一种抑郁症肝郁化火证疾病小鼠的造模及评价方法

30天连续睡眠剥夺刺激，并同时给予灯光照射1-24h/天的刺激以及隔天给粮的刺激。
11.进一步地，所述睡眠剥夺刺激在设置为间歇性转动的睡眠剥夺仪中进行。
12.进一步地，所述睡眠剥夺仪的转速为2-50转/min，转动时间为3-24小时/天，间歇性转动的间隔时间为1-10min/次。
13.本发明还公开了一种如上任意一项所述造模方法得到的小鼠模型的评价方法，包括以下步骤：
14.步骤一：构建抑郁症模型，并根据旷场实验﹑高架十字迷宫实验、悬尾实验和强迫游泳实验判断抑郁动物是否造模成功；
15.步骤二：对造模成功的小鼠进行中医证候诊断方法判断抑郁动物是否同时具有肝郁化火证。
16.进一步地，所述步骤一中，将小鼠尿液﹑体重作为构建抑郁症模型过程中的整体性生理状态的判断指标。
17.进一步地，所述步骤二中，中医症候诊断方法中的判断指标包括：用于评价模型肝郁状态的整体行为学指标、用于评价模型气郁化火状态的整体生理指标以及用于评价模型肝郁化火状态的体内生化指标。
18.进一步地，所述整体行为学指标：小鼠强迫游泳不动时间、旷场活动总路程、进入旷场中心的时间、次数和平均速度，高架十字迷宫中进入开放臂的次数和时间。
19.进一步地，所述整体生理指标包括：小鼠舌象、爪色及饮水量。
20.进一步地，所述体内生化指标包括：小鼠血清中5-ht(5-羟色胺)、gaba(γ-氨基丁酸)、da(多巴胺)含量以及脑中乙酰胆碱的含量。
21.本发明的有益效果是：本发明基于“病证结合”的原理，利用睡眠剥夺建立了一种新型的抑郁症肝郁化火证模型，为深入了解抑郁症的发病机制及抗抑郁药物的作用机制，提供了一种建模时间短、操作简便、成功率高，经济耐用、致死率低且实用的动物模型建立方法。在抑郁模型建立成功后，通过中医证候诊断方法判断该抑郁模型具备中医“肝郁化火证”的特点，以及抑郁模型成立后所表现的肝郁化火证型。本发明采用从动物模型上所得到的信息进行抽象概括，进而归属其证候类型。同时利用经典方药反证模型建立成功与否。本发明基于肝气郁结，郁久化火是肝郁化火型焦虑的本质病机，选用治疗肝郁化火证的经典方丹栀逍遥散佐证模型，且动物实验及临床试验表明，该方治疗抑郁障碍行之有效，副作用小。
附图说明
22.图1为各组小鼠造模期间体重变化曲线图；
23.图2左为模型组和对照组旷场试验中进入中心次数的实验结果对比图；图2中为模型组和对照组旷场试验中在中心的时间实验结果对比图；图2右为模型组和对照组高架十字迷宫实验中进入开放臂的实验结果对比图；
24.图3左为模型组和对照组的悬尾不动时间的实验结果对比图；图3右为模型组和对照组强迫游泳不动时间实验结果对比图；
25.图4左为模型组、对照组和帕罗西汀组的悬尾不动时间的实验结果对比图；图4右为模型组、对照组和帕罗西汀组强迫游泳不动时间实验结果对比图；
26.图5为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的饮水量对比图；
27.图6为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的旷场试验结果对比图；
28.图7为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的高架十字迷宫实验结果图；
29.图8为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的强迫游泳实验结果对比图；
