于提供具有改善的对跳甲的抗性的观赏植物或作物植物尤其有用。所述方法的各种实施方案包括其中所述植物为十字花科的植物的那些实施方案，所述植物包括选自由以下组成的组的芸苔属物种：甘蓝型油菜、芥菜、埃塞俄比亚芥、白菜型油菜、甘蓝、褐芥、b.septiceps、黑芥、塌棵菜、小松菜、地中海野芜菁和地中海包心菜。在其它实施方案中，所述植物选自由以下组成的组：大豆、亚麻、玉米、红花、向日葵、烟草、拟南芥、巴西坚果、蓖麻、椰子、芜荽、棉属某些种、花生、加州希蒙得木、马铃薯、油棕、油橄榄、水稻、笋瓜、大麦和小麦。在一个实施方案中，所述方法提供具有改善的对黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲)的抗性的马铃薯植物。
[0078]
所述方法的实施方案提供了具有改善的对一种或多种跳甲物种的抗性的植物，所述跳甲物种是例如选自由以下属组成的组的属的物种：跳甲属、anthobiodes、侧刺跳甲属、aphthonaltica、刀刺跳甲属、apteopeda、瓢跳甲属、凹唇跳甲属、arrhenocoela、圆肩跳甲属、blepharida、凹胫跳甲属、啮跳甲属、沟胸跳甲属、derocrepis、二叶跳甲属、disonycha、毛跳甲属、hermipyxis、hermaeophaga、丝跳甲属、hippuriphila、horaia、瘤爪跳甲属、方胸
跳甲属、长跳甲属、长跗跳甲属、寡毛跳甲属、lythraria、玛碧跳甲属、曼跳甲属、meishania、卵形跳甲属、mniophila、neicrepidodera、九节跳甲属、novofoudrasia、ochrosis、oedionychis、oglobinia、峨眉球跳甲属、直缘跳甲属、orestia、paragopus、曲胫跳甲属、肿爪跳甲属、粗角跳甲属、菜跳甲属、podagrica、潜跳甲属、凹缘跳甲属、双行跳甲属、蚤跳甲属、细角跳甲属、小跳甲属、球跳甲属、systena、长瘤跳甲属、沟顶跳甲属和zipangia。在实施方案中，所述昆虫选自由以下组成的组：栖肤跳甲(赤杨跳甲)、加拿大跳甲(草原跳甲)、葡萄跳甲(葡萄跳甲)、绿色跳甲(杨桃跳甲)、蔷薇跳甲(玫瑰跳甲)、越橘跳甲(蓝莓跳甲)、榆跳甲(榆跳甲)、蚤凹胫跳甲(玉米跳甲)、chaetocnema conofinis(甘薯跳甲)、黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲)、systena blanda(浅条纹跳甲)和systena frontalis(红头跳甲)。在实施方案中，所述方法提供具有改善的对选自由以下组成的组的昆虫的抗性的植物：辣根莱跳甲(山葵跳甲)、十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)、微小菜跳甲(西方黑跳甲)、绿胸菜跳甲(条纹芜菁跳甲)、黑菜跳甲(芜菁跳甲)、罗布斯菜跳甲(菜园跳甲)、黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)、波条菜跳甲、油菜蚤跳甲和忽布蚤跳甲(蛇麻跳甲)。
[0079]
在一些实施方案中，针对给定的昆虫物种中的特定靶基因开发方法。在一些实施方案中，提供具有改善的对黑菜跳甲(芜菁跳甲)的抗性的植物，其中所述靶基因具有选自由seq id no：1-296组成的组的dna序列。在一些实施方案中，提供了具有改善的对十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)的抗性的植物，其中所述靶基因具有选自由seq id no：297-532组成的组的dna序列。在一些实施方案中，提供了具有改善的对黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)的抗性的植物，其中所述靶基因具有选自由seq id no：533-551组成的组的dna序列。在一些实施方案中，提供了具有改善的对油菜蚤跳甲的抗性的植物，其中所述靶基因具有选自由seq id no：552-859组成的组的dna序列。在一些实施方案中，提供了具有改善的对黑菜跳甲(芜菁跳甲)的抗性的植物，所述植物从重组dna构建表达dsrna链，所述dsrna链包含与选自由seq id no：860-1155组成的组约序列或其片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施方案中，提供了具有改善的对十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)的抗性的植物，所述植物从重组dna构建体表达dsrna，所述dsrna包含含有与选自由seq id no：1156-1391组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性的序列的链。在一些实施方案中，提供了具有改善的对黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)的抗性的植物，所述植物从重组dna构建体表达dsrna，所述dsrna包含含有与选自由seq id no：1392-1410组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性的序列的链。在一些实施方案中，提供了具有改善的对油菜蚤跳甲的抗性的植物，所述植物从重组dna构建体表达dsrna，所述dsrna包括含有与选自seq id no：1411-1718的序列或其片段具有约95％至约100％同一性的序列的链。
[0080]
编码用于昆虫控制的rna的重组dna构建体
[0081]
几个实施方案涉及重组dna构建体，其包含与编码rna转录物的dna可操作地连接的异源启动子，所述rna转录物包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％(例如，约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)同一性或互补性的序列。
[0082]
在重组dna构建体的一些实施方案中，所述rna转录物包含至少一条rna链，其包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％(例如，约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性的序
列。在一些实施方案中，所述rna转录物形成dsrna。在一些实施方案中，所述rna转录物是包含rna链的dsrna，所述rna链包含至少一个选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的rna序列或其片段的18个或更多个连续核苷酸的区段。在一些实施方案中，所述rna转录物是包含rna链的dsrna，所述rna链包含至少一个选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的rna序列或其片段的21个连续核苷酸的区段。在一些实施方案中，所述rna转录物是包含至少一条rna链的dsrna，所述rna链包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一些实施方案中，所述rna转录物是包含rna链的dsrna，所述rna链包含选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段。
[0083]
在所述重组dna构建体的一些实施方案中，异源启动子对于在细菌中表达rna转录物是有功能的。在其中要在细菌中表达所述重组dna构建体的一些实施方案中，细菌选自由以下组成的组：大肠杆菌(escherichia coli)、芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)的种、致病杆菌属(xenorhabdus)的种或发光杆菌属(photorhabdus)的种。在其它实施方案中，所述重组dna构建体包含在植物细胞中有功能的异源启动子。
[0084]
在一些实施方案中，所述重组dna构建体包含在重组载体诸如重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在实施方案中，例如通过稳定转化将所述重组dna构建体整合至植物染色体或质体中。
[0085]
