一种兔精液冷冻保存稀释液和制备方法、兔精液冷冻保存方法和应用

1.本发明属于家畜人工授精技术领域，具体涉及一种兔精液冷冻保存稀释液和制备方法、兔精液冷冻保存方法和应用。


背景技术：

2.家兔属于多胎动物，鲜精基本可以满足日常的人工授精需要。但是针对种公兔长距离运输，冷冻精液可以避免活体动物引种时需要进行检疫、隔离和种畜的饲养等问题。而且针对濒危品系和转基因品系进行精子冷冻要比胚胎保种更方便、更简单易行。同时用精液冷冻保存技术可以长时间保存优良品种种公兔的精液，达到有效缓解种质资源“卡脖子”带来的问题。公兔“夏季不育”的现象时有发生，精液的冷冻保存可以解决并且避免因其它原因造成公兔暂时精液质量不佳的问题，使得公母兔饲养比例降低，减少公兔饲养量，同时降低养殖场饲养成本，提高经济效益。
3.目前，猪、马、牛、羊等精液的冷冻稀释保存液研究较多，产品已完全商品化，但兔精液冷冻保存研究较少。目前市场上兔精液的冷冻保存稀释液的商品化产品几乎没有，且质量参次不齐，精子复苏后活力不高，很难有效开展人工授精生产繁殖工作。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种兔精液冷冻保存稀释液和制备方法、兔精液冷冻保存方法和应用。本发明提供的兔精液冷冻保存稀释液大大提高了冷冻后精子的活率，质膜完整率和顶体完整率，且质量稳定，有利于提高兔的繁殖效率和育种速度。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种兔精液冷冻保存稀释液，所述兔精液冷冻保存稀释液以水作为溶剂，所述兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加：三羟甲基氨基甲烷3～4g、柠檬酸1～2g、葡萄糖0.5～1g、海藻糖2～3g、l-谷氨酸0.5～1g、二甲基亚砜10～20ml和甘油2～4ml；所述兔精液冷冻保存稀释液的ph值为6.5～7.5。
7.优选的，所述兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加：三羟甲基氨基甲烷3.03g、柠檬酸1.69g、葡萄糖0.85g、海藻糖2.05g、l-谷氨酸0.74g、二甲基亚砜16ml和甘油3ml；所述兔精液冷冻保存稀释液的ph值为7.3。
8.本发明提供了上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存稀释液的制备方法，包括以下步骤：将三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、海藻糖、l-谷氨酸、二甲基亚砜、甘油和水混合后制得。
9.本发明提供了上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存稀释液或上述技术方案中所述的制备方法制备得到的兔精液冷冻保存稀释液的兔精液冷冻保存方法，包括如下步骤：将兔精液进行冷藏，得到冷藏后的兔精液；将所述冷藏后的兔精液与所述兔精液冷冻保存稀释液进行等温混合，得到混合液；将所述混合液进行平衡、液氮熏蒸后冷冻保存。
10.优选的，冷藏前，所述兔精液是去除了凝胶成分后的兔精液；所述兔精液的活率在0.8以上。
11.优选的，所述兔精液冷藏的温度为2～8℃，所述冷藏的时间为60～120min。
12.优选的，所述兔精液冷冻保存稀释液和冷藏后的兔精液的体积比≤5:1。
13.优选的，所述平衡的温度为2～8℃，所述平衡的时间为30～60min。
14.优选的，所述熏蒸为将平衡后得到的混合液在液氮液面上方的3～10cm进行熏蒸；所述熏蒸的时间为5～20min。
