一种具有白色果皮的黄瓜及其利用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种白色果皮黄瓜突变体em41，以及突变体的突变基因鉴定。


背景技术：

2.黄瓜（cucumis sativus l.）是我国乃至世界范围内广泛种植的重要蔬菜作物之一。随着消费水平的提高，人们对黄瓜品质的重视程度与日俱增。果皮颜色是黄瓜的重要外观性状，能够影响消费者的购买选择进而影响黄瓜价格，是黄瓜的重要商品性状。
3.通常情况下黄瓜果皮颜色分为深绿、绿、浅绿、黄绿、白等类型（xie和wehner，2001）。不同区域对黄瓜果皮颜色的喜好不同。白色果皮黄瓜是华东、华南、西北等某些区域的地方主栽品种。随着经济发展和消费理念转变，白色果皮黄瓜作为高端精品黄瓜深受消费者喜爱，其种植区域和面积逐年增加。培育综合性状优良的白色果皮黄瓜品种满足市场需求是黄瓜育种重要方向。先后有多个研究团队报道黄瓜白色果皮性状遗传规律、基因定位及克隆工作。白色果皮相对于绿色果皮为隐性性状。对多份白色果皮黄瓜材料研究表明，w的变异引起白色果皮。综上，已知的黄瓜白色果皮育种可用位点单一，严重限制了白色果皮黄瓜品种培育效率。
4.本发明在以绿色果皮黄瓜构建的ems突变体库中筛选到稳定遗传的白色果皮黄瓜突变体材料，研究表明其调控基因与已报道的白色果皮w基因不同，白色果皮突变体的csa2g365130结构异常导致白色果皮性状。本发明对白色果皮黄瓜培育及黄瓜果皮颜色形成机制研究具有重要价值。本发明具有重要的理论和应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种经ems突变的白色果皮黄瓜突变体和黄瓜白色果皮性状的相关基因。筛选经ems诱变绿色果皮黄瓜材料emw建立的突变体库，获得稳定遗传的白色果皮黄瓜突变体em41。研究em41的生理生化特性，构建遗传群体明确其遗传规律，em41与远缘绿色果皮黄瓜材料h12杂交后自交产生的f2群体，利用混池测序、生物信息学分析、kasp标记筛选及连锁分析，精细定位白色果皮突变体的基因区间，为黄瓜优良品种的选育奠定基础。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种白色果皮黄瓜突变体，白色果皮黄瓜突变体的定位基因为黄瓜基因组9930第二条染色体17623404
‑
17628402碱基位置处基因csa2g365130，与野生型emw黄瓜的该基因相比，其第1950位的碱基t突变为a。
7.进一步地，突变体较野生型表现为白色果皮，并且叶片、茎、叶柄、雌花和卷须也表现为白化性状，同时突变体的节间长度缩短，表现出矮化的表型。
8.进一步地，白色果皮黄瓜的性状符合单隐性核基因控制的遗传规律。
9.一种白色果皮黄瓜突变体的获得方法，用ems人工诱导处理野生型黄瓜种子，诱变
后单株严格自交获得稳定遗传的白色黄瓜突变体，命名为em41。
10.一种白色果皮黄瓜，包括1）具有白色果皮单隐性核基因的黄瓜突变体em41；或2）以突变体em41衍生的具有白色果皮性状的单隐性核基因的黄瓜植物。
11.进一步地，所述衍生为通过常规育种、生物技术育种、无性繁殖或其组合；所述常规育种包括自交、杂交、回交或其组合；所述生物技术育种包括转基因育种、单双倍体育种、分子标记育种或其组合。
12.一种野生型黄瓜emw和白皮突变体黄瓜em41的叶绿素含量的生理鉴定方法，用95%乙醇研磨提取或浸泡提取，叶绿色素在提取溶液中对665、649、470 nm波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。
13.所述的白色果皮黄瓜突变体在新品种选育中的应用。
14.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明的优点在于利用ems突变的白色果皮黄瓜突变体em41为亲本材料，与远缘材料h12杂交后自交产生的f2群体进行研究，并定位出影响黄瓜白色果皮性状基因csarc6，具体可表现为白色黄瓜果皮叶绿素含量降低。本研究获得了白色黄瓜果实突变体em41并定位了其突变基因，同时研究了白皮黄瓜生理生化特性。本发明将有助于深入补充并丰富“瓜类果皮颜色的形成机理”，为新品种选育提供新思路。
附图说明
15.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为黄瓜白色果皮突变体与野生型各部位表型比对图，其中a：野生型黄瓜（上）和突变型（下）与开花当天雄花、开花当天雌花、开花后3、6、9天果实、9天果实纵切的比较；野生型黄瓜（左）和突变型（右）节间形态；b：野生型黄瓜（上）和突变型（下）叶片和叶柄颜色的比较；图2为黄瓜白色果皮突变体与野生型叶绿素含量分析图；图3为黄瓜csarc6基因定位图，其中a：bsa混池测序snp多态性分析；b：kasp标记筛选及定位分析（m1到m9为kasp标记位点）；c：目标区域中的候选基因突变位点；图4为野生型emw与突变体em41基因组突变位点序列分析图，其中，所列野生型emw与突变体em41基因组序列在黄瓜基因组chinese long v2中为负向基因，编码序列与其反向互补。
具体实施方式
16.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
17.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所
描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