相关方面包括在其基因组中包含重组dna构建体的转基因植物细胞，和包括此类转基因植物细胞的转基因植物。转基因植物细胞和植物通过本领域已知的方法(诸如在标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”下描述的那些方法)制备。其它方面包括从此类转基因植物产生的商品，以及转基因植物的转基因子代种子或可繁殖植物部分。
[0086]
相关信息和技术
[0087]
植物
[0088]
本文所述的用于处理和保护植物免受昆虫侵染的方法和组合物可用于广泛的植物。其中可使用本文公开的方法和组合物的合适的植物包括但不限于谷物和牧草(稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、珍珠粟、龙爪稷、冷季型牧草和百喜草)、和油籽类作物(大豆、油籽芸苔属，包括芥花籽或油籽油菜、向日葵、花生、亚麻、芝麻和红花)、豆科谷物和饲草(刀豆、豇豆、豌豆、蚕豆、扁豆、宽叶菜豆、亚洲豆(asiatic beans)、木豆、野豌豆(vetch)、鹰嘴豆、羽扇豆、紫花苜蓿和三叶草)、温带水果和坚果(苹果、梨、桃、李子、浆果作物、樱桃、葡萄、橄榄、杏和波斯胡桃)、热带和亚热带水果和坚果(柑橘类，包括酸橙、柑桔和葡萄柚；香蕉和车前草、菠萝、木瓜、芒果、鳄梨、猕猴桃、西番莲和柿子)、蔬菜作物(茄科植物，包括番茄、茄子和胡椒；蔬菜芸苔；萝卜、胡萝卜、瓜类蔬菜、葱蒜类蔬菜、芦笋和叶类蔬菜)、糖、块茎和纤维作物(甘蔗、甜菜、甜叶菊、马铃薯、甘薯、木薯和棉花)、种植作物、观赏植物和草坪草(turf grasses)(烟草、咖啡、可可、茶、橡胶树、药用植物、观赏植物和草坪草)和林木树物种。特定目标植物物种是十字花科的植物，包括芸苔属物种：甘蓝型油菜、芥菜、埃塞俄比亚芥、白菜型油菜、甘蓝、褐芥、b.septiceps、黑芥、塌棵菜、小松菜、地中海野芜菁和地中海包心菜。其它目标植物物种是大豆、亚麻、玉米、红花、向日葵、烟草、拟南芥、巴西坚果、蓖麻、椰子、芜荽、棉属某些种、花生、加州希蒙得木、马铃薯、油棕、油橄榄、稻、笋瓜、大麦和小麦。
[0089]
另外的构建体元件
[0090]
本文公开的多核苷酸和核酸分子的实施方案可包括另外的元件，诸如启动子、小rna识别位点、适体或核酶，用于表达编码序列(例如，表达转基因诸如杀虫蛋白或可选择标记)或非编码序(例如，以表达另外的抑制元件)的另外的和另外的表达盒。例如，一个方面提供了包含异源启动子的重组dna构建体，所述异源启动子与编码rna转录物的dna可操作地连接，所述rna转录物包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在另一个实施方案中，包含与dna(其编码：(a)rna转录物，其包含与选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列或其片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列；和(b)适体)可操作地连接的启动子的重组dna构建体被稳定地整合进植物的基因组中，在植物的细胞中从所述基因组表达包含所述rna适体和rna沉默元件的rna转录物；所述适体用于将rna沉默元件引导至细胞中的期望位置。在另一个实施方案中，包含一个或多个被小rna(例如，被仅在特定细胞或组织中表达的mirna或sirna)结合和切割的识别位点允许在植物中进行更精确的表达模式，其中在表达小rna的情况下，重组dna构建体的表达受到抑制。此类另外的元件在下文中进行描述。
[0091]
启动子
[0092]
本文公开的组合物和方法中使用的启动子在其中意欲转录构建体的细胞中是有功能的。通常这些启动子是异源启动子，如在重组构建体中使用的，即，在自然界中未发现它们与构建体中使用的其它核酸元件可操作地连接。在各种实施方案中，所述启动子选自由以下组成的组：组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子。在许多实施方案中，启动子是在植物中有功能的启动子，例如pol ii启动子、pol iii启动子、pol iv启动子或pol v启动子。
[0093]
适合于与本文公开的重组dna构建体一起使用的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可包括细胞器、细胞、组织或器官特异性启动子(例如，质体特异性、根特异性、花粉特异性或种子特异性启动子，分别用于在质体、根、花粉或种子中的表达)。在许多情况下，种子特异性、胚特异性、糊粉特异性或胚乳特异性启动子是特别有用的。时间特异性启动子可包括旨在于植物生长周期的某些发育阶段期间或在白天或夜晚的不同时间期间或在一年的不同季节促进表达的启动子。诱导型启动子包括由化学物质或环境条件诱导的启动子，所述环境条件是诸如但不限于生物或非生物胁迫(例如，缺水或干旱、热、冷、高或低养分或盐水平、高或低光照水平或害虫或病原体侵染)。微小rna启动子是有用的，特别是那些具有时间特异性、空间特异性或诱导型表达模式的启动子；mirna启动子的实例以及用于鉴定具有特异性表达模式的mirna启动子的方法提供于美国专利申请公开2006/0200878、2007/0199095和2007/0300329(所述专利申请公开明确地通过引用并入本文)中。表达特异性启动子还可包括通常组成型表达但在表达程度或“强度”不同的启动子，包括通常被认为是“强启动子”或“弱启动子”的启动子。
[0094]
特定目标启动子包括以下实例：从土壤杆菌属(agrobacterium)的t-dna分离的胭脂碱合酶启动子；花椰菜花叶病毒35s启动子；增强的启动子元件或嵌合型启动子元件诸如连接至增强子元件(来自玉米的热休克蛋白70的内含子)的增强的花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子；根特异性启动子诸如美国专利5,837,848、6,437,217和6,426,446中公开的启
动子；美国专利6,433,252中公开的玉米l3油质蛋白启动子；美国专利申请公开2004/0216189中公开的编码质体定位的醛缩酶的植物核基因的启动子；美国专利6,084,089中公开的冷诱导型启动子；美国专利第6,140,078号中公开的盐诱导型启动子；美国专利6,294,714中公开的光诱导型启动子；美国专利6,252,138中公开的病原体诱导型启动子；和美国专利申请公开2004/0123347a1中公开的水缺乏诱导型启动子。公开了启动子及其应用(特别是在植物中有功能的重组dna构建体中)的所有上述专利和专利公开，通过引用并入本文。
[0095]
目标植物维管或韧皮部特异性启动子包括发根土壤杆菌(agrobacterium rhizogenes)的rolc或rola启动子、根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)t-dna基因5的启动子、稻蔗糖合酶rss1基因启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子、椰子叶腐败病毒启动子、稻东格鲁杆状病毒启动子、豌豆谷氨酰胺合酶gs3a基因的启动子、马铃薯转化酶基因的invcd111和invcd141启动子、由kertbundit等(1991)proc.natl.acad.sci.u s a.,88:5212-5216所示的显示在烟草中具有韧皮部特异性表达的的从拟南芥分离的启动子、vahox1启动子区、豌豆细胞壁转化酶基因启动子、来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子、硫酸转运蛋白基因sultr11；3的启动子；植物蔗糖合酶基因的启动子和植物蔗糖转运蛋白基因的启动子。
[0096]