15.本发明提供了上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存稀释液或上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存方法在兔精液冷冻保存中的应用。
16.有益效果：
17.本发明提供了一种兔精液冷冻保存稀释液。本发明所述稀释液中，三羟甲基氨基甲烷和柠檬酸，可以防止精子细胞结构遭到破坏，对于精子酶反应以及中和其代谢酸性物质具有很好的缓冲作用；葡萄糖可以提供精子在体外生存所需的养分，并为精子补充能量；甘油具有在脱水条件下取代水的能力，能够增加膜的稳定性；另外，甘油具有增加粘度的作用，可以防止溶质共生结晶，促进细胞玻璃化形成，改变未冻溶液通道的形状，增加未冻溶液的塑性，减少对精子细胞的机械损害，提高冷冻后精子的活率。dmso可以进入细胞取代细胞内水分，这种取代使细胞脱水或结合细胞水，以阻止细胞内冰晶形成，使水处于过冷状态，降低危险区的上限，缩小危险温区的范围，甘油和dmso的复合添加，不仅对精子细胞内部，还对原生质膜具有保护作用，显著提高了冷冻后精子的活率，质膜完整率和顶体完整率。l-谷氨酸可以清除由于精子的呼吸代谢而产生的ros，从而使细胞内的过氧化物和抗氧化物保持平衡，达到保护精子细胞的目的，以提高冷冻后精子的活率。海藻糖分子可以在细胞膜外面产生一种玻璃化状的防护层，从而可以提高精子细胞对高渗透压的耐受性，使细胞解冻后保持复苏性而继续保持其活性。本发明提供的兔精液冷冻保存稀释液明显提高了冷冻后精子的活率，质膜完整率和顶体完整率，有利于提高兔的繁殖效率和育种速度。
具体实施方式
18.本发明提供了一种兔精液冷冻保存稀释液，所述兔精液冷冻保存稀释液以水作为溶剂，所述兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加：三羟甲基氨基甲烷3～4g、柠檬酸1～2g、葡萄糖0.5～1g、海藻糖2～3g、l-谷氨酸0.5～1g、二甲基亚砜10～20ml和甘油2～4ml；所述兔精液冷冻保存稀释液的ph值为6.5～7.5。
19.本发明所述兔精液冷冻保存稀释液以水作为溶剂。在本发明中，所述水优选为纯化水。本发明对纯化水的来源没有特殊要求，普通市售产品或者常规制备方法得到的纯化水即可。
20.本发明的兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加三羟甲基氨基甲烷3～4g，进一步优选为3～3.4，更进一步优选为3.03g。在本发明中，每100ml水添加柠檬酸1～2g，进一步优选为1.69g。本发明对三羟甲基氨基甲烷和柠檬酸的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明三羟甲基氨基甲烷(tris)和柠檬酸可以防止精子细胞结构遭到破坏，对于精子酶反应以及中和其代谢酸性物质具有很好的缓冲作用。
21.本发明的兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加葡萄糖0.5～1g，进一步优选
为0.7～0.9g，更进一步优选为0.85g。本发明对葡萄糖的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明葡萄糖可以提供精子在体外生存所需的养分，并为精子补充能量。
22.本发明的兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加海藻糖2～3g，进一步优选为2～2.5，更进一步优选为2.05g。本发明对海藻糖的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明海藻糖为非渗透性抗冻保护剂，可以改善兔精子的运动性、顶体完整性、质膜完整性和线粒体活性。
