一种欧洲越橘愈伤组织再生体系的建立方法

1.本发明涉及植物繁殖技术领域，尤其涉及欧洲越橘的愈伤组织再生体系的建立方法。


背景技术：

2.欧洲越橘（拉丁学名：vacciniummyrtillus），又名钟莓（billberry），是杜鹃花科（ericaceae）越橘属（vaccinium）植物，是一种原产北欧的低矮灌木，它含有30多种花青素，是含有最多花青素种类的越橘品种，也是花青素最丰富的天然来源之一，含量高达37.47%，具有很高的经济价值，药用价值等，被美国草本产品协会列为1类草本植物
［1,2］
，是如今市面上价格最高的越橘，也是现今唯一可入药的越橘品种，最常用于治疗眼部疾病
［3］
。现代医学研究表明欧洲越橘果实具有降低血糖、抗炎和降脂的作用，能够促进抗氧化防御和降低氧化应激反应，因此在治疗或预防糖尿病、癌症、心血管疾病和增强记忆力方面具有重要作用
［4-5］
。欧洲越橘常生长在荒地、草地和潮湿的针叶林中。虽说欧洲越橘有很高的价值，但是人工扩繁困难，扦插很难成活，现在只有芬兰一实验室实现了土壤栽培分蘖扩繁，效率较低。
3.越橘属中，无性系繁殖与再生技术最成熟的是蓝莓。蓝莓与欧洲越橘的果实形状很像，属于越橘属下的蓝莓亚属，包括兔眼蓝莓、高丛蓝莓、半高丛蓝莓、矮丛蓝莓四大类。蓝莓的商品化程度和种植推广程度最高，现有越橘属植物愈伤组织再生方法都是以蓝莓为材料开发的。蓝莓无性繁殖技术大大促进了我国对于蓝莓引种后的推广种植和品种改良。2011年朱延明等以矮丛蓝莓美登为材料建立了茎段的再生体系
［6］
；2012年debnath和barney等提出用较低浓度玉米素（zt）建立了cascadehuckleberry,mountainhuckleberry和oval-leafblueberry三个蓝莓品种的不定芽再生体系
［7］
。使用该体系，蓝莓再生周期比较长，有5-6个月，不太利于苗木快繁；2013年李际红等研究了一氧化氮供体硝普纳(sodiumnitroprusside,snp)对三个蓝莓品种再生的影响
［8］
；2018年amritaghosh等在组织培养中建立了四种半高蓝莓体细胞胚胎发生的有效方法
［9］
。尽管越橘属蓝莓的多个品种都有再生体系的建立，但是经济价值最高的欧洲越橘的再生体系，一直未见报道。
4.欧洲越橘有较高的经济价值和研究价值，但目前越橘属植物的愈伤组织再生体系并不适用于欧洲越橘。芬兰、挪威、新西兰等几个实验室试图开发欧洲越橘的再生体系，都以失败告终。欧洲越橘成为公认的较难建立再生体系的越橘种。虽然北欧多个实验室从野外筛选了一些优良株系，但由于扩繁效率低，没有再生体系，无法实现大规模的繁殖，大大延误了育种的进程。因此，亟需开发一套快速高效的愈伤组织再生体系，为欧洲越橘的良种快繁和科学研究提供参考。参考文献[1]uptonr,editor.bilberryfruitvacciniummyrtillusl.standardsofanalysis,qualitycontrol,andtherapeutics.santacruz,ca:american
herbalpharmacopoeiaandtherapeuticcompendium;2001.[2]chuwk,cheungscm,lauraw,benzieiff.bilberry(vacciniummyrtillusl.).in:benzieiff,wachtel-galors,editors.herbalmedicine:biomolecularandclinicalaspects.2nded.bocaraton(fl):crcpress/taylor&francis;2011.chapter4.[3]drugsandlactationdatabase(lactmed)[internet].bethesda(md):nationallibraryofmedicine(us);2006
–
.bilberry.2021may17.[4]zafra-stones,taharaty,bagchim,chatterjeea,vinsonj.a,bagchid.berryanthocyaninsasnovelantioxidantsinhumanhealthanddiseaseprevention.molnutrfoodres.2007;51:675
–
83.[5]erlundi,kolr,alfthang,etal.,editors.favourableeffectsofberryconsumptiononplateletfunction,bloodpressure,andhdlcholesterol.amjclinnutr.2008;87:323
–
31.[6]张彩玲,朱延明.矮丛蓝莓再生体系的建立[j].农业科技通讯,2011,(09):78-82.[7]debnathsc,barneydl.shootregenerationandplantletformationbycascadehuckleberry,mountainhuckleberry,andoval-leafbilberryonazeatin-containingnutrientmedium[j].horttechnology,2012.[8]李际红，邢世岩，李建华，姚培娟，王聪聪，张倩.外源no对蓝莓再生及生理生化效应的研究[j].山东农业大学学报,2013.[9]ghosha,igamberdievau,debnathsc.thidiazuron-inducedsomaticembryogenesisandchangesofantioxidantpropertiesintissueculturesofhalf-highblueberryplants[j].scirep,2018,8(1):16978.