适合于与本文公开的重组dna构建体或多核苷酸一起使用的启动子包括聚合酶ii(“pol ii”)启动子和聚合酶iii(“pol iii”)启动子。rna聚合酶ii转录通常短于400个核苷酸长度的结构或催化rna，并且将t残基的简单运行识别为终止信号；其已经用于转录sirna双链体(参见例如lu等(2004)nucleic acids res.,32:e171)。因此，在其中从重组dna构建体产生短rna转录物的某些实施方案中，pol ii启动子是优选的。在一个实施方案中，所述重组dna构建体包含pol ii启动子以表达侧翼有自切割核酶序列(例如，自切割锤头核酶)的rna转录物，从而产生加工的rna，诸如单链rna，其结合跳甲基靶基因的转录物，具有确定的5'和3'末端，没有潜在的干扰侧翼序列。一种替代方法使用pol iii启动子来产生具有相对确定的5'和3'末端的转录物，即转录具有最小的5'和3'侧翼序列转录rna。在一些实施方案中，优选将pol iii启动子(例如，u6或h1启动子)用于添加短的富含at的转录终止位点，其在转录的rna中导致2个碱基对悬突(uu)；这是有用的，例如，用于sirna型构建体的表达。已经报道了使用pol iii启动子驱动sirna构建体的表达；参见van de wetering等(2003)embo rep.,4:609-615和tuschl(2002)nature biotechnol.,20:446-448。杆状病毒启动子诸如杆状病毒多角体蛋白和p10启动子是本领域已知的并且是商购可得的；参见，例如，invitrogen’s“guide to baculovirus expression vector systems(bevs)andinsect cell culture techniques”,2002(life technologies,carlsbad,ca)和f.j.haines等“baculovirus expression vectors”，未标日期的(oxford expression technologies,oxford,uk)。
[0097]
启动子元件可包含不是天然存在的启动子或其启动子元件或其同源物但可以调节基因表达的核酸序列。此类“不依赖于基因的”调节序列的实例包括天然存在的或人工设计的rna序列，其包含配体结合区或适体(参见下文的“适体”)和调节区(其可以是顺式作用的)。参见，例如，isaacs等(2004)nat.biotechnol.,22:841-847,bayer和smolke(2005)nature biotechnol.,23:337-343,mandal和breaker(2004)nature rev.mol.cell biol.,
5:451-463,davidson和ellington (2005)trends biotechnol.,23:109-112,winkler等(2002)nature,419:952-956,sudarsan等(2003)rna,9:644-647，以及mandal和breaker(2004)nature struct.mol.biol.,11:29-35。可选择或设计此类“核糖体调节剂”的特定空间或时间特异性，例如，以仅在给定浓度的适当配体的存在(或不存在)的情况下调节编码用于抑制靶基因的沉默元件的dna的翻译。一个实例是响应于在胁迫(例如，非生物胁迫诸如水、温度或营养胁迫或生物胁迫诸如害虫或病原体的附着)下由植物产生的内源性配体(例如，茉莉酮酸或水杨酸)的核糖体调节剂；在胁迫下，内源性配体的水平升高至足以使核糖体调节剂开始编码用于抑制靶基因的沉默元件的dna的转录的水平。
[0098]
重组酶位点
[0099]
在一些实施方案中，重组dna构建体或多核苷酸包含编码一个或多个位点特异性重组酶识别位点的dna。在一个实施方案中，所述重组dna构建体包含至少一对loxp位点，其中loxp位点之间的dna的位点特异性重组由cre重组酶介导。选择loxp位点的位置和相对方向以实现所需的重组；例如，当loxp位点处于相同的取向时，loxp位点之间的dna以环形形式切除。在另一个实施方案中，所述重组dna构建体包含编码一个loxp位点的dna；在cre重组酶和另一个具有loxp位点的dna存在的情况下，两个dna被重组。
[0100]
适体
[0101]
在一些实施方案中，所述重组dna构建体或多核苷酸包含加工成rna适体(即，通过不主要基于沃尔森-克里克碱基配对的结合机制(与例如在互补的反平行核酸链之间发生以形成双链核酸结构的碱基配对相反)结合配体的rna)的dna。例如，ellington和szostak(1990)nature,346:818-822。适体的实例可见于例如可在aptamer.icmb.utexas.edu上获得的公共aptamer数据库(lee等(2004)nucleic acids res.,32(1):d95-100)。然而，适体可以是单价的(结合单个配体)或多价的(结合不止一个单独的配体，例如结合一个单元的两个或更多个不同的配体)。
[0102]
配体包括可被核酸二级结构通过不主要基于沃尔森-克里克碱基配对的机制识别和结合的任何分子(或分子的一部分)。这样，配体与适体的识别和结合类似于抗原与抗体，或生物效应物与受体的识别和结合。配体可以包括单分子(或分子的一部分)或两个或更多个分子(或分子的部分)的组合，并且可以包括一个或多个大分子复合物(例如，聚合物、脂双层、脂质体、细胞膜或其它细胞结构或细胞表面)。特定配体的实例包括维生素诸如辅酶b
12
和焦磷酸硫胺素、黄素单核苷酸、鸟嘌呤、腺苷、s-腺苷甲硫氨酸、s-腺苷高半胱氨酸、辅酶a、赖氨酸、酪氨酸、多巴胺、葡糖胺-6-磷酸、咖啡因、茶碱、抗生素诸如氯霉素和新霉素、除草剂诸如草甘膦和麦草畏、蛋白质(包括病毒或噬菌体外壳蛋白和无脊椎动物表皮或消化道表面蛋白)、以及rna(包括病毒rna、转运rna(t-rna)、核糖体rna(rrna))以及rna聚合酶诸如rna依赖性rna聚合酶(rdrp)。一类rna适体是不结合配体但是热响应的“热交换器”，也就是说，适体的构象由温度决定；参见例如mandal和breaker(2004)nature rev.mol.cell biol.,5:451-463。
[0103]
转基因转录单位
[0104]
在一些实施方案中，本文公开的重组dna构建体或多核苷酸包括转基因转录单位。转基因转录单位包含编码目标基因的dna序列，例如天然蛋白质或异源蛋白质。目标基因可以是来自任何物种(包括但不限于非真核生物诸如细菌和病毒；真菌、原生生物、植物、无脊
椎动物和脊椎动物)的任何编码或非编码序列。特定的目标基因是编码一种或多种赋予对除草剂的抗性的蛋白质的基因和编码至少一种杀虫剂的基因，所述杀虫剂选自由以下组成的组块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白、和由球形赖氨酸芽孢杆菌(球形芽孢杆菌)、侧孢短芽孢杆菌(侧孢芽孢杆菌)、色杆菌属物种、紫色色杆菌、类芽孢杆菌属物种、缓病类芽孢杆菌和金龟子类芽孢杆菌的任一种产生的杀虫蛋白。转基因转录单元还可包含如转基因的转录所需的5'或3'序列或两者。
[0105]
内含子
[0106]
在一些实施方案中，所述重组dna构建体或多核苷酸包含编码可剪接的内含子的dna。“内含子”通常意指位于外显子(dna的蛋白质编码区段或相应的转录的rna)之间的dna的区段(或从此类区段转录的rna)，其中，在信使rna成熟期间，通过在真核生物的细胞核中发生的切割/连接过程将存在的内含子酶促地从rna链“剪接出”或去除。术语“内含子”也适用于转录为rna区段的非编码dna序列，所述rna区段可以从成熟的rna转录物剪接出，但不是在编码蛋白质的外显子之间发现的内含子。这些内含子的一个实例是具有在植物中(在一些情况下，特别是单子叶植物中)增强下游编码序列表达的能力的可剪接序列；这些可剪接序列天然位于一些植物基因的5'非翻译区中，以及在一些病毒基因中(例如，由gallie和walbot(1992)nucleic acids res.,20:4631-4638描述为增强植物基因表达的烟草花叶病毒5'前导序列或“ω”前导序列)。这些可剪接序列或“表达增强内含子”可被人工地插入在启动子之间但在任何蛋白质编码外显子之前的植物基因的5'非翻译区。此类表达增强内含子的实例包括但不限于玉米醇脱氢酶(zm-adh1)、玉米bronze-1表达增强内含子、稻肌动蛋白1(os-act1)内含子、shrunken-1(sh-1)内含子、玉米蔗糖合酶内含子、热休克蛋白18(hsp18)内含子和82千道尔顿热休克蛋白(hsp82)内含子。通过引用明确地并入本文的美国专利5,593,874和5,859,347描述了通过在位于基因启动子的3'和第一蛋白质编码外显子的5'的非翻译前导序列中包含源自70千道尔顿玉米热休克蛋白(hsp70)的表达增强内含子，来改进用于植物的重组dna构建体的方法。
[0107]
核酶
[0108]
