一种小鼠2型糖尿病模型的构建及评价方法

一种小鼠2型糖尿病模型的构建及评价方法
【技术领域】
1.本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及小鼠2型糖尿病模型的建立及采用离体组织灌流实验评价该模型的方法。


背景技术：

2.2型糖尿病是慢性疾病，患者进食量、进水量和血糖升高，最明显的临床特征是胰岛素抵抗伴一定程度的β细胞衰竭，最常见的是具有肥胖特征。胰岛素抵抗特征也是2型糖尿病与1型糖尿病最大的区别之处。缺乏良好的胰岛素抵抗模型是研究2型糖尿病的一大难点。大量文献报道了构建大鼠2型糖尿病的造模方式，但对于小鼠的报道却并不多，也无确定统一的造模方案。有研究报道大鼠对链脲佐菌素的敏感性是小鼠的3-4倍，高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(30mg/kg体重)，wistar大鼠出现胰岛素抵抗特征，但给予小鼠相似剂量的链脲佐菌素(35mg/kg体重)造模会有部分小鼠自我恢复，在我们的实验中也发现低剂量的链脲佐菌素诱导建立的糖尿病小鼠模型在第4周后血糖确有下降。有文献报道对c57bl/6j小鼠单次腹腔注射100mg/kg体重链脲佐菌素时可以成功构建2型糖尿病模型；也有实验通过对11周龄雄性 c57bl/6ntac小鼠腹腔注射两种浓度的链脲佐菌素成功构建2型糖尿病小鼠模型：第1天50mg/kg体重，第2天25mg/kg体重。c57bl小鼠虽含致糖尿病基因，成模率较高，但成本也较高，且造模得到的糖尿病类型多偏向 t1dm。昆明小鼠与人类胰腺相似，成本低，易饲养，实验结果稳定可靠，具有可重复性。因此我们的研究以昆明小鼠作为胰岛素抵抗动物模型。为了缩短造模时间，优化胰岛素抵抗模型，避免内源性孕激素和雌激素的干扰，明确模型的适用范围，筛选最佳方案，我们对雌性昆明小鼠进行了去势手术，采用高脂饮食联合不同剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病模型。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种小鼠2型糖尿病模型的构建方法，并采用离体组织灌流的方法对模型进行评价，以确认模型是否构建成功，依照该造模方法得到的小鼠2型糖尿病模型有助于临床雌激素相关性疾病发病机制分析及预防和治疗。为了实现上述目的，采用以下技术方案予以实现：
4.小鼠2型糖尿病模型的造模方法，包括以下步骤：
5.(1)将体重为22g-26g的雌性昆明小鼠在室内温度22℃-25℃，相对湿度 65％～70％的饲养室饲养7天；
6.(2)禁食不禁水并去掉垫料12h后于术前测量小鼠体重与血糖，在无菌条件下，进行去势手术，该去势手术即为卵巢切除术；
7.(3)术后恢复一周后，高脂饮食饲养小鼠4周后，每日腹腔注射30mg/kg 体重链脲佐菌素，连续3天，第4天注射80mg/kg体重链脲佐菌素。
8.上述小鼠2型糖尿病模型的评价方法，包括以下步骤：
9.(1)构建对照组，对照组小鼠构建步骤为选取体重为22g-26g的雌性昆明小鼠在室
内温度22℃-25℃，相对湿度65％～70％的饲养室饲养7天，在无菌条件下，进行去势手术，去势手术恢复一周后高脂饮食饲养小鼠4周后，连续 4天腹腔注射与构建模型时注射的链脲佐菌素相同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；
10.(2)将构建的模型组与对照组继续高脂饮食喂养四周后，对两组小鼠进行离体心肌、腓肠肌和肝脏组织灌流实验判定胰岛素抵抗发生情况，若链脲佐菌素组小鼠离体心肌、腓肠肌和肝脏在胰岛素(终浓度为0.02u/ml)作用前和作用后，生理糖水平耗糖量显著低于对照组p《0.05，且在高糖水平时也显著低于对照组 p《0.05，则判定2型糖尿病胰岛素抵抗模型造模成功，否则判定造模失败。