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了欧洲越橘愈伤组织再生体系的建立方法，为欧洲越橘的无性繁殖提供技术支持。
[0006]
具体技术方案如下：本发明提供了一种欧洲越橘愈伤组织再生体系的建立方法，包括：（1）以在无菌培养基上生长良好的欧洲越橘苗的幼嫩茎段、叶片为外植体材料，之后将该幼嫩枝条切为合适大小，接种至诱导愈伤的培养基中培养，得到含有愈伤的外植体；所述诱导愈伤的培养基为：wpm+3%蔗糖+1%琼脂+0.50mg/liba+2.0mg/lzt,ph=5.2
±
0.02；（2）将长出愈伤的外植体移至新鲜的培养基中进行培养，培养基的配方如（1），诱导不定芽的产生，培养3-5d后愈伤组织出现芽状生长点，随后一周内出现明显可见的小芽；（3）将所述不定芽移至生根培养基中进行生根培养，生根培养基配方为：wpm+2%蔗糖+1%琼脂+0.3mg/liaa+1.0mg/lkt+0.5g/l活性炭,ph=5.2
±
0.02。炼苗后，移栽到草碳土中，得到欧洲越橘再生苗。
[0007]
本发明在实验初期，我们收集了已发表的蓝莓相关的组织再生方法，并在欧洲越橘上进行了尝试，发现已有的蓝莓再生体系并不适用于欧洲越橘，不能促使该越橘外植体长芽等。因此，我们从头摸索配方，并进行了多种配方的优化，发明了适用于欧洲越橘的愈伤组织高效再生体系，为欧洲越橘的良种扩繁提供了新途径。
[0008]
本发明中，“iba”是指吲哚丁酸；“zt”是指玉米素；“2-ip”是指2-异戊烯腺嘌呤；“6-ba”是指6-苄氨基腺嘌呤；“iaa”是指吲哚乙酸；“kt”是指激动素。
[0009]
外植体选择在无菌条件下生长良好的欧洲越橘苗的幼嫩茎、叶片。作为优选，步骤（1）中，诱导愈伤的培养条件为：每天28℃条件下光照培养16 h，培养6-9 d;利于提高愈伤组织的诱导率；作为优选，步骤（1）中，所述外植体材料处理方式为：幼嫩枝条切为0.8 cm左右的小段，叶片除去边缘部分切为0.5 cm左右的方形；利于提高愈伤组织的诱导率；作为优选，步骤（1）中，所述外植体接种方式为：叶片平铺在培养基表面，叶片正面朝下；茎段充分接触培养基；利于提高愈伤组织的诱导率；作为优选，步骤（2）中，不定芽诱导培养条件为：每天28℃条件下光照培养16 h，每14 d继代一次；利于提高不定芽的诱导率；作为优选，步骤（3）中，生根培养的条件为：每天25℃条件下光照培养16 h，光照强度为1000 lx；利于提高生根率。
[0010]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）使用本方法，欧洲越橘从愈伤组织诱导到土壤再生成活，整个周期仅为2-3个月，比现有的其他越橘属植物的用时要短；（2）本发明针对欧洲越橘将不定芽诱导培养，用同一种诱导培养基可以完成愈伤组织诱导和不定芽再生，简化了操作程序；（3）愈伤组织和不定芽的获得率都很高（95%
ꢀ‑ꢀ
100%）；（4）本发明中欧洲越橘的幼嫩枝条和叶片均可做为外植体，材料获得比较容易。
附图说明
[0011]
图1叶片或茎段长出的愈伤组织（柱=1mm）；图2继代培养后，愈伤组织中长出较明显的小芽（柱=1mm）；图3在不定芽诱导培养基中叶片或茎段的愈伤组织中不定芽长至1cm左右时的欧洲越橘（柱=1mm）；图4可取出至外界进行炼苗时不定根长2cm时的欧洲越橘（柱=1cm）；图5炼苗后获得的欧洲越橘再生苗。
具体实施方式
[0012]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
[0013]
实施例1一种欧洲越橘愈伤组织再生体系的建立方法，具体步骤如下：（1）以在无菌培养基上生长良好的欧洲越橘苗的幼嫩茎段、叶片为外植体材料（因