在一些实施方案中，所述重组dna构建体或多核苷酸包含编码一种或多种核酶的dna。特定目标核酶包括自切割核酶、锤头核酶或发夹核酶。在一个实施方案中，所述重组dna构建体包含编码一种或多种核酶的dna，所述核酶用于切割转录的rna以提供限定的rna区段，诸如分离的有义或反义单链rna区段(其在实施方案中杂交以形成dsrna)，或具有形成用于抑制跳甲靶基因的至少部分dsrna(例如，在茎-环结构中)的自我互补核苷酸序列的rna区段。
[0109]
基因抑制元件
[0110]
在一些实施方案中，所述重组dna构建体或多核苷酸包含编码另外的基因抑制元件的dna，所述元件用于抑制除跳甲靶基因外的靶基因。待抑制的靶基因可包含编码或非编码序列或两者。
[0111]
在美国专利申请公开2006/0200878(其公开内容明确地通过引用并入本文)中详细描述了合适的基因抑制元件，并且包含以下的一种或多种：
[0112]
(a)包含至少一个反义dna片段的dna，所述反义dna片段对于待抑制的基因的至少
一个片段是反义的；
[0113]
(b)包含多个拷贝的至少一个反义dna区段的dna，所述反义dna区段对于待抑制的基因的至少一个区段是反义的；
[0114]
(c)包含至少一个有义dna区段的dna，所述有义dna区段是待抑制的基因的至少一个区段；
[0115]
(d)包含多个拷贝的至少一个有义dna区段的dna，所述有义dna区段是待抑制的基因的至少一个区段；
[0116]
(e)转录为通过形成双链rna来抑制待抑制的基因的rna，并且包含至少一个反义dna片段(其对于待抑制的基因的至少一个区段是反义的)和至少一个有义dna区段(其是待抑制的基因的至少一个区段)的dna；
[0117]
(f)转录为通过形成单个双链rna来抑制待抑制的基因的rna，并且包含多个连续反义dna区段(其对于待抑制的基因的至少一个片段是反义的)和多个连续有义dna区段(其是待抑制的基因的至少一个区段)的dna；
[0118]
(g)转录为通过形成多个rna的双链来抑制待抑制的基因的rna，并且包含多个反义dna区段(其对于待抑制的基因的至少一个片段是反义的)和多个有义dna区段(其是待抑制的基因的至少一个区段)的dna，并且其中所述多个反义dna区段和所述多个有义dna区段以一系列反向重复序列排列；
[0119]
(h)包含来源于植物mirna的核苷酸的dna；
[0120]
(i)包含sirna的核苷酸的dna；
[0121]
(j)转录成能够结合配体的rna适体的dna；和
[0122]
(k)转录为能够与配体结合的rna适体的dna，和转录为能够调节待抑制的基因的表达的调节rna的dna，其中所述调节依赖于调节rna的构象，并且所述调节rna的构象受rna适体的结合状态变构性影响。
[0123]
在一些实施方案中，内含子用于在任何蛋白质编码外显子(编码序列)不存在的情况下递送基因抑制元件。在一个实例中，通过在内含子中嵌入基因抑制元件来中断内含子，诸如表达增强内含子(在某些实施方案中是优选的)，其中，在转录时，所述基因抑制元件从内含子中切除。因此，不需要蛋白质编码外显子来提供抑制本文公开的重组dna构建体的基因抑制功能。
[0124]
转录调控元件
[0125]
在一些实施方案中，所述重组dna构建体或多核苷酸包含编码转录调控元件的dna。转录调控元件包括调控重组dna构建体的表达水平(相对于其在此类调控元件不存在的情况下的表达)的元件。合适的转录调控元件的实例包括核糖开关(顺式或反式作用)、转录稳定序列和mirna识别位点，如在美国专利申请公开2006/0200878(明确地通过引用并入本文)中详细描述的。
[0126]
转基因植物细胞和转基因植物
[0127]
本文公开的重组dna构建体可与其它重组dna堆叠，以用于赋予另外的性状(例如，在转化植物的情况下，包括除草剂抗性、害虫抗性、冷萌发耐受性、水缺乏耐受性等的性状)，例如，通过表达或抑制其它基因。用于协同减少和增加基因表达的构建体公开于美国专利申请公开2004/0126845a1(其明确地通过引用并入)中。
[0128]
在某些转基因植物细胞和转基因植物中，有时需要同时表达目标基因，同时还调节跳甲靶基因的表达。因此，在一些实施方案中，转基因植物含有重组dna，所述重组dna还包含用于表达至少一种目标基因的基因表达元件，并且用于跳甲控制的重组dna构建体的转录优选通过基因表达元件的同时转录来实现。在实施方案中，所述转基因植物表达编码用于抑制跳甲靶基因的本文公开的重组rna转录物的dna，并且还表达编码非核苷酸杀虫剂诸如小分子杀虫剂或蛋白质性质杀虫剂的dna；此类dna可被堆叠在单个重组构建体或表达盒中，或者可从离散的重组构建体或表达盒表达。非核苷酸杀虫剂的实例包括块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇和细菌杀虫蛋白(例如，来自苏云金芽孢杆菌、致病杆菌属某种、发光杆菌属某种、侧孢短芽孢杆菌(侧孢芽孢杆菌)、球形赖氨酸芽孢杆菌(球形芽孢杆菌)、色杆菌属某种、紫色色杆菌、类芽孢杆菌属某种、缓病类芽孢杆菌和金龟子类芽孢杆菌的杀虫蛋白)。在实施方案中，转基因植物表达编码用于抑制跳甲靶基因的本文公开的重组rna转录物的dna，并且还表达编码一种或多种赋予除草剂耐受性的蛋白质的dna。赋予除草剂耐受性的蛋白质的实例包括赋予对草甘膦的耐受性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsps；参见，例如，美国专利第5,627,061号、第5,633,435re39247号、第6,040,497号和第5,094,945号，以及pct国际申请公开wo04074443和wo04009761)、草甘膦氧化还原酶(gox；美国专利第5,463,175号)、草甘膦脱羧酶(pct国际申请公开wo05003362，美国专利第7,405,347号和美国专利申请公开2004/0177399)、草甘膦-n-乙酰基转移酶(gat；美国专利第7,714,188号)；；赋予对植物生长激素样除草剂诸如麦草畏的耐受性的麦草畏单加氧酶(美国专利第7,105,724号)；赋予对膦丝菌素或草铵膦的耐受性的膦丝菌素乙酰基转移酶(pat或bar)(美国专利第5,646,024号)；赋予对2,2-二氯丙酸(茅草枯)的耐受性的2,2-二氯丙酸脱卤素酶(pct国际申请公开wo9927116)；赋予对乙酰基乳酸合酶抑制剂诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基苯甲酸酯和苯酞的耐受性的乙酰基羟基酸合酶或乙酰基乳酸合酶(美国专利第6,225,105号)；用于赋予对溴苯腈的耐受性的卤代芳基腈水解酶(bxn)(美国专利第4,810,648号)；用于赋予对环己二酮(稀禾定)和芳氧基苯氧基丙酸酯(氟吡甲禾灵)的耐受性的经修饰的乙酰辅酶a羧化酶(美国专利第6,414,222号)；用于赋予对磺酰胺除草剂的耐受性的二氢过酸酯合酶(sul i)(美国专利第5,719,046号)；用于赋予对三嗪除草剂的耐受性的32kda光系统ii多肽(psba)(hirschberg等，1983,science,222:1346-1349)；用于赋予对5-甲基色氨酸的耐受性的氨基苯甲酸合酶(美国专利第4,581,847号)；用于赋予对氨基乙基半胱氨酸的耐受性二氢吡啶二羧酸合酶(dap a)(pct国际申请公开wo8911789)；用于赋予对哒嗪酮除草剂诸如达草灭的耐受性的八氢番茄红素去饱和酶(crti)(日本专利jp06343473)；用于赋予对环丙基异噁唑除草剂诸如异噁唑草酮(美国专利第6,268,549号)的耐受性的羟基苯基丙酮酸双加氧酶、4-羟基苯基乙酸氧化酶和4-羟基苯基乙酸1-水解酶(美国专利7,304,209)；用于赋予对原卟啉原氧化酶抑制剂的耐受性的经修饰的原卟啉原氧化酶i(protox)(美国专利第5939602号)；用于赋予对芳氧基链烷酸酯部分的除草剂的耐受性的芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aad-1)(wo05107437)；丝氨酸羟基甲基转移酶(美国专利申请公开2008/0155716)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶(美国专利申请公开2009/0018016)。此类除草剂的实例包括苯氧基生长激素(诸如2,4-d和二氯丙酸)、吡啶氧基生长激素(诸如氟草烟和绿草定)、芳氧基苯氧基丙酸酯(aopp)乙酰辅酶a羧化酶(acc酶)抑制剂(诸如吡氟氯禾灵、喹禾灵和二氯芬)以及5-取代的苯氧基乙酸酯原卟啉原
氧化酶ix抑制剂(诸如吡草醚和氟烯草酸)。编码除草剂耐受性蛋白质的核酸的核苷酸序列和除草剂耐受性蛋白质的序列(如本段中引用的美国专利和专利申请公开中所公开的)通过引用并入本文。
