一种保存液及其应用

1.本发明涉及生物学技术领域，特别涉及一种在没有血液供应的情况下使细胞保持存活、减少体外保存损伤、促进组织器官恢复功能的保存液，以及该保存液的应用。


背景技术：

2.早在20世纪，就有第一例器官移植手术。器官移植是将某个健康的器官通过手术或其它方法放置到一个患有严重疾病、危在旦夕的病人身体上，让这个器官继续发挥功能，从而使器官受捐者获得新生。对于已切除出来的健康器官，需要用保存液进行灌注并浸渍，从而预防器官坏死，防止缺血再灌注损伤的发生。所谓缺血再灌注，是指对处于缺血状态的器官、组织进行备注再灌注时，在该器官、组织内的微小循环中导致各种毒性物质产生从而引起损伤。这种损伤可能是自由基的作用，如氧自由基ros的产生导致了损伤。
3.现有的保存液，虽然可以帮助器官在低温保存时防止细胞肿胀、减少ros生成，并具备一定的减少缺血性损伤、促进器官恢复的作用，但在减少缺血再灌注损伤方面，仍然未能达到令人满意的效果，从而限制了器官在体外保持的安全时间并有可能增加移植手术期间器官损伤的风险。


技术实现要素：

4.为了解决上述现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种保存液，该保存液能够在没有血液供应的情况下使细胞保持存活，该保存液用于保存细胞、组织和器官，可减轻人的肝样细胞在体外冷保存-复温过程的损伤，有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，降低丝粒线膜电位、线粒体ros，应用于临床器官移植保存，可减轻缺血再灌注损伤、降低移植手术期间器官操作的风险。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种保存液，其包含5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素中的一种或两种以上混合。
7.冬眠模式动物具有抵抗缺血再灌注损伤和低温-复温损伤的非凡生理特点，在自然冬眠期间，当核心温度急剧下降时，面对剧烈和快速的生理变化，不会出现任何器官损伤。在冬眠季节之外，冬眠动物也能够承受医源性损伤，如缺血再灌注损伤和能量剥夺，而缺血再灌注损伤会导致器官衰竭，如器官移植和心肌梗死。因此，发明人以冬眠动物为自然模型，创新地运行冬眠动物肝细胞探索冬眠动物冷适应及复温过程中分子机制及其代谢调控机制，发现5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素在冬眠物种冷适应期间升高，复温期间下降，而人的肝细细胞在冷适应期和复温期间以上物质无显著差异。发明人经过研究发现，保存液中如果添加了5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素这四种物质中的任一种，对人的肝样细胞进行冷保存，细胞存活率高，能够有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，降低线粒体膜电位和线粒线ros，有效减少冷保存-复温引起的线粒体损伤，从而减少缺血再灌注损伤。
8.可选地，所述保存液中5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸或者d-生物素的浓度为200um～1mm。
9.可选地，所述保存液中5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸或者d-生物素的浓度为1mm。
10.可选地，所述保存液为uw液添加5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素中的一种或两种以上。
11.一种实施方式，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、5-氨基酮戊酸1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
12.一种实施方式，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、左旋肌肽1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
13.一种实施方式，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、l-谷氨酸1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
14.一种实施方式，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、d-生物素1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
15.本发明还公开了所述保存液的应用，所述保存液用于保存离体的细胞、组织和/或器官。
16.一种实施方式，所述保存液用于在低温条件下保存离体的细胞、组织和/或器官，所述低温条件为2-8℃。
17.与现有技术相比较，本发明的有益效果是：
18.本发明人采用创新的探索机制，发现了5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素在冬眠动物和非冬眠动物的冷保存-复温期间的显著差异，基于此在保存液中添加了5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素这些物质，对细胞、组织和/或器官进行冷保存，细胞存活率高，能够有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，稳定线粒体膜电位和减少线粒体ros生成，有效减少冷保存-复温引起的线粒体损伤，从而减少缺血再灌注损伤，对于器官移植保存技术的进步有极大的意义。
附图说明
19.图1是本发明不同浓度5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素添加至冷保存培养液，细胞经过24小时4摄氏度保存后恢复到37摄氏度维持2小时的细胞存活率图；
20.图2为本发明对照组培养基和添加了5-氨基酮戊酸的实验组培养基在冷冻-复温过程中细胞凋亡变化图；
21.图3为本发明对照组培养基和添加了5-氨基酮戊酸的实验组培养基在冷冻-复温过程中线粒体膜电位图；
22.图4为本发明对照组培养基和添加了5-氨基酮戊酸的实验组培养基在冷冻-复温过程中线粒体ros变化图；
23.图5为本发明大鼠肝脏冷保存-复温过程的组织形态和酶学指标变化图；
24.图6为本发明大鼠肝脏冷保存-复温过程凋亡细胞变化图。
具体实施方式
25.下面通过具体实施例子和附图对本发明做进一步详细说明。
