冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用与流程

1.本发明涉及低温冻存技术领域，特别涉及一种冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用。


背景技术：

2.免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，通过体外培养、增殖、激活，回输体内即可诱导自体抗病毒免疫应答，人体抗病毒免疫一旦被激活就会源源不断产生抗病毒的物质杀灭病毒。有杀伤肿瘤细胞作用的t细胞经激活后在体内大多数变为记忆细胞储存在淋巴组织内，为彻底清除肿瘤细胞和防治转移复发提供了长期保护。此方法适用于各种不同病理阶段肿瘤疾病的治疗，如呼吸系统的肺癌等、泌尿系统的肾癌等、肾上腺癌及其转移癌等、血液系统的急慢性白血病、还有肝癌、胃癌和肠癌等。免疫疗法的发展非常迅速，因此，成功有效的保存免疫细胞在基础临床和临床应用研究上具有重要意义。
3.近年来，细胞、组织和器官的冷冻保存备受关注，冷冻保存技术的突破将为再生医学的发展提供强有力的理论和实验支撑。人工开发出来适用于实验的冷冻细胞的方法具有诸多优点，例如减少基因漂移、减缓细胞衰老、稳定表型和减少微生物污染及交叉污染机会等。其中，细胞冻存是将细胞放在低温环境中，使细胞暂时脱离生长状态，进而减缓细胞代谢，以达到长期储存的一种技术。其中，细胞冻存时向细胞悬液中加入冷冻保护剂，可使溶液冰点下降，减少细胞内冰晶形成，从而避免细胞在冷冻过程中的损伤，因此，选择适当的冷冻保护剂才能最大限度的保存细胞。
4.目前较多的免疫细胞冻存液主要组分是细胞基础培养基、胎牛血清和dmso等，此外还有采用替代dmso的冻存液，尽管成本低效果好，但它能与蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，对细胞具有一定的毒副作用，不能用于治疗用细胞的冻存。还有用替代胎牛血清的冻存液，虽然不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，但该冷冻液的免疫细胞存活率低，因此不能直接用于临床回输。
5.如公开号“cn202110997925.8”，名称为“一种免疫细胞的冻存液及冻存方法”的发明申请公开了一种免疫细胞的冻存液，所述冻存液中包括冻存液和冷冻保护剂，所述冻存液中包括胎牛血清、1640培养液、低分子肝素钙和抗氧化剂，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜(dmso)。其虽然能够提高免疫细胞冻存效果且保证复苏后细胞活性和细胞增殖能力不受影响，但是由于采用含有带有毒性的dmso和比较昂贵的胎牛血清成份，不利于复苏后免疫细胞在临床和临床应用研究。为此，寻找到一种新型的冷冻保存剂，在成分简单，不添加dmso和外源蛋白的前提下，通过控制冷冻保存过程中的结冰、抑制冰晶重结晶、调控冰晶形貌和生长速率，实现免疫细胞的长期及大量保存。