23.本发明的兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加l-谷氨酸0.5～1g，进一步优选为0.7～0.8g，更进一步优选为0.74g。本发明对l-谷氨酸的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明l-谷氨酸可以清除氧自由基，抑制脂质的过氧化反应，防止冷冻解冻后精子细胞内的l-谷氨酸水平下降，提高冷冻解冻后精子的活率。
24.本发明的兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加二甲基亚砜(dmso)10～20ml，进一步优选为14～18ml，更进一步优选为16ml。本发明对二甲基亚砜的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明二甲基亚砜为渗透性抗冻保护剂，通过进入细胞取代细胞内水分，使细胞脱水或结合细胞水，以阻止细胞内冰晶形成，使水处于过冷状态，降低危险区的上限，缩小危险温区的范围，可以降低冷冻过程中冰晶化对精子造成的损伤。
25.本发明的兔精液冷冻保存稀释液中，每100ml水添加甘油2～4ml，进一步优选为2.5～3.5，更进一步优选为3ml。本发明对甘油的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明甘油为渗透性抗冻保护剂，具有在脱水条件下取代水的能力，增加膜的稳定性；另外，甘油粘度增加可以防止溶质共生结晶，促进细胞玻璃化形成，改变未冻溶液通道的形状，增加未冻溶液的塑性，与二甲基亚砜复合，不仅对精子细胞内部，还对原生质膜具有保护作用，显著提高了冷冻后精子的活率，质膜完整率和顶体完整率。
26.本发明所述兔精液冷冻保存稀释液的ph值为6.5～7.5，进一步优选为7.1～7.3，更进一步优选为7.3。本发明合适的ph使精子细胞维持正常的形态和功能，防止精子细胞结构遭到破坏。
27.本发明提供的兔精液冷冻保存稀释液明显提高了冷冻后精子的活率，质膜完整率和顶体完整率，冷冻速率快，且质量稳定，有利于精液冷冻保存技术在兔养殖业中的推广，利于提高兔的繁殖效率和育种速度。
28.本发明提供了上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存稀释液的制备方法，包括以下步骤：将三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、海藻糖、l-谷氨酸、二甲基亚砜、甘油和水混合后制得。本发明对混合的方法没有特殊要求，采用本领域常规混合方法混合均匀即可。本发明混合后，得到本发明所述的兔精液冷冻保存稀释液。本发明对所述兔精液冷冻保存稀释液的保存条件没有特殊，采用低温保存即可。在本发明中，所述低温保存的温度优选为2～8℃，进一步优选为4℃。本发明提供的兔精液冷冻保存稀释液的制备方法简单、质量容易控制，适合大规模生产。
29.本发明提供了上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存稀释液或上述技术方案中所述的制备方法制备得到的兔精液冷冻保存稀释液的兔精液冷冻保存方法，包括如下步骤：将兔精液进行冷藏，得到冷藏后的兔精液；将所述冷藏后的兔精液与所述兔精液冷冻保存稀释液进行等温混合，得到混合液；将所述混合液进行平衡、液氮熏蒸后冷冻保存。
30.本发明将兔精液进行冷藏，得到冷藏后的兔精液。在本发明中，所述兔精液的活率