[0129]
在一些实施方案中，本文公开的重组dna构建体可在任何发育阶段的任何植物细胞或组织或整个植物中转录。转基因植物可以来源于任何单子叶植物或双子叶植物，诸如但不限于商业或农业目标植物，诸如作物植物(尤其是用于人类食物或动物饲料的作物植物)、木材或纸浆生产树木、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。目标植物的实例包括谷物作物植物(诸如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、稻、粟、高粱、藜麦(quinoa)、苋菜和荞麦)；饲料作物植物(诸如牧草和草料双子叶植物紫花苜蓿、野豌豆、三叶草等)；油籽作物植物(诸如棉花、红花、向日葵、大豆、芥花籽、油菜籽、亚麻、花生和油棕)；树生坚果(诸如核桃、腰果、榛子、美洲山核桃、杏等)；甘蔗、椰子、枣椰子、橄榄、甜菜、茶和咖啡；木材或纸浆生产树木；蔬菜作物植物诸如豆类(例如，豆类、豌豆、扁豆、紫花苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、芸苔属植物(例如，元白菜、羽衣甘蓝、芥末和其它叶状芸苔属植物、西兰花、花椰菜、球芽甘蓝、芜菁、球垄甘蓝(kohlrabi))、可食用瓜类蔬菜(例如，黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜)、可食用葱蒜类蔬菜(例如，洋葱、大蒜、韭葱、青葱、细香葱)、茄科的可食用成员(例如，西红柿、茄子、马铃薯、锦灯笼(groundcherries))和藜科的可食用成员(例如，甜菜、牛皮菜、菠菜、藜麦、苋菜)；果实作物诸如苹果、梨、柑橘类水果(例如，柑桔、酸橙、柠檬、葡萄柚等)、核果(例如，杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、木瓜、鳄梨和浆果；生长用于生物质或生物燃料的植物(例如，芒草、柳枝稷、麻风树、油棕、真核微藻诸如布朗葡萄藻(botryococcus braunii)、小球藻属某些种(chlorella spp.)和杜氏藻属某些种(dunaliella spp.)，以及真核大藻类，诸如江篱属某些种(gracilaria spp.)和马尾藻属某些种(sargassum spp.)；和观赏植物，包括观赏开花植物、观赏树和灌木、观赏地被物和观赏草。其中转录重组dna构建体以提供对跳甲的抗生的特定的目标植物种是十字花科的植物，包括芸苔属物种：甘蓝型油菜、芥菜、埃塞俄比亚芥、芜菁、甘蓝、褐芥、b.septiceps、黑芥、塌棵菜、小松菜、地中海野芜菁和地中海包心菜。其中转录重组dna构建体以提供对跳甲的抗生的另外的目标植物种为大豆、亚麻、玉米、红花、向日葵、烟草、拟南芥、巴西坚果、蓖麻、椰子、芜荽、棉属某些种、花生、加州希蒙得木、马铃薯、油棕、油橄榄、稻、笋瓜、大麦和小麦。
[0130]
本文还公开了从表达赋予改善的对本文公开的跳甲的抗性的重组dna构建体的转基因植物细胞、植物或种子产生的商品，其包括但不限于收获的叶、根、芽、块茎、茎、果实、种子或植物的其它部分、粉、油、提取物、发酵或消化产品、植物的粉碎的或完整的谷物或种子，或包含从本文公开的转基因植物细胞、植物或种子产生的此类商品的任何食品或非食品。在本文中考虑的一种或多种商品或商品产品中检测用于跳甲控制的重组dna构建体的核酸序列的一个或多个序列是事实上的证据，其表所述明商品或商品产品含有或来源于表达此类重组dna构建体的转基因植物细胞、植物或种子。
[0131]
通常，在其基因组中具有如本文所公开的重组dna构建体的转基因植物表现出增加的对昆虫侵染的抗性，特别改善的对跳甲侵染的抗性。在各种实施方案中，例如，当转基因植物表达与其它重组dna堆叠的用于跳甲控制的重组dna构建体(以赋予另外的性状)时，相对于缺乏所述重组dna构建体的植物，转基因植物具有至少一个另外的改变的性状，所述
性状选自由以下组成的组：
[0132]
(a)改善的非生物胁迫耐受性；
[0133]
(b)改善的生物胁迫耐受性；
[0134]
(c)改变的初级代谢物的组成；
[0135]
(d)改变的次生代谢物的组成；
[0136]
(e)改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素的组成；
[0137]
(f)提高的产量；
[0138]
(g)提高的使用氮、磷酸盐或其它营养物的能力；
[0139]
(h)改变的农学特性；
[0140]
(i)改变的生长或繁殖特征；和
[0141]
(j)改善的收获、储存或加工质量。
[0142]
在一些实施方案中，转基因植物的特征在于：改善的对非生物胁迫(例如，水缺乏或干旱、热、冷、非最佳营养物或盐水平、非最佳光照水平的耐受性)或生物胁迫(例如，拥挤、化感作用或损伤)的耐受性；通过改变的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变的次级代谢物(例如，生物碱、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)；改善的微量元素(例如，铁、锌)、类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如，生育酚)组成；提高的产量(例如，在非胁迫条件下的提高的产量或在生物或非生物胁迫下的提高的产量)；改善的使用氮、磷酸盐或其它营养物的能力；改变的农学特性(例如，延迟的成熟；延迟的衰老；早或晚成熟；改善的耐荫性；改善的对根或茎倒伏的抗性；改善的对茎的“绿色扣(green snap)”的抗性；改善的光周期响应)；改变的生长或繁殖特征(例如，有意的矮化；有意的雄性不育，例如用于杂交程序；提高的营养生长速率；改善的萌发；改善的雄性或雌性生育力)；改善的收获、储存或加工质量(例如，在贮存期间改善的对虫性的抗性，改善的对破坏的抗性，提高的对消费者的吸引力)；或这些性状的任意组合。
[0143]
在另一个实施方案中，转基因种子或由转基因植物产生的种子具有改变的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)的组成、改变的次级代谢物的组成、改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素的组成、改善的收获、贮存或加工质量，或这些的组合。在另一个实施方案中，可能需要改变转基因植物或转基因植物的种子的天然组分的水平，例如以降低变应原蛋白或糖蛋白或毒性代谢物的水平。
具体实施方案
[0144]
实施例1
[0145]
本实施例说明了用作用于控制昆虫物种和用于制备用于控制昆虫的组合物和昆虫抗性转基因植物的靶基因的编码dna序列的非限制性实施方案，并鉴定用于控制昆虫物种的dsrna触发剂序列。更具体地，在seq id no：1-859中提供了用于控制跳甲的通过名称(注释)和序列标识符(seq id no.)标识的靶基因的实施方案，以及在seq id no.：860-1718中提供了在135个至352个碱基对的大小范围内并被设计来抑制这些靶基因的dsrna触发剂序列的实施方案。
[0146]
表1
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151]
[0152][0153]
*以5'至3'方向提供了dsrna触发剂的反义链的触发剂序列。
[0154]
**t44966和t44967是zhao等(2008),eur.j.entomol.,5:815.中公开的基于黄曲条菜跳甲精氨酸激酶mrna的阳性对照。
[0155]
表1中提供的dsrna触发剂序列的实施方案通常用于表1中鉴定的相应靶基因的