技术实现要素：

6.针对上述不足，本发明的目的在于，提供一种冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用。所述冻存液的配方合理，成分安全，稳定性好，可有效解决现有技术中免疫细胞冻
存液具有一定毒性以及容易引起免疫排斥反应的问题。
7.为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：
8.一种冻存液的制备方法，其包括以下步骤：
9.(1)预备以下质量百分含量的组份：海藻酸钠0.25％～1％、十二烷基硫酸钠0.05％～0.2％、甲基纤维素0.01％～0.02％、磷酸二氢钠0.1％～0.4％、磷酸氢二钠0.2％～0.8％、pbs缓冲液2％～5％，余量为水，优选为注射用水；
10.(2)往所述水中加入海藻酸钠，搅拌溶解，获得海藻酸钠溶液；
11.(3)往所述注射用水中加入十二烷基硫酸钠，搅拌溶解后依次加入所述海藻酸钠溶液和甲基纤维素，搅拌到充分溶解，获得类胶束溶液；
12.(4)往上述混合溶液中加入pbs缓冲液、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，调节冷冻保存液ph至7.0～7.4，混匀，经滤孔径为0.1～0.3μm的滤网进行过滤除菌，滤网的滤孔径优选为0.22μm，制得冻存液。
13.所述海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖，由β-d-甘露糖醛酸和α-l-古洛糖醛酸通过糖苷键链接而成的一种线型嵌段共聚物，具有较强的生物相容性，易生物降解，具有优良的分散性，保湿性，成膜性，抗菌性等诸多优点，能够在细胞冻存过程中作为细胞保护剂，从而有效的模拟细胞间微环境，最终达到维持较高细胞活率和防止细胞功能受损的效果，提高细胞冷冻保存效率。
14.所述十二烷基硫酸钠是一种表面活性剂，具有良好的乳化性、起泡性、水溶性、可生物降解、耐硬水，并且在较大范围ph值的水溶液中具有较高稳定性和易于合成、价格低廉等特点，可作为细胞稳定剂，与海藻酸钠接触时，能在其表面定向排列，其烷基尾链通过疏水作用聚集在一起，形成疏水区域，可减少细胞冻存和复苏过程中细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用，降低冷冻损伤和渗透压变化带来的损伤，使复苏后的细胞保持正常的细胞形态和较高的细胞活力。
15.所述甲基纤维素属于大分子糖类，具有优良的润湿性、分散性、粘接性、增稠性、乳化性、保水性和成膜性，以及对油脂的不透性。所成膜具有优良的韧性、柔曲性和透明度，因属非离子型，可与其他的乳化剂配伍，能增加溶剂的粘度，可以作为细胞沉降稳定剂。
16.所述磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和pbs缓冲液的作用在于调整冻存液的ph值，使其ph值处于适宜细胞冷冻保存的7.0～7.4之间。
17.一种所述的冻存液在免疫细胞的应用，所述免疫细胞可以为人t淋巴细胞系(h9)、人t淋巴细胞白血病细胞(e6-1)和人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞(nk-92mi)，应用步骤如下：
18.(s1)采用离心收集方式进行收集免疫细胞，免疫细胞的浓度为1
×
106～107cells/ml；
19.(s2)加入所述的冻存液，混合均匀后转移至冻存管；
20.(s3)将冻存管放入温度为2～6℃环境中平衡5～15min，优选为在4℃环境中平衡10min，然后移至-70～-90℃环境中降温10～24h，优选在-80℃环境中降温；
21.(s4)将冻存管移至液氮中长期保存。
22.本发明的有益效果为：本发明通过海藻酸钠和十二烷基硫酸钠对免疫细胞进行双层包裹，形成微环境，能有效抑制冰晶的生成，减少细胞的冰晶生成对细胞结构破坏造成的
损伤；其次，再通过甲基纤维素增强包裹层的稳定性。能有效抑制冰晶的生成，减少细胞的冰晶生成对细胞结构破坏造成的损伤，可以明显提高免疫细胞冻存效果，保证细胞在接近冰点时细胞水分不会结晶，保证复苏后细胞的活性和细胞增殖能力不受影响；
23.而且不含有动物源血清和二甲基亚砜，不会对细胞产生毒性，且可避免引入污染和过敏原的风险，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响，增强其在临床上的可应用性；
24.另外，本发明冻存液的配方合理，安全无毒，制备工艺简单，冻存操作简便且复苏时无需程序化降温，易于工业化生产，满足科研、医疗等领域对免疫细胞的需求。
25.下面结合附图与实施例，对本发明进一步说明。
附图说明
26.图1为pbs溶液对照组(左)和本发明冻存液(右)的冰晶重结晶实验结果。
27.图2为免疫细胞经过本发明冻存液的冷冻保存后的活率实验结果。
28.图3为免疫细胞经过本发明冻存液的冷冻保存后的活细胞回收率的实验结果。
29.图4为免疫细胞(e6-1)经过本发明冻存液的冷冻保存后的增殖倍率的实验结果。
30.图5为免疫细胞(h9)经过本发明冻存液的冷冻保存后的增殖倍率的实验结果。
31.图6为免疫细胞(nk-92mi)经过本发明冻存液的冷冻保存后的增殖倍率的实验结果。
32.图7为免疫细胞(e6-1、h9、nk-92mi)经过本发明冻存液的冷冻保存后的形态变化的实验结果。
33.图8为免疫细胞(e6-1、h9、nk-92mi)经过本发明冻存液的冷冻保存后与癌细胞共培养后的杀伤率的实验结果。
34.图9为免疫细胞(e6-1、h9、nk-92mi)经过本发明冻存液的冷冻保存后与癌细胞共培养后的形态变化的实验结果。
具体实施方式
35.实施例1：本实施例以人t淋巴细胞系(h9)、人t淋巴细胞白血病细胞(e6-1)和人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞(nk-92mi)的冷冻保存和复苏为例进行说明，但不用来限制本发明的限制范围。