30.图9为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的小鼠5-ht、gaba、da以及ach含量对比图；
31.图中，
***
(p＜0.001)和
*
(p＜0.05)，p＜0.05代表的是模型组与对照组相比，具有统计学意义；
32.###
(p＜0.001)、
##
(p＜0.01)和(p＜0.05)代表的是帕罗西汀组或丹栀逍遥组与模型组相比，p＜0.05具有统计学意义。
具体实施方式
33.本部分将详细描述本发明的具体实施例，但其不能理解为对本发明保护范围的限制。
34.一、造模过程：
35.1、实验动物的准备:
36.出生6-8周wt成年雄性小鼠60只(动物生产许可证：scxk(苏)2017-0007)，体重20～30g。于江西中医药大学实验动物科技中心适应性饲养一周，动物房环境温度20-26℃，湿度40-60％。
37.适应性饲养结束后完成基线体重的测量。
38.将小鼠分为抑郁症组30只和抑郁症肝郁化火证组30只。抑郁症组中分为对照组10只，模型组10只，帕罗西汀组10只。抑郁症肝郁化火证组中分为对照组10只，模型组10只，丹栀逍遥散(dzxys)组10只。为避免造模过程中小鼠之间的相互啮咬，每笼只饲养1只小鼠。
39.采用病、证结合的方式对实验组进行造模，对照组不作任何处理。
40.除造模行为刺激外，实验组与对照组的饲养环境与方式完全一致。
41.2、抑郁症的造模：
42.先将抑郁症组中实验组(模型组和帕罗西汀组)放入睡眠剥夺仪施行15天连续睡眠剥夺刺激，设置睡眠剥夺仪转速为5rpm，转动时间为1200min。将设有动物的睡眠剥夺仪处于间歇性转动的状态，间歇时间为3min，运行方向为正反转。并同时给予灯光照射24h/日的刺激，以及隔天给粮的刺激，连续刺激15天。对照组不做任何处理。
43.2.2.抑郁症的评价方法
44.将抑郁症组中的帕罗西汀组，称取适量帕罗西汀(湖北九州通医药有限公司)，加水配置为浓度1.0mg/ml溶液，腹腔注射给药治疗，给药量为10mg/d/kg，连续给药14d；对照组和模型组灌胃同等剂量的生理盐水。
45.2.3.抑郁症的观察指标及方法
46.每天观察记录小鼠的一般体征，体重，饮食量、饮水量，于造模的第16d分别测量各组小鼠的行为学，于抑郁症造模结束后解剖对照组、模型组、帕罗西汀组小鼠各10只，眼眶取血、脑，测神经递质5-ht、gaba、da、乙酰胆碱的含量。
47.3、肝郁化火的中医证候诊断方法
48.抑郁症小鼠造模结束后，通过观察及检测毛发、尿液、舌、爪色、行为学实验、采用液质联用gc-ms检测脑和血中的神经递质5-ht、gaba、da、乙酰胆碱含量判断出该模型小鼠是否具备肝郁化火的症状学表现。
49.3.2肝郁化火的评价方法
50.将肝郁化火证组中的模型组和丹栀逍遥散组重复上述抑郁症造模的步骤。丹栀逍遥散所用药材购自厦门本草真源生物医药科技有限公司。具体每付药材为白术10g、白芍12g、茯苓12g、当归12g、炙甘草3g、酒炙柴胡12g、薄荷3g、焦栀子8g、牡丹皮12g，按原料：水1：10(g:ml)加水,投原方10付，浸泡30分钟后，煎煮2小时后，经冻干后得到干粉213g，灌胃给予成人等效剂量的丹栀逍遥散16.8mg
·
kg-1
·
d-1
，连续14d；对照组灌胃同等剂量的生理盐水。
51.3.3.抑郁症肝郁化火证的观察指标及方法
52.每天观察记录小鼠的一般体征，体重，饮食量、饮水量，于造模结束后的第1d分别拍摄各组小鼠的舌、爪、尿液，测量行为学，于抑郁症造模结束后解剖对照组、模型组、丹栀逍遥散组小鼠各10只，眼眶取血、脑测神经递质5-ht、gaba、da、乙酰胆碱。