优选在0.8以上。兔精液活率满足上述要求，冷冻操作后复苏效果更佳。在本发明中，所述兔精液优选为去除了凝胶成分后的兔精液。本发明对去除凝胶成分的方法没有特殊要求，在保障兔精液良好活性的情况下，能够将凝胶成分去除即可。本发明去除凝胶成分有利于对兔精液冷冻稀释以及增加复苏后兔精子活力。去除凝胶成分后，本发明将去除凝胶成分后的兔精液进行冷藏，得到冷藏后的兔精液。在本发明中，所述兔精液冷藏的温度优选为2～8℃，进一步优选为4℃。在本发明中，所述冷藏的时间优选为60～120min，进一步优选为90min。
31.本发明将所述冷藏后的兔精液与所述兔精液冷冻保存稀释液进行等温混合，得到混合液。本发明所述兔精液冷冻保存稀释液优选进行冷藏处理，使冷藏后的兔精液冷冻保存稀释液与冷藏后的兔精液温度一致，使其进行等温混合，以降低温度差异导致的冷休克对精子活力的影响。在本发明中，所述兔精液冷冻保存稀释液和冷藏后的兔精液的体积比优选≤5:1；更优选≤2:1；进一步优选为(1～2)：1；更进一步优选为1：1，本发明特定的比例对兔精子细胞具有良好的保护的作用，提高冷冻复苏后兔精子活率。
32.得到混合液后，本发明将所述混合液进行平衡、液氮熏蒸后冷冻保存。在本发明中，所述平衡的温度优选为2～8℃；进一步优选为4℃。在本发明中，所述平衡的时间优选为30～60min；进一步优选为45min。本发明所述平衡可以使兔精液冷冻保存稀释液充分渗透进精子内，实现平衡，以达到抗冻保护作用，抗冷休克；而且精子经适当低温平衡后可增强其耐冻能力，减轻在冷冻过程中冰晶对精子的损害。
33.平衡后，本发明将平衡后的混合液进行液氮熏蒸。在本发明中，所述熏蒸优选为将平衡后得到的混合液在液氮液面上方进行熏蒸。在本发明中，所述液面上方的距离优选为3～10cm，进一步优选为5cm。在本发明中，所述熏蒸的时间优选为5～20min，进一步优选为10min。熏蒸可以让精液更好的以玻璃态冷冻，减少结晶导致精子的死亡。在本发明中，所述熏蒸优选将混合液进行分装后进行。在本发明中，所述分装的规格优选为0.25ml。分装便于日后取用，还可以加快冷冻速率。熏蒸后，本发明将熏蒸后的混合液在液氮冷冻保存。
34.冷冻保存后，使用时优选采用水浴高温解冻对冷冻精液进行解冻。在本发明中，所述水浴高温解冻的温度优选为50～60℃，进一步优选为50～55℃，更进一步优选为50℃。在本发明中，所述水浴高温解冻的时间优选为10～20s，进一步优选为10s。在水浴高温解冻期间，优选将装有冻精的容器压入水面以下，并不断晃动，以保障其均匀受热解冻，防止解冻过程中冰晶再次形成，对精子造成不可逆转的伤害。
35.本发明通过优化冷冻保存稀释液的配方，优化冷冻和解冻条件，将冷冻和解冻操作对精子的伤害降到最低，明显提高了冷冻复苏后的精子活率，质膜完整率和顶体完整率，而且冷冻复苏后的精子活率和活力强，配种母兔，母兔受胎率、分娩率、产仔数高，与鲜精相比没有显著差异，方便人工授精的有效推广，有利于提高兔的繁殖效率和育种速度。另外，本发明通过优化兔精液冷冻保存稀释液的配方以及操作流程，使冷冻过程总耗时缩短，仅需2～3h即可完成，在保障精子冷冻复苏后效果保持最佳的同时，明显提高了精液冷冻的工作效率。进一步的，本发明提供的兔精液冷冻保存方法具有储存期长、安全性高等优势。
36.本发明提供了上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存稀释液或上述技术方案中所述的兔精液冷冻保存方法在兔精液冷冻保存中的应用。
37.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种兔精液冷冻保存稀
释液和制备方法、兔精液冷冻保存方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.实施例1
39.一种兔精液冷冻保存稀释液，每100ml纯化水中添加：三羟甲基氨基甲烷3.03g、柠檬酸1.69g、葡萄糖0.85g、二甲基亚砜16ml、海藻糖2.05g、l-谷氨酸0.74g和甘油3ml，ph值7.3。