36.冻存液的制备：分别量取45ml注射水放入两个烧杯中，放入搅拌子，转速调节至500rpm，预冷至4℃；其中一个烧杯加入海藻酸钠0.5g，继续搅拌至完全溶解；另一个烧杯加入十二烷基硫酸钠0.1g，充分搅拌均匀后分别加入海藻酸钠溶液和甲基纤维素0.01g，持续搅拌10分钟；最后依次加入标准pbs缓冲液5ml、磷酸二氢钠0.3g和磷酸氢二钠0.7g，调节ph至7.0～7.4，混匀，经0.22μm过滤除菌，制得冻存液。
37.(一)免疫细胞的冷冻保存：离心收集待冻存的免疫细胞，去上清，加入所述的冻存液，缓慢吹打混合得到细胞悬液，将其转移至无菌冻存管中于4℃冰箱平衡10min，直接放入-80℃冰箱中降温，隔天将其转入液氮中长期保存；
38.(二)免疫细胞的复苏：将细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，同时轻轻摇动，待细胞完全溶解后，轻轻吹匀冻存管中细胞，并移出至2～3ml预热的完全培养基中，离
心后去上清，得到复苏后细胞；
39.(三)复苏后的免疫细胞活性评价：免疫细胞经过短期或长期冻存，进行复苏并观察细胞形态、细胞活性和增殖能力，其包括如下：
40.(1)细胞活性评价：细胞水浴解冻后，从冻存管中取出一部分细胞用于计数(aopi荧光计数)，一部分细胞放在倒置显微镜下观察其细胞形态。
41.(2)细胞增殖能力评价：用适量的完全培养基重悬复苏后免疫细胞，计数后并接种到96孔板中继续培养，在24、48和72小时后加入相应的cck8并在波长450nm下测吸光度，进一步评价细胞冻存后的增殖能力。
42.(3)细胞体外抗癌细胞的性能评价：用适量的完全培养基重悬复苏后免疫细胞，计数后并接种到含有人肺癌细胞(a549)的96孔板中继续培养，在24、48和72小时后，移除免疫细胞，并用pbs溶液轻轻吹洗2遍，最后加入含有cck8的完全培养基，在波长450nm下测吸光度，进一步评价细胞冻存后的抗癌细胞活性。
43.参见图1，利用低温显微镜观察本发明冻存液的重结晶抑制作用，可以得知采用本发明冻存液形成的冰晶重结晶尺寸远小于pbs水溶液，说明本发明冻存液能够抑制冰晶生长且降低冰点，使冰晶不能聚集增大，保持细小均匀，从而产生显著的抑制冰晶重结晶效果。需要说明的是，实际冷冻保存复温过程中冰的重结晶过程非常快，难以实现直接原位观察，图1为模拟复温过程中的冰晶重结晶实验，该方法是冷冻保存领域普遍接受的方法。
44.参见图2和图3，为免疫细胞即时复苏活率及形态图。免疫细胞(h9、e6-1、nk-92mi)在经过本发明冻存液冻存复苏后活率均能达到90％以上、活细胞回收率高且复苏后细胞饱满，轮廓清晰，说明本发明冻存液对免疫细胞的冷冻保存效果好，减少了细胞在冻存过程中的损伤，能够满足临床要求的细胞存活率。
45.参见图4至图7，为免疫细胞(h9、e6-1、nk-92mi)在24、48和72小时的增殖倍率及形态图。免疫细胞经过本发明冻存液冻存复苏后，能够维持正常的生长状态及速率，说明本发明冻存液对免疫细胞的冷冻保存效果好，不影响免疫细胞的增殖。
46.参见图8和图9，为免疫细胞(h9、e6-1、nk-92mi)对癌细胞的杀伤率及免疫细胞与癌细胞共培养后形态图。免疫细胞经过本发明冻存液冻存复苏后，与癌细胞共培养，能明显改变癌细胞形态及显著降低癌细胞活率，具有高杀伤率，说明本发明冻存液对免疫细胞的冷冻保存效果好，能满足临床应用所要求的高效杀伤肿瘤细胞能力。
47.实施例2：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存液包括以下质量百分含量的组份：海藻酸钠0.5％、十二烷基硫酸钠0.1％、甲基纤维素0.015％、磷酸二氢钠0.2％、磷酸氢二钠0.5％、pbs缓冲液3％，余量为注射用水。
48.实施例3：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存液包括以下质量百分含量的组份：海藻酸钠0.4％、十二烷基硫酸钠0.08％、甲基纤维素0.02％、磷酸二氢钠0.4％、磷酸氢二钠0.2％、pbs缓冲液2％，余量为注射用水。
49.实施例4：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存液包括以下质量百分含量的组份：海藻酸钠0.25％、十二烷基硫酸钠0.2％、甲基纤维素0.015％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钠0.8％、pbs缓冲液4％，余量为注射用水。
50.实施例5：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，所述冻存液包括以下质量百分含量的组份：海藻酸钠1％、十二烷基硫酸钠0.1％、甲基纤维素0.018％、磷酸二氢钠
0.3％、磷酸氢二钠0.7％、pbs缓冲液2％，余量为注射用水。
51.上述实施例仅为本发明较好的实施方式，本发明不能一一列举出全部的实施方式，凡采用上述实施例之一的技术方案，或根据上述实施例所做的等同变化，均在本发明保护范围内。
52.本发明是通过海藻酸钠和十二烷基硫酸钠对免疫细胞进行双层包裹，再通过甲基纤维素增强包裹层的稳定性后进行冷冻保存，能有效抑制冰晶的生成，减少细胞的冰晶生成对细胞结构破坏造成的损伤，可以明显提高免疫细胞冻存效果，保证细胞在接近冰点时细胞水分不会结晶，确保复苏后细胞的活性和细胞增殖能力不受影响。本发明冻存液中无动物源血清和二甲基亚砜，不会对细胞产生毒性，且可避免引入污染和过敏原的风险，降低了动物病原污染的概率，不会对人体过继免疫治疗产生影响，增强其在临床上的可应用性。本发明冻存液的配方安全无毒，制备工艺简单，冻存操作简便，易于工业化生产，满足科研、医疗等领域对免疫细胞的需求。
53.根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制，采用与其相同或相似方法而得到的其它冷冻剂及其制备方法和应用，均在本发明保护范围内。