rna介导的抑制。这些dsrna触发剂可用于控制昆虫，尤其是跳甲，包括从其鉴定表1中的靶基因的来源物种。表1中提供的一种或多种靶基因的rna介导的抑制或表1中提供的一种或多种dsrna触发剂的使用，可用于在以下属中引起目标昆虫物种的死亡或生长迟缓或以其它方式控制所述昆虫物种：跳甲属、anthobiodes、侧刺跳甲属、aphthonaltica、刀刺跳甲属、apteopeda、瓢跳甲属、凹唇跳甲属、arrhenocoela、圆肩跳甲属、blepharida、凹胫跳甲属、啮跳甲属、沟胸跳甲属、derocrepis、二叶跳甲属、disonycha、毛跳甲属、hermipyxis、hermaeophaga、丝跳甲属、hippuriphila、horaia、瘤爪跳甲属、方胸跳甲属、长跳甲属、长跗跳甲属、寡毛跳甲属、lythraria、玛碧跳甲属、曼跳甲属、meishania、卵形跳甲属、mniophila、neicrepidodera、九节跳甲属、novofoudrasia、ochrosis、oedionychis、oglobinia、峨眉球跳甲属、直缘跳甲属、orestia、paragopus、曲胫跳甲属、肿爪跳甲属、粗角跳甲属、菜跳甲属、podagrica、潜跳甲属、凹缘跳甲属、双行跳甲属、蚤跳甲属、细角跳甲属、小跳甲属、球跳甲属、systena、长瘤跳甲属、沟顶跳甲属和zipangia。在实施方案中，包含用于表1中提供的一种或多种靶基因的抑制的dsrna触发剂的组合物(例如，包含有效量的表1中提供的一种或多种dsrna触发剂的组合物)用于控制以下的至少一种：栖肤跳甲(赤杨跳甲)、加拿大跳甲(草原跳甲)、葡萄跳甲(葡萄跳甲)、绿色跳甲(杨桃跳甲)、蔷薇跳甲(玫瑰跳甲)、越橘跳甲(蓝莓跳甲)、榆跳甲(榆跳甲)、蚤凹胫跳甲(玉米跳甲)、chaetocnema conofinis(甘薯跳甲)、黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲)、systena blanda(浅条纹跳甲)和systena frontalis(红头跳甲)，从而预防或治疗这些物种对植物的侵染。例如，包含有效量的表1中提供的一种或多种dsrna触发剂的组合物用于预防或治疗黄瓜毛跳甲(马铃薯跳甲)对马铃薯植物的侵染。
[0156]
在实施方案中，表1中提供的一种或多种靶基因的rna介导的抑制或表1中提供的一种或多种dsrna触发剂的使用，可用于引起属菜跳甲属和蚤跳甲属的跳甲物种的死亡或生长迟缓，从而预防或治疗这些物种对植物的侵染。在具体实施方案中，表1中提供的一种或多种靶基因的rna介导的抑制或表1中提供的一种或多种dsrna触发剂的使用，可用于引起选自由以下组成的组的至少一种跳甲物种的死亡或生长迟缓：辣根莱跳甲(山葵跳甲)、十字花菜跳甲(芥花籽跳甲)、微小菜跳甲(西方黑跳甲)、绿胸菜跳甲(条纹芜菁跳甲)、黑菜跳甲(芜菁跳甲)、罗布斯菜跳甲(菜园跳甲)、黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)、波条菜跳甲、油菜蚤跳甲和忽布蚤跳甲(蛇麻跳甲)。在实施方案中，一种或多种具有选自由seq id no：1-296组成的组的序列的靶基因的rna介导的抑制用于引起黑菜跳甲(芜菁跳甲)成虫或幼虫的死亡或生长迟缓，例如通过使黑菜跳甲成虫、幼虫或卵与有效量的dsrna触发剂(包含选自由seq id no：860-1155组成的组的序列)接触。在实施方案中，一种或多种具有选自由seq id no：297-532组成的组的序列的靶基因的rna介导的抑制用于引起萝卜菜跳甲(phyllotreta cruciferae)(芥花籽跳甲)成虫或幼虫的死亡或生长迟缓，例如通过使十字花菜跳甲成虫、幼虫或卵与有效量的dsrna触发剂(包含选自由seq id no：1156-1391组成的组的序列)接触。在实施方案中，一种或多种具有选自由seq id no：533-551组成的组的序列的靶基因的rna介导的抑制用于引起黄曲条菜跳甲(条纹跳甲)成虫或幼虫的死亡或生长迟缓，例如通过使黄曲条菜跳甲成虫、幼虫或卵与有效量的dsrna触发剂(包含选自由seq id no：1392-1410组成的组的序列)接触。在实施方案中，一种或多种具有选自由seq id no：552-859组成的组的序列的靶基因的rna介导的抑制用于引起油菜蚤跳甲成虫或幼虫的死亡或生长迟
缓，例如通过使油菜蚤跳甲成虫、幼虫或卵与有效量的dsrna触发剂(包含选自由seq id no：1411-1718组成的组的序列)接触。
[0157]
可以通过转基因表达或局部施加一种或多种表1中提供的dsrna触发剂而受到保护免受此类侵染的植物包括经受跳甲侵染的任何植物物种或变种，尤其是具有经济重要性的植物，包括观赏植物和作物植物。此类植物的实施方案包括科十字花科(芥菜科(mustard family))的植物，诸如属芸苔属的植物，包括例如以下之一：甘蓝型油菜(油菜籽，包括栽培品种，诸如芥花籽和芜菁甘蓝)、芥菜(印度芥菜)、埃塞俄比亚芥(阿比西尼亚芥菜(abyssinian mustard))、芜菁(芜菁(turnip))、甘蓝(野生卷心菜，包括驯化的栽培品种，诸如羽衣甘蓝、卷心菜、西兰花、花椰菜、球芽甘蓝等)、褐芥(褐色芥菜)、b.septiceps(seventop mustard)、黑芥(黑色芥菜)、塌棵菜(塌菜(broadbeaked mustard))、小松菜(芥末菠菜(mustard spinach))、地中海野芜菁(亚洲芥菜(asian mustard))和地中海包心菜(地中海卷心菜)。在另外的实施方案中，所述目标植物可包括但不限于以下的一种：大豆(大豆(soybean))、亚麻(亚麻籽/亚麻(flax))、玉米(玉米(maize))，红花(红花(safflower))、向日葵(向日葵(sunflower))、烟草(烟草(tobacco))、拟南芥、巴西坚果(巴西坚果(brazil nut))、蓖麻(蓖麻子)、椰子(椰子(coconut))、芜荽(胡荽(coriander))、棉属某些种(棉花)、花生(落花生或花生)，加州希蒙得木(霍霍巴)、马铃薯(马铃薯(potato))、油棕(油棕(oil palm))、油橄榄(橄榄)、水稻(稻)、笋瓜(南瓜)、大麦(大麦(barley))和小麦(小麦(wheat))。
[0158]
一个方面包括组合物，其包含有效量的表1中提供的一种或多种dsrna触发剂，以用于因跳甲侵染而待治疗或待保护以免受跳甲侵染的植物的局部治疗。另一方面包括重组dna构建体用于相较于不表达此类构建体的植物，在具有改善的对跳甲侵染的抗性的植物中进行转基因表达，所述重组dna构建体编码表1中提供的至少一种dsrna触发剂的至少一条链。
[0159]
实施例2
[0160]
本实施例举例说明了测试dsrna触发剂序列的功效并验证触发剂抑制用作用于控制昆虫物种的靶基因的编码dna序列的效用的非限制性实施方案。更具体地，本实施例举例说明了方法，其包括使昆虫诸如跳甲成虫或幼虫与一种或多种dsrna触发剂接触，所述dsrna触发剂被设计来引起昆虫的生长迟缓或死亡。其它实施方案包括其中通过经口递送(例如，在昆虫摄取的食物材料上或其中)或通过非经口递送(例如，通过昆虫角质层的递送或通过接触昆虫的卵的递送)将dsrna触发剂递送至昆虫的方法。
[0161]
在一个实施方案中，使用饲养测定来测定dsrna触发剂在引起昆虫诸如跳甲中的生长迟缓或死亡方面的功效。为了测试dsrna触发剂杀死跳甲或使跳甲生长迟缓的功效，使用单一的区分剂量(例如，100纳克/毫升)来鉴定具有在此剂量下杀死跳甲或使跳甲生长迟缓的可测量能力的dsrna触发剂。也将阴性对照dsrna触发剂，诸如靶向绿色萦光蛋白(gfp)的dsrna包括在测定中。将每种dsrna触发剂均匀地涂覆在1.0厘米直径的芥花籽叶盘上，并置于多孔托盘中，每孔中有2只雄性和2只雌性成年跳甲或4只跳甲幼虫。每24小时提供新鲜涂覆的新叶，持续规定的时间(例如，2周)。对生长迟缓和死亡定期评分(例如，每天或每2或3天)。
[0162]
进一步测试在该单剂量测定中显示功效的dsrna触发剂。使用类似的方案，如上所
述测试不同剂量的dsrna触发剂，以确定每种活性dsrna的lc50剂量。生物测定包括每剂量12-24只昆虫，以一式三份进行。在2周时间内评估生长迟缓和死亡，每三天进行评分。
[0163]
被确认以序列特异性方式有效抑制靶基因的dsrna触发序列可用于鉴定有效的rna递送剂和制剂。含有dsrna触发剂的制剂的杀虫活性可以通过各种技术优化，诸如修饰制剂中的化学实体或改变制剂中化学组分的比率。递送剂和制剂的非限制性实例在实施例5中提供。
[0164]
实施例3
[0165]
本实施例举例说明了用于验证dsrna触发剂抑制或沉默昆虫细胞中的靶基因或引起昆虫中的生长迟缓或死亡的功效的方法的非限制性实施方案。更具体地，本实施例举例说明了测试用于dsrna触发剂在整个植物中预防或治疗跳甲侵染的功效的方法。
[0166]