40.制备方法：将上述组分原料加入纯化水后充分搅拌，混合均匀制得，4℃保存。
41.实施例1-1
42.一种兔精液冷冻保存稀释液，每100ml纯化水中添加：三羟甲基氨基甲烷3.4g、柠檬酸1.5g、葡萄糖0.7g、二甲基亚砜14ml、海藻糖2.2g、l-谷氨酸0.7g和甘油2.5ml，ph值7.2。
43.制备方法同实施例1相同。
44.实施例1-2
45.一种兔精液冷冻保存稀释液，每100ml纯化水中添加：三羟甲基氨基甲烷3.2g、柠檬酸1.7g、葡萄糖0.9g、二甲基亚砜18ml、海藻糖2.3g、l-谷氨酸0.8g和甘油3.5ml，ph值7.1。
46.制备方法同实施例1相同。
47.对比例1
48.一种精液冷冻保存稀释液，按如下方法配制：葡萄糖1.59g、柠檬酸1.96g、青霉素钠8万iu、硫酸链霉素0.1g、新鲜卵黄20ml，甘油5％(v/v)溶解于100ml双蒸水中，搅拌均匀。
49.对比例1-1
50.一种精液冷冻保存稀释液，按如下方法配制：8％大豆卵磷脂、葡萄糖1.1g、柠檬酸1.48g、三羟甲基氨基甲烷2.42g，甘油6％(v/v溶解于100ml双蒸水中，搅拌均匀。
51.实施例2
52.兔精液冷冻保存方法
53.1)精液采集及活率评价
54.用假阴道法采集公兔精液。在显微镜下，镜检法检测精子的活率达0.8以上，供冷冻保存试验用。采集精液0.2～2ml，精液中含有凝胶成分，在冻精试验前清除，提升精子冷冻效果。
55.2)精液冷冻程序
56.采集好兔精液后，放入冰箱4℃冷藏90min；冷藏后，然后将等温的实施例1的精液冷冻保存稀释液缓慢倒入兔精液中，边加边轻轻摇晃，使冷冻保存稀释液与兔精液体积比为1:1充分混合；混合后兔精液用细管分装，置于4℃平衡45min；平衡后得到的细管，用纱布包裹，在液氮液面上方5cm处熏蒸10min；最后置于液氮罐冷冻保存。
57.实施例2-1
58.兔精液冷冻保存方法，同实施例2，不同之处在于：使用实施例1-1的精液冷冻保存稀释液。
59.实施例2-2
60.兔精液冷冻保存方法，同实施例2，不同之处在于：使用实施例1-2的精液冷冻保存
稀释液。
61.实施例2-3
62.兔精液冷冻保存方法，同实施例2，不同之处在于：冷冻保存稀释液与兔精液体积比为3:1；2℃平衡30min，液氮上方3cm熏蒸5min。
63.实施例2-4
64.兔精液冷冻保存方法，同实施例2，不同之处在于：冷冻保存稀释液与兔精液体积比为5:1；8℃平衡60min，液氮上方10cm熏蒸20min。
65.对比例2
66.一种兔精液冷冻保存方法，同实施例2的方法相同，不同之处在于：冷冻保存稀释液与兔精液体积比为6:1；1℃平衡1.5h，液氮上方2cm熏蒸2min。
67.对比例2-1
68.一种兔精液冷冻保存方法，同实施例2的方法相同，不同之处在于：冷冻保存稀释液与兔精液体积比为10:1；0℃平衡2h，液氮上方15cm熏蒸30min。
69.对比例2-2
70.一种兔精液冷冻保存方法，同实施例2的方法相同，不同之处在于：使用对比例1的精液冷冻保存稀释液。
71.对比例2-3
72.一种兔精液冷冻保存方法，同实施例2的方法相同，不同之处在于：使用对比例1-1的精液冷冻保存稀释液。
73.实施例3
74.采用实施例2、实施例2-1、实施例2-2、实施例2-3、实施例2-4、对比例2、对比例2-1、对比例2-2和对比例2-3的兔精液冷冻保存方法对兔精液进行冷冻保存。考察不同精液冷冻保存稀释液和不同兔精液冷冻保存条件对冷冻复苏后的兔精液的精子活率、质膜完整率顶体完整率的影响；并将解冻后的精液配种母兔，以新鲜兔精液作为对照，考察解冻后精液对繁殖母兔生产效率的影响。
75.冻精解冻程序为：