11.本发明的有益效果是选择昆明小鼠进行去势，并采用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠2型糖尿病模型，构建成功率高；本发明公开的离体组织灌流实验验证方法，具有实验条件易于控制、实验周期短，避免了在体动物实验中复杂的药代动力学、药物的转运途径等因素的影响等优点，与高胰岛素-正常血糖钳技术诊断胰岛素抵抗相比，成本低，可行性强，具有可重复性，为药物在糖尿病的预防、诊治和糖代谢研究中提供了理论依据。
【附图说明】
12.图1a-d为2型糖尿病模型小鼠离体灌流心肌的耗糖量；oh：去势+高脂饲料喂养；stz：去势+高脂饲料喂养+链脲佐菌素处理；与对照组相比：*p《0.05， **p《0.01，***p《0.001。
13.图2a-d为2型糖尿病模型小鼠离体灌流腓肠肌的耗糖量；oh：去势+高脂饲料喂养；stz：去势+高脂饲料喂养+链脲佐菌素处理；与对照组相比： **p《0.01，**p《0.001。
14.图3a-d为2型糖尿病模型小鼠离体灌流肝脏的耗糖量；oh：去势+高脂饲料喂养；stz：去势+高脂饲料喂养+链脲佐菌素处理；与对照组相比：*p《0.05， ***p《0.001。
【具体实施方式】
15.实施例1小鼠2型糖尿病模型的构建：
16.购置成年未孕雌性昆明小鼠(22g-26g)，该小鼠由兰州大学动物实验中心提供，于室温22℃-25℃，相对湿度65％～70％的饲养室饲养7天；禁食并去掉垫料12h后于术前测量小鼠体重与血糖，在无菌条件下，进行去势手术。所有手术器械经过高压灭菌后，0.3％戊巴比妥钠麻醉小鼠并进行消毒备皮，沿腹中线切开皮肤和肌肉层，切除两侧卵巢，结扎输卵管，缝合腹正中切口，用碘伏消毒处理切口。恢复一周后，高脂(高脂饲料配制：标准饲料∶蛋黄粉∶猪油∶蔗糖∶胆固醇∶维生素为70∶10∶10∶8∶1∶1的配比制备，放置在烘箱中烘干)饮食四周后，连续3天每天腹腔注射30mg/kg体重链脲佐菌素(sigma公司产品，临用前溶解在0.1mmol/l高压灭菌的柠檬酸缓冲液中，采用ph精密酸度仪将缓冲液ph值调至4.5)，第4天注射80mg/kg体重链脲佐菌素，成功构建获得小鼠2型糖尿病模型。
17.实施例2 2型糖尿病模型的评价方法试剂及溶液配制：
18.(1)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mmol/l)：临用前称取2.1014g柠檬酸，加入无菌双蒸水定容到100ml，配置成a液；称取2.9412g柠檬酸钠，加入无菌双蒸水定容到100ml，配置成b液；v(a)与v(b)比例为1:1.32混合。
19.(2)kreb’s-henselei(k-h)液成分：118mmol/l氯化钠(nacl)，4.7mmol/l 氯化钾(kcl)，1.1mmol/l硫酸镁(mgso4
·
7h2o)，2.5mmol/l氯化钙(cacl2)， 1.2mmol/l磷酸二氢钾(kh2po4)，24.9mmol/l碳酸氢钠(nahco3)，0.057 mmol/l抗坏血酸(c6h8o6)，0.027mmol/l乙二胺四乙酸二钠盐(edta)， 6.5mmol/l葡萄糖(c6h12o6
·
h2o)，15.0mmol/l葡萄糖(c6h12o6
·
h2o)，用0.1mol/lnaoh或hcl调ph至7.4。
20.(3)k-h液配制：称取68.9592g nacl、3.50385g kcl、2.95776g mgso4·
7h2o和 1.63308g kh2po4，另取蒸馏水定容至1l，配制成1l 10倍浓缩液体。每次实验取 100ml后加入2.091849g nahco3、0.277475g cacl2，2.199687gc6h
12
o6·