在整个植物测定中进一步评价已经被确认以序列特异性方式有效抑制靶基因的多核苷酸(诸如实施例1和2中所述的dsrna触发剂序列)。在一种方法中，将多核苷酸(例如，dsrna触发剂)直接施加于昆虫表面(例如通过喷雾或撒粉)。在另一种方法中，将多核苷酸在昆虫的饮食中(例如，在表达dsrna触发剂诸如dsrna触发剂的发夹形式的细菌或植物细胞中，或在含rna的人工诱饵中)提供给昆虫。如实施例2所述，定期对生长迟缓和死亡评分。
[0167]
在也适用于大规模应用(例如，对作物植物的田地)的各种方法中，通过对叶面进行空中或陆地喷雾或撒粉或化学灌溉于叶面上来施加多核苷酸，以控制来自生命周期的成虫阶段的早期季节损害，或将所述多核苷酸用作种子处理剂施加以控制昆虫生命周期的幼虫或成虫阶段，或作为犁沟中或湿透施加来施加以控制昆虫生命周期的幼虫或成虫阶段。叶面测试方案的实例包括在从地面出苗后立即处理植物，并在植物出苗后1-2周评价由成年跳甲造成的叶面损伤。对于犁沟中或种子处理，遵循类似的损伤评价时间安排。
[0168]
实施例4
[0169]
多核苷酸通常被设计来通过诱导昆虫靶基因的调节或抑制来调节表达，以及被设计来具有与昆虫靶基因或cdna的核苷酸序列(例如，seq id no：1-859)或与从昆虫靶基因转录的rna序列基本上相同或基本上互补的核苷酸序列，其可以是编码序列或非编码序列。调节表达的这些有效多核苷酸分子在本文中称为“触发剂”或“多种触发剂(triggers)”。本实施例描述了用于将多核苷酸设计和选择为“触发剂”以调节昆虫靶基因表达的非限制性技术。
[0170]
通过“铺盖(tiling)”选择多核苷酸触发剂
[0171]
在本文公开的组合物和方法中使用的多核苷酸不需要具有靶基因的全长，并且在许多实施方案中与靶基因相比具有短得多的长度。可用于选择有效触发剂的技术的实例是“铺盖”或评价对应于靶基因的相邻或部分重叠片段的多核苷酸。
[0172]
有效的多核苷酸“触发剂”可通过在所选长度的片段例如长度为200-300个核苷酸的片段中以例如约25个核苷酸的部分重叠区中沿着靶基因的长度“铺盖”基因靶来鉴定。为了抑制单个基因，触发序列被设计来对应于(与对于靶基因是独特的区域具有核苷酸同一性或互补性)对于靶基因是独特的区域；靶基因的选定区域可包含编码序列或非编码序列(例如，启动子区、3'非翻译区、内含子等)或两者的组合。
[0173]
当目标是设计有效抑制多个靶基因的靶时，比对多条靶基因序列，并设计多核苷酸触发剂以使其对应于多个靶中共同具有高序列同源性的区域。相反地，当目标是设计有
效地选择性抑制多条靶序列中的一条的靶时，将多个靶基因序列进行比对，并设计多核苷酸触发剂以使其对应于在多个靶之间没有序列同源性或具有低序列同源性的区域。
[0174]
在非限制性实例中，如下针对表1中列出的每种靶基因设计反义单链rna触发剂。多个反义单链rna触发剂(每个长度为200-300个核苷酸，并且具有对应于(例如，对于反义触发剂而言，互补于)具有选自seq id no：1-859的序列的靶基因的片段的序列)被设计来使得每个触发剂的序列以使得多个触发剂组合覆盖靶基因的全长的方式与下一个相邻触发剂的序列的约25个核苷酸重叠。(以类似的方式设计有义触发剂，其中所述触发剂序列与靶基因的片段相同。类似地，双链触发剂可通过提供成对的有义和反义触发剂来设计，每对触发剂与下一相邻的触发剂对重叠。)
[0175]
通过任何方便的方法测试多核苷酸触发剂在沉默昆虫靶基因方面的功效。合适的测试的实例包括本文在工作实施例中描述的生物测定。另一个测试包括将多核苷酸触发剂直接局部施加于单个昆虫或保护免受昆虫侵染的植物表面。利用如本文公开的多核苷酸处理的一个期望的结果是预防或控制昆虫侵染，例如通过在昆虫中诱导生理或行为变化，诸如但不限于生长迟缓、死亡增加、繁殖能力降低、摄食行为或运动减少或停止，或变态阶段发育减少或停止。利用如本文公开的多核苷酸处理的另一个期望的结果是提供表现出改善的对昆虫侵染的抗性的植物。
[0176]
如果需要，可重复铺盖程序。经发现提供所需活性的多核苷酸触发剂本身可以经受铺盖程序。例如，设计多个重叠的反义单链rna触发剂，每个长度为50-60个核苷酸，并且具有对应于(例如，对于反义启动子而言，互补于)靶基因的片段的序列，所述靶基因的片段具有选自seq id no：1-859的序列，对于其发现300个核苷酸的单多核苷酸触发剂是有效的。可以进行另几轮的铺盖分析，其中测试短至18个、19个、20个或21个核苷酸的触发剂。
[0177]
在本文公开的各种方法中，可以单独或组合地使用任何大小的有效多核苷酸触发剂。在一些实施方案中，使用单个多核苷酸触发剂来制备组合物(例如，用于局部施加的组合物或用于制备转基因植物的重组dna构建体)。在其它实施方案中，使用不同多核苷酸触发剂的混合物或汇集物；在此类情况下，多核苷酸触发剂可针对单个靶基因或多个靶基因。在一些实施方案中，多核苷酸触发剂被设计来靶向靶基因的不同区域，例如触发剂可包含对应于靶基因的不同外显子区域的多个区段，并且不对应于靶基因的“间隔子”核苷酸可任选地用于区段之间或邻近区段。
[0178]
选择多核苷酸触发剂中的热力学考虑
[0179]
可以设计多核苷酸触发剂或使用热力学考虑优化它们的序列。例如，可基于控制一条核酸链(例如，多核苷酸触发剂或单个sirna)与另一条核酸链(例如，靶基因转录物)之间的杂交的热力学来选择多核苷酸触发剂。
[0180]
预测可能在靶基因的rnai介导的沉默中有效的核苷酸序列的方法和算法是本领域已知的。此类方法和算法的非限制性实例包括由ichihara等(2007)nucleic acids res.,35(18):123e描述的“i-评分”；“oligowalk”，可在rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk上公共地获得并由lu等(2008)nucleic acids res.,36:w104-108描述；和由khovorova等(2004)nature biotechnol.,22:326-330描述的“雷诺兹评分”。
[0181]
允许的错配
[0182]“基本上相同的”或“基本上互补的”意指触发剂核苷酸(或双链多核苷酸的至少一
条链)具有与靶基因或与从靶基因转录的rna(例如，转录物)具有足够的同一性或互补性来抑制靶基因的表达(例如，以实现靶基因转录物和/或编码的蛋白质的水平或活性的降低)。多核苷酸不必与靶基因或从靶基因转录的rna具有100％同一性或互补性来抑制靶基因的表达(例如，以实现靶基因转录物或编码的蛋白质的水平或活性的降低，或提供昆虫物种的控制)。在一些实施方案中，多核苷酸或其部分被设计来与靶基因或从靶基因转录的rna中的至少18个或19个连续核苷酸的序列基本上相同或基本上互补。在一些实施方案中，多核苷酸或其部分被设计来与靶基因或从靶基因转录的rna中的21个连续核苷酸的序列完全相同或完全互补。在某些实施方案中，“基本上相同的”多核苷酸，当与内源性靶基因中的18个或更多个连续核苷酸的序列或与从所述靶基因转录的rna相比较时，具有100％序列同一性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施方案中，“基本上互补的”多核苷酸，当与靶基因或从所述靶基因转录的rna中的18个或更多个连续核苷酸相比较时，具有100％序列互补性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。
[0183]
含有与靶基因或转录物错配的多核苷酸可用于本文公开的组合物和方法的某些实施方案中。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与靶基因或靶基因的转录物等同长度的区段基本上相同或基本上互补的至少18个或至少19个连续核苷酸。在某些实施方案中，与靶基因或靶基因的转录物等同长度的区段基本上相同或基本上互补的19个连续核苷酸的多核苷酸可与靶基因或转录物具有1或2个错配(即，多核苷酸的19个连续核苷酸与靶基因或靶基因的转录物等同长度的区段之间的1或2个错配)。在某些实施方案中，含有与靶基因或靶基因的转录物等同长度的区段具有同一性或互补性的连续19个核苷酸的跨度的20个或更多个核苷酸的多核苷酸可与靶基因或转录物具有1或2个错配。在某些实施方案中，与靶基因或靶基因的转录物等同长度的区段基本上相同或基本上互补的21个连续核苷酸的多核苷酸可与靶基因或转录物具有1、2或3个错配。在某些实施方案中，含有与靶基因或靶基因的转录物等同长度的区段具有同一性或互补性的连续21个核苷酸的跨度的22个或更多个核苷酸的多核苷酸可与靶基因或转录物具有1、2或3个错配。
[0184]