76.冷冻精液采用50～60℃水浴高温解冻。从液氮罐中夹取所需数量的细管冻精，迅速投入50～60℃恒温水浴锅中保持10～20s后迅速转入37℃恒温水浴锅中。冻精在50～60℃恒温水浴锅中解冻期间，将冻精细管压入水面以下，并不断晃动，以保证其均匀受热解冻。
77.精子活率：取兔精液冷冻细管水浴解冻后，取10μl精液于载玻片上，加盖玻片，在400
×
倒置显微镜下评定直线向前运动精子占所有精子的百分率。
78.精子质膜完整率：主要是采用sybr14/pi方法，sybr14/pi法是将精子加入试剂盒中，利用活精子发绿光，死精子发红光的荧光反应来进行镜检检测质膜是否完整，近而计算精子的质膜完整率。
79.精子顶体完整率：fitc-pna染色法是一种精子顶体染色试剂盒，可在荧光显微镜下，观察精子顶体的染色状态来判定，其主要分为ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ等级，分别代表顶体完整、顶体轻度损伤、顶体重度损伤和顶体完全损伤。其中，等级ⅰ则是精子的整个顶体呈均匀明亮的荧光，等级ⅱ则是精子的部分顶体呈现荧光，等级ⅲ则是精子顶体部位的赤道呈现荧光，
等级ⅳ则是精子顶体不发出任何荧光。
80.检测结果见表1、表1-1、表1-2和表2。
81.表1各组解冻后精子活率的比较
[0082][0083]
注：同一列数字上标小写不同表示差异显著(p﹤0.05)。
[0084]
由表1的结果可知，精子冷冻后活率，实施例2、实施例2-1、实施例2-2、实施例2-3、实施例2-4与对比例2、对比例2-1、对比例2、对比例2-3相比，均有差异性显著。精子冻后活率的所有实施例均优于对比例。
[0085]
表1-1各组解冻后质膜完整率的比较
[0086][0087]
注：同一列数字上标小写不同表示差异显著(p﹤0.05)。
[0088]
由表1-1的结果可知，实施例2、实施例2-1、实施例2-2的质膜完整率显著优于对比例2-2、对比例2-3，说明本发明提供的兔精液冷冻保存稀释液的配方更优，显著提高了冷冻后精子质膜完整率。同时，实施例2-3和实施例2-4在精子的质膜完整率上显著优于对比例2、对比例2-1，说明平衡和熏蒸条件对于精子冷冻具有重要影响，本发明特定的平衡和熏蒸条件可以显著提高冷冻后兔精子的质膜完整率。
[0089]
表1-2各组解冻后顶体完整率的比较
[0090][0091]
注：同一列数字上标小写不同表示差异显著(p﹤0.05)。
[0092]
由表1-2的结果可知，实施例2、实施例2-1、实施例2-2的顶体完整率显著优于对比例2-2、对比例2-3，说明本发明提供的兔精液冷冻保存稀释液的配方更优，显著提高了冷冻后精子质膜完整率。同时，实施例2-3和实施例2-4在精子的顶体完整率上显著优于对比例2、对比例2-1，说明平衡和熏蒸条件对于精子冷冻具有重要影响，本发明特定的平衡和熏蒸条件可以显著提高冷冻后兔精子的质膜完整率。
[0093]
表2：冷冻精液解冻后配种母兔的影响
[0094][0095]
注：同一列数字上标小写不同表示差异显著(p﹤0.05)。
[0096]
由表2的结果可知，本发明冷冻精液解冻后繁殖母兔的生产效率弱于鲜精，但是实施例2、实施例2-3、实施例2-4在均产活仔数上优于对比例2、对比例2-1、对比例2-2、对比例2-3，而且有显著性差异。同时在生产上，以1000只母兔为例，平均一个生产周期，实施例2-2要比对比例2多生产健康仔兔230只，育肥后平均每只母兔每窝至少可多产生5.2元经济效益。
[0097]
上述实施例的结果表明，本发明提供的兔精液冷冻保存稀释液大大提高了冷冻后
精子的活率，质膜完整率和顶体完整率，且质量稳定，有利于提高兔的繁殖效率、育种速度和优秀种质资源的保存。节约公兔饲养量，提高公兔使用效率，具有储存期长、安全性高等优势。
[0098]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。