18.实施例1：黄瓜白色果皮突变体em41的获得和遗传分析用ems人工诱导处理绿色果皮黄瓜材料emw的种子，诱变后单株严格自交获得稳定遗传的白色果皮黄瓜突变体，命名为em41。突变体较野生型表现为白色果皮，并且叶片、茎、叶柄、雌花和卷须也表现为明显的白化性状，同时突变体的节间长度缩短，表现出矮化表型。以em41及与其亲缘关系较远的绿色果皮材料h12为双亲构建6世代遗传群体，研究白色果皮性状的遗传规律。遗传分析结果表明，白色果皮性状相对于绿色果皮单核基因隐性遗传（见表1）。
19.表1 绿色果皮材料“h12”与白色果皮材料“em41”组合后代群体果皮颜色分离植株比例群体总数绿色果皮白色果皮期望比p1（h12）2828
‑‑
p2（em41）26
‑
26
‑
f12828
‑‑
f210682243:1bc1p1（f1×
h12）6060
‑‑
bc1p2（f1×
em41）8344391:1实施例2：白色果皮突变体em41的基因定位1. dna的全基因组重测序及混池测序分别提取em41和h12亲本样品基因组dna用于测序，同时在f2群体中选取与两亲本性状相同的单株各20株，分别等比例混合20个单株提取的基因组dna，制成用于测序的dna。用大约500 bp插入片段的双端测序（读取长度为100 bp）方法，并用illumina genome analyzer iix机器进行测序。
20.2.短读序列与参考序列的比对和snp提取使用bwa软件，将来自突变型和野生型的短读段与9930参考基因组进行比对。使用samtools将比对后的文件转换为sam / bam文件。排除了所有序列中碱基质量值< 20和读取深度<2
×
或覆盖率< 30
×
的低质量snp，因为这些snp可能由于基因组重复序列，测序或比对错误而出现假阳性。
21.计算两个参数snp指数和
∆
（snp指数）以确定白果qtl的候选区域。snp指数是测序序列与参考序列不同的snp比例。通过从野生型减去突变体的snp指数获得
∆
（snp指数）。因此，如果整个短读包含9930的基因组片段，则snp
‑
index = 0。如果所有短读均来自em41，则snp
‑
index = 1。为了计算
∆
（snp指数），我们仅使用两个池dna中检测到的snp。
[0022] 3.滑动窗口分析使用我们开发的r脚本，以1 mb窗口大小，10 kb滑动步长应用滑动窗口分析。在此滑动窗口分析中，计算平均snp指数。对于每个读取深度，获得了95％的置信区间
∆
（snp指数）。
[0023]
4. 使用kasp标记进行snp分析通过kasp标记（引物序列见表2）进一步缩小白色果皮snp的定位区间。黄瓜2号染
色体上预测区域中的kasp标记被用于两个亲本之间以及两个子代池之间的多态性筛选。将kasp标记应用于f2群体单株。用不同的荧光标记不同的引物（两种引物末端有1个snp变异)，pcr延伸后发出不同的荧光，根据荧光值判断基因型。使用joinmap 4.0进行连锁分析。将白色果皮候选基因定位至分子标记m7与m8之间的540kb区域内。
[0024]
5.白色果皮候选基因确定在这540kb区间内只存在一个之前用emw与em41筛选snps获得的非同义突变的突变位点，即2号染色体上17625353位置处，该位置处于csa2g365130基因的第6个外显子中，其第 724 位氨基酸从酪氨酸（tat）突变为终止密码子（taa）并导致翻译提前终止。因此csa2g365130为我们确定的候选基因。
[0025]
实施例3：黄瓜白色果皮突变体em41与野生型emw叶绿素含量测定1.实验器材电子秤、电子顶载天平（感量0.01g）、50ml离心管、分液器、酶标板、分光光度计。
[0026]
2. 实验药品材料95%乙醇。
[0027]
3. 试验对照蒸馏水比色。
[0028]
4. 实验步骤4.1使用瓶口移液器在50ml离心管中打入25ml 95%乙醇。
[0029]
4.2称取新鲜黄瓜叶片、叶柄、茎、子房、外果皮各0.2g，中果皮5g，胎座5g，及时放入离心管中，放入黑暗环境，期间晃动数次。待组织完全褪色后比色。
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过滤或离心后比色。
[0030]
5. 实验计算已知叶绿素a、叶绿素b在95%乙醇溶液中红外区的最大吸收峰分别位于665、649nm处，类胡萝卜素为470nm。
[0031]
色素浓度计算（以某一个叶片数据为例）：将ca+cb相加即得叶绿素总浓度ca+b
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ca+b (mg/l)＝ca+cb = 7.23黄瓜果实中的叶绿素含量可由下列公式计算：叶绿素a(mg/g)=chla*v/w = 4.8*0.025/0.2 = 0.60叶绿素b(mg/g)=chlb*v/w = 2.43*0.025/0.2 = 0.30叶绿素总量(mg/g)=ca+b*v/w = 7.23*0.025/0.2 = 0.90类胡萝卜素(mg/g)=car*v/w = 0.93*0.025/0.2 = 0.12式中，v为提取液体积，取定量为0.025l；w为样品鲜重（g）。
[0032]
6. 结果分析三次重复数据求出均值，并计算标准误差作为误差线（以某一叶片叶绿素b含量 (mg/g)三次重复数据为例）。
[0033]
显著性差异分析用t检验结果（小于0.05为显著*，小于0.01为极显著**）（以叶片中野生型与突变体叶绿素b数据为例）。
[0034]
μ为野生型和突变体的总体均值；σ
x
为野生型或者突变体的样本标准差；n为样本容量。
[0035]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。