在设计与内源性靶基因或从靶基因转录的rna具有错配的多核苷酸中，可在更可能被耐受的某些位置上使用某些类型的错配。在某些示例性实施方案中，使用在腺苷与胞嘧啶之间或鸟苷与尿嘧啶残基之间形成的错配，如由du等(2005)nucleic acids res.,33:1671-1677所述的。在一些实施方案中，19个碱基对重叠区中的错配位于低耐受性位置5、7、8或11(从19个核苷酸靶的5'端计)，位于中等耐受位置3、4和12-17(从19-核苷酸靶的5'末端计)，和/或位于互补性区域的任一末端的高耐受性位置，例如位置1、2、18和19(从19-核苷酸靶的5'末端计)，如由du等(2005)nucleic acids res.,33:1671-1677所述的。可在常规测定(诸如本文在工作实施例中描述的那些测定)中经验性地确定耐受的错配。
[0185]
在一些实施方案中，出于稳定性或为了方便克隆或合成的原因，所述多核苷酸包含另外的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸是dsrna，其包含具有选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列的至少21个连续核苷酸的区段的rna链，并且还包含与所述区段相邻的另外的5'g或另外的3'c或两者。在另一个实施方案中，所述多核苷酸是包含额外的核苷酸以形成悬突的双链rna，例如，包含2个脱氧核糖核苷酸以形成3'悬
突的dsrna。
[0186]
在中性序列中嵌入活性触发剂
[0187]
在一个实施方案中，将生物活性触发剂(即，具有对应于靶基因的序列并且负责观察到的靶基因的抑制的多核苷酸)嵌入在“中性”序列中，例如插入与靶基因没有序列同一性或互补性的另外的核苷酸。中性序列可以是期望的，例如，以增加多核苷酸的总长度。例如，出于稳定性、制造中的成本效益或生物活性的原因，可能期望多核苷酸具有特定大小。
[0188]
据报道，在人工饮食生物测定中，在另一种鞘翅目物种，即玉米根萤叶甲中，大于或等于约60个碱基对(bp)的dsrna是生物活性所需的；参见bolognesi等(2012)plos one 7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534。因此，在一个实施方案中，将对应于表1中的靶基因并被发现提供对昆虫侵染的控制的21-碱基对dsrna触发剂嵌入另外39个碱基对的中性序列中，从而形成约60个碱基对的多核苷酸。在另一个实施方案中，发现单个21-碱基对触发剂在嵌入中性序列的较大区段时是有效的，例如其中总多核苷酸长度为约60至约300个碱基对。在另一个实施方案中，将选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列的至少21个连续核苷酸的至少一个区段嵌入中性序列的较大区段中以提供有效的触发剂。在另一个实施方案中，将来自选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的多个序列的区段嵌入中性序列的较大区段中以提供有效的触发剂。
[0189]
预期本文公开的某些重组rna(例如，包含选自由seq id no：860-1718和1722-1724组成的组的序列的dsrna触发剂或这些触发剂的活性片段)与一个或更多的非多核苷酸杀虫剂的组合，当与用单独的重组rna或单独的非多核苷酸杀虫剂获得的作用相比，将导致昆虫侵染的预防或控制的的协同改善。常规昆虫生物测定，诸如本文中在工作实施例中所述的生物测定，可用于使用本文公开的多核苷酸与一种或多种非多核苷酸杀虫剂(例如，块茎素、植物凝集素、植物脱皮甾醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白，致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形赖氨酸杀虫蛋白)的组合来确定对幼虫死亡或生长抑制的剂量响应。本领域技术人员可在常规生物测定中测试多核苷酸与非多核苷酸杀虫剂的组合，以鉴定对于用于保护植物免受昆虫侵染是协同的和所需的生物活性物的组合。
[0190]
实施例5
[0191]
本实施例举例说明了测试dsrna触发剂在跳甲中的功效的方法的非限制性实施方案。更具体地，本实施例举例说明了包括向跳甲经口递送dsrna、导致跳甲的生长迟缓或死亡的方法。
[0192]
从前3个月没有施加农药的芥花籽田收集十字花菜跳甲。针对30只十字花菜跳甲的组测试了靶向菜跳甲属基因的三种dsrna(seq id no：1169、1193和1392)和靶向gfp的一个阴性对照dsrna。将dsrna重悬浮于水中，并以50纳克dsrna/毫克叶组织的区分剂量施加至6毫米叶盘(每片55
±
6毫克)，将其喂给5只跳甲的组。每隔一天更换具有新鲜施加的dsrna的叶盘，并在2周时间内记录存活个体的数目。在阴性对照昆虫组中观察到低的非特异性死亡率(30只昆虫中有3只在2周内死亡或10％的非特异性死亡)。观察到从第4天开始并持续至2周时间的死亡。对于所有dsrna处理观察到特异性死亡(表2)。校正非特异性死亡(减去每组3只昆虫的非特异性死亡率，对于校正的n＝27)，在2周时间结束时观察到的百分比死亡为85％(seq id no：1169)、0.70％(seq id no：1193)和0.63％(seq id no：1392)。
这些结果证明了当在跳甲的饮食中提供时，dsrna触发剂在引起跳甲的死亡中的功效。
[0193]
表2：死亡十字花菜跳甲的累积数量(n＝30)
[0194]
日阴性对照seq id no:1169seq id no:1193seq id no:139200000212114262262933821389103181615123231918143262220
[0195]
在以类似方式进行的第二系列实验中，对十字花菜跳甲以50纳克dsrna/毫克叶组织的区分剂量测试几种dsrna触发剂；还测试两个较低剂量(15纳克dsrna/毫克叶组织和2纳克dsrna/毫克叶组织)。在每个剂量下测试10只甲虫。使用的阴性对照(5个重复)是靶向编码β-葡糖醛酸糖苷酶的细菌基因uida(ncbi登录号nc_000913.3)的dsrna触发剂。每隔一天更换具有新鲜施加的dsrna的叶盘，并在12天的时间中记录死亡。在12天的观察期内阴性对照的总体死亡率为～4％(可能归因于处理受伤)。在暴露于dsrna的12天后观察到的累积死亡(n＝10)提供于表3中；阴性对照死亡值作为平均值给出(n＝5)。dsrna触发剂中的8种(由+++的死亡评级指示)在最高剂量下导致90-100％的死亡，并且在所测试的最低剂量下仍然高度有效(80％或更高的死亡)。一些dsrna触发剂(由++的死亡评级指示)在最高剂量下在一定比例的昆虫中诱导死亡，但在较低剂量(《20％的死亡)下不太有效。
[0196]
表3
[0197]
[0198]
id no：1186(靶向十字花菜跳甲copiα靶基因，seq id no：327)的序列的触发剂含有5条位于位置1-71、88-116、136-209、238-266和274-296处的至少21个连续核苷酸的序列，其全部与具有seq id no：882和888的序列的触发剂中的序列(靶向黑菜跳甲copiα靶基因，分别为seq id no：23和29)匹配；因此这5条序列可用于靶向两个菜跳甲属物种中的基因。
[0208]
表3
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
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[0226]
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[0229]
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[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240][0241]
本文公开和要求保护的所有材料和方法可按照上述公开内容的指示进行和使用，而无需过度的实验。尽管已经根据优选实施方案和说明性实施例描述了本文公开的材料和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下可对本文所述的材料和方法加以改变。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。