26.一种保存液，其包含5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素中的一种或两种以上混合。所述保存液是在uw液中添加了5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素中的任一种或者两种以上。所述保存液用于对细胞、组织和/或器官进行冷保存，细胞存活率高，能够有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，稳定线粒体膜电位和减少线粒体ros生成，有效减少冷保存-复温引起的线粒体损伤，从而减少缺血再灌注损伤。所述冷保存的温度为2-8℃。
27.一种可选的实施方式，所述保存液中5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸或者d-生物素的浓度为200um～1mm。
28.一种可选的实施方式，所述保存液中5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸或者d-生物素的浓度为1mm。
29.实施例1
30.一种保存液，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、5-氨基酮戊酸1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
31.实施例2
32.一种保存液，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、左旋肌肽1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
33.实施例3
34.一种保存液，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、l-谷氨酸1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
35.实施例4
36.一种保存液，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、d-生物素1mm，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
37.实施例5
38.一种保存液，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、5-氨基酮戊酸200um，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
39.实施例6
40.一种保存液，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、l-谷氨酸200um，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
41.实施例7
42.一种保存液，所述保存液包含羟乙基淀粉50g/l、乳糖醛酸35.83g/l、磷酸二氢钾3.4g/l、七水硫酸镁1.23g/l、棉籽糖17.83g/l、腺甘1.34g/l、别嘌呤醇0.136g/l、谷胱苷肽0.922g/l、氢氧化钾5.61g/l、d-生物素40um，用氢氧化钠和盐酸调至ph7.4。
43.发明人经研究发现，5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素能够提高体外细胞存活率，有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，稳定线粒体膜电位和减少线粒体ros生成。
44.以人肝样细胞冷保存-复温后细胞存活率为判断标准，采用营养培养基冷保存人肝样细胞为对照组，采用添加不同浓度的5-氨基酮戊酸(200um、1mm、5mm、25mm)、左旋肌肽(10um、100um、1mm)、l-谷氨酸(200um、1mm、5mm、25mm)、d-生物素(5um、40um、200um、1mm)的营养培养基为实验组，24h、4℃的保存条件后，比较细胞存活率。结果如图1所示，由图1可知，添加了5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素的实验组均可提高细胞存活率，添加了200um-1mm 5-氨基酮戊酸、1mm左旋肌肽、200um-1mm l-谷氨酸或40um-1mm的d-生物素实验组效果最好，细胞存活率最高。与此同时，以5-氨基酮戊酸(5-ala)为例，5-ala能够有效减少冷保存复温引起的细胞凋亡(如图2所示)，稳定线粒体膜电位和减少线粒体ros生成(如图3，4)。
45.在实验中，所述营养培养基为：hibernate
tm-a培养基(货号gibco a1247501),10ug/ml转铁蛋白,3ng/ml人表皮生长因子，25.5ug/ml维生素c，10ug/ml胰岛素，10um氢化可的松，10mg/ml牛血清白蛋白。
46.为了充分验证5-ala在冷保存中能有效减少冷保存复温引起的线粒体损伤。在此基础上，发明人将其应用在大鼠肝脏冷保存(如图5a所示)。在冷保存48小时复温灌注2小时的大鼠肝脏组织切片he染色显示，相比于uw液组(uw液是临床用的器官保存液)，uw液+5-ala组的肝组织形态明显改善(如图5b所示)。如图5c所示，uw液+5-ala组在灌注2小时期间灌注液的ast，alt和ldh酶学指标比uw液组显著降低。图6显示了uw液+5-ala组的肝组织中凋亡细胞减少。
47.综上，本发明人采用了创新的研究方法，以冬眠动物十三条纹地松鼠的诱导性多能干细胞(tlgs ipsc)为模型，利用tlgs ipsc分化的肝样细胞，与类似的人胚胎干细胞(hesc)分化的肝样细胞进行比较，发现tlgs ipsc分化的肝样细胞在冷保存-复温后表现出更高的存活率，而hesc分化的肝样细胞低温-复温过程中线粒体出现膜电位超极化应激反应，导致大量的活性氧自由基(reactive oxygen species；ros)生成。利用代谢组学对比冬眠动物和非冬眠物种在冷保存-复温期间的代谢产物，找出差异性代谢产物，发现5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素可减少线粒体ros的生成，减轻人的肝样细胞在体外冷保存-复温过程的损伤。并将以上代谢产物加入保存液中，验证了添加5-氨基酮戊酸、左旋肌肽、l-谷氨酸、d-生物素的uw液能够提高体外细胞存活率，有效减少冷保存-复温引起的细胞凋亡，稳定线粒体膜电位和减少线粒体ros生成。将该保存液应用于体外细胞、组织和/或器官保存，可减少缺血再灌注损伤，促进器官移植技术的发展应用。
48.对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。