该材料为生长在无菌环境中的外植体材料，所以无须对其进行杀菌消毒），将该幼嫩枝条切为0.8 cm左右的小段，叶片除去边缘部分切为0.5 cm左右的方形，接种至诱导愈伤的培养基中培养，叶片平铺在培养基表面，正面朝下，茎段有节节处朝下，每天28℃条件下光照培养16 h, 6~9 d后，得到有愈伤的外植体（如图1所示）；所述诱导愈伤的培养基为：wpm + 3% 蔗糖 + 1% 琼脂+ 0.5 mg/l iba + 2.0 mg/l zt，ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02；（2）将长出愈伤的外植体移至新鲜的培养基中，配方如上（1）中所述，每天28℃条件下光照培养16 h，诱导不定芽的产生，培养5-8 d后愈伤组织出现芽状生长点，随后一周内出现明显可见的小芽（如图2所示），每14 d继代一次，共培养25 d左右，直至不定芽长到1 cm左右长度（如图3所示）；（3) 将长出的1 cm长的不定芽移至生根培养基中进行培养，每天25℃条件下光照培养16 h，光照强度为1000 lx，待根长度长至2 cm时（如图4所示），取出置于室外进行炼苗，得到欧洲越橘再生苗（如图5所示）；其中，生根培养基为：wpm + 2% 蔗糖+ 1% 琼脂+ 0.3 mg/l iaa + 1.0 mg/l kt + 0.5 g/l 活性炭, ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02。
[0014]
实验结果：整个再生体系的生长周期为2-3个月，其中愈伤组织的诱导率可达到100%，不定芽的诱导率可达到95%~100%，生根率可达50%。
[0015]
对比例1本对比例使用2, 4-d作为愈伤诱导时期的生长素，发现获得的愈伤组织无法分化成芽。
[0016]
具体步骤如下：本对比例除用2,4-d替换iba外，其余步骤或处理都与实施例1完全相同（1）以在无菌培养基上生长良好的欧洲越橘苗的幼嫩茎段、叶片为外植体材料（因该材料为生长在无菌环境中的外植体材料，所以无须对其进行杀菌消毒），将该幼嫩枝条切为0.8 cm左右的小段，叶片除去边缘部分切为0.5 cm左右的方形，接种至诱导愈伤的培养基中培养，叶片平铺在培养基表面，正面朝下，茎段充分接触培养基，每天28℃条件下光照培养16 h，6~9d后，得到愈伤组织；其中，愈伤组织诱导培养基为：wpm + 3% 蔗糖 + 1% 琼脂+ 0.5 mg/l 2，4-d + 1.0 mg/l zt，ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02;（2）将该含有愈伤组织的外植体移至不定芽诱导培养基中进行培养，每天28℃光照培养16 h，诱导不定芽;其中，不定芽诱导培养基为：wpm + 3% 蔗糖 + 1% 琼脂+ 0.5 mg/l iba + 1.0 mg/l zt + 0.6 mg/l kt，ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02。
[0017]
虽然愈伤组织的诱导率很高，愈伤组织生长初期较好，为乳白色，但是进行不定芽诱导时，愈伤组织整体变白但并无明显可见的芽点，并未诱导出不定芽。
[0018]
对比例2本对比例对比了4中不同的激素配方，发现这些配方的再生效率均不及实施例配方。
[0019]
具体内容如下：
本对比例除设置不同愈伤组织和不定芽的诱导培养基组分的处理外，其余步骤或处理都与实施例1完全相同；根据不同的培养基组分，设置了以下4种处理：处理1：wpm + 3% 蔗糖 + 1% 琼脂+ 0.5 mg/l naa + 1.0 mg/l zt，ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02;处理2：wpm + 3% 蔗糖 + 1% 琼脂+ 0.5 mg/l iba + 0.5 mg/l kt，ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02;处理3：wpm + 3% 蔗糖 + 1% 琼脂+ 0.7 mg/l iba + 2.0 mg/l 2-ip，ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02;处理4：wpm + 3% 蔗糖 + 1% 琼脂+ 0.7 mg/l iba + 0.8 mg/l 6-ba，ph = 5.2
ꢀ±ꢀ
0.02;结果表明，处理1和处理4的愈伤组织诱导率为100%，处理2的愈伤组织诱导率为53.85%，处理3的愈伤组织诱导率为78.6%。 处理1、处理3和处理4它们的愈伤组织生长良好，不定芽的诱导阶段只有少量不定芽的产生，诱导率低于50%，其中处理1和处理4在不定芽诱导的阶段带有不定芽的愈伤组织容易出现发红、褐化的现象。处理2的愈伤组织较易出现褐化。在进行不定芽的诱导时，褐化现象也没有得到缓解，这导致不定芽的诱导率大大降低，低于10%，并且在培养了一段时间后，分化获得的不定芽也无法正常生长。