h2o、0.01003941g抗坏血酸、0.01005048g edta定容到1l充分溶解，即为新鲜 kreb’s液。药物须严格按照以上顺序加入，氯化钙在其他药物成分充分溶解稀释后加入，以免反应发生沉淀，葡萄糖临用时加入，以免滋生细菌使缓冲液变质。
21.构建对照组：对照组小鼠构建步骤为选取体重为22g-26g的雌性昆明小鼠在室内温度22℃-25℃，相对湿度65％～70％的饲养室饲养7天，在无菌条件下，进行去势手术，去势手术恢复一周后高脂饮食饲养小鼠4周后，连续4天腹腔注射与实施例1所述链脲佐菌素相同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
22.将按照实施例1所述的方法构建的模型组与对照组继续高脂饮食喂养四周，四周后对两组小鼠进行离体心肌、腓肠肌和肝脏组织灌流实验判定胰岛素抵抗发生情况，若链脲佐菌素组小鼠离体心肌、腓肠肌和肝脏在生理糖水平耗糖量显著低于对照组且在高糖水平时也显著低于对照组p《0.05，则判定2型糖尿病模型造模成功，否则判定造模失败。
23.离体心肌灌流实验：离体心肌灌流实验开始前30min打开恒温水浴泵和混合气罐(含95％o2和5％co2)，设定水温为37℃，打开灌流装置循环系统，调解气泡至细小而均匀。临用前配制k-h液，分两部分，部分注入肌槽 (通气)，部分置于培养皿(通气)。小鼠处死后，迅速打开胸腔，使用小镊子小心取出心脏，确保其完整无损伤，立即浸入通有混合气体并盛有k-h液的小烧杯中，注射针头插入主动脉缓缓注入缓冲液排除心脏内血液后转入准备好的培养皿中，眼科剪从心尖沿室间至主动脉剪开左心室，随后沿瓣膜剪开右心室，暴露心室，两端缚线，一端固定于双极电极间，另一端连接到张力传感器，垂直悬挂于张力传感器与线连接处，以1hz、1ms和阈值(15
±
5v)的电刺激刺激心肌，温育20min待心肌收缩活动稳定后，加入胰岛素(终浓度为0.02u/ml)(购自诺和锐公司)，测定加入胰岛素前后0min，30min，60min， 90min肌槽中糖浓度，记录不同处理组小鼠离体心肌在胰岛素处理前后的耗糖量。结果显示，胰岛素处理前后，链脲佐菌素组小鼠离体心肌在生理糖水平和高糖水平时的耗糖量均低于高脂饮食对照组，且具有显著性差异(p《0.05)。离体腓肠肌灌流实验：处死小鼠，取小鼠左腿置于供有混合气体并含有k-h溶液(同实施例4中k-h液的配置)的培养皿中，剪断结缔组织与神经分支，分离出腓肠肌用锌铜弓检查腓肠肌的兴奋性，一端缚线结扎与双极电极连接，另一端缚线结扎肌腱并连接至张力传感器，以1hz、1ms和阈值(15
±
5v) 的电刺激刺激腓肠肌，温育20min，采用bl-420s生物信号采集系统记录腓肠肌收缩活动，加入胰岛素(终浓度为0.02u/ml)，测定加入胰岛素前后0min， 30min，60min，90min肌槽中糖浓度，记录不同处理组小鼠离体腓肠肌在生理糖水平和高糖水平时胰岛素处理前后的耗糖量。结果显示，胰岛素处理前后，链脲佐菌素组小鼠离体腓肠肌在生理糖水平和高糖水平时的耗糖量均低于高脂饮食对照组，且具有显著性差异(p《0.01)。
24.离体肝脏灌流实验：处死小鼠，横向剖开小鼠腹部，通过正向灌流，使灌流液进入肝门静脉，从肝下腔静脉输出，以排除肝脏内血液，取肝尾叶置于含混合气体与k-h液(同实施例4中k-h液的配置)的培养皿中，维持离体肝正常的生理生化功能，缚线置于灌流肌槽内，温育20min后换液，在加入胰岛素
25.(终浓度为0.02u/ml)前后0min，30min，60min，90min测灌流肌槽中血糖消耗情况，记录不同处理组小鼠离体肝脏在胰岛素处理前后的耗糖量。结果显示，胰岛素处理前后，链脲佐菌素组小鼠离体肝脏在生理糖水平和高糖水平时的耗糖量均低于高脂饮食对照组，且具有显著性差异(p《0.05)。
26.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。