53.二、评价指标
54.1.抑郁症的指标
55.旷场实验﹑高架十字迷宫实验、悬尾实验和强迫游泳实验是常用的评价实验动物抑郁症模型的指标。
56.本实验以旷场实验、高架十字迷宫实验中的活跃度和平均速度、悬尾和强迫游泳不动时间来评估模型小鼠的抑郁程度。
57.2.肝郁化火证的指标
58.本实验以尿液、舌、爪、脑及血中的神经递质5-ht、gaba、da、乙酰胆碱含量作为评估肝郁化火的指标。
59.造模结束后的第一天对小鼠的外观、舌、爪进行拍摄，并取尿液与对照组进行对比，结果见表1。
60.三、结果分析
61.1.抑郁症造模后对模型组和对照组小鼠进行旷场实验﹑高架十字迷宫实验以及悬尾和强迫游泳试验，结果见图2和3，从图2和3中可以看出：抑郁症造模使小鼠的进入中心的速度和时间降低，小鼠活动受限，悬尾实验中不动时间延长，强迫游泳时放弃挣扎时间延长，呈现出绝望样抑郁状态，而对照组小鼠无此变化，说明模型组造模成功。
62.2.造模后，对抑郁症组中的模型组和帕罗西汀组的小鼠进行悬尾和强迫游泳试验，结果见图4，模型组小鼠悬尾和强迫游泳实验中的不动时间明显减少，这说明造模小鼠的抑郁绝望行为得到了缓解。表明帕罗西汀可有效改善抑郁小鼠的抑郁绝望行为，进一步佐证了抑郁症小鼠模型的建立是成功的。
63.采用睡眠剥夺造模出的抑郁症小鼠通过中医证候诊断方法判断出同时具有肝郁化火证，即对造模后的小鼠判断指标：舌爪偏红体征、尿液明显偏黄、饮水量增加，用于评价整体的生理指标上表现气郁化火的状态。旷场实验中行走的总距离、进入中心的时间和次数及平均速度显著减少、高架十字迷宫实验中基本不进入，开放臂、强迫游泳不动时间显著增加，用于评价整体的行为学指标上表现出肝郁状态；小鼠血清中5-ht、gaba、da显著降低，
脑中乙酰胆碱(ach)显著升高，用于评价体内的生化指标上出现肝郁化火的表征。即对抑郁症肝郁化火证组的模型组和丹栀逍遥散组进行小鼠的整体生理指标、旷场实验、高架十字迷宫、强迫游泳实验以及小鼠脑及血中的神经递质5-ht、gaba、da、乙酰胆碱含量测试，具体测试结果如下：
64.表1各组小鼠的外观、舌色以及爪色检测结果
[0065][0066]
从表1中可以看出抑郁症肝郁化火证组中的模型组与对照组相比，毛发凌乱，枯黄无光泽，反应迟钝，耳廓干焦，舌色与爪色与对照组对比更红。提示大鼠的身心功能呈现出明显异常，粘膜干燥与肝郁日久，化火化热，热盛伤精耗液类似。而经过丹栀逍遥散治疗干预后，丹栀逍遥散组小鼠的状态恢复，舌色与爪色与对照组接近。
[0067]
从表1还可明显看出模型组尿液明显偏黄。符合肝郁化火小便黄赤的证候。经过丹栀逍遥散治疗干预后，丹栀逍遥散(dzxys)组的尿液颜色变淡，尿液颜色与对照组更为接近。
[0068]
图1为各组小鼠在造模期间的体重变化曲线图，从图1可见，造模前4天，体重变化不明显，从造模第5d起，模型组小鼠体重显著性降低，而丹栀逍遥散(dzxys)组和对照组的体重整体呈现上升的趋势，符合肝郁化火证中常见体重显著下降的症状。
[0069]
图5为对照组与抑郁症肝郁化火证组的模型组的饮水量对比，表明抑郁症肝郁化火证模型组饮水量较对照组对比明显增加，经过丹栀逍遥散治疗干预后，丹栀逍遥散(dzxys)组的饮水量下降，有明显的改善。
[0070]
图6为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的旷场试验结果对比图，表明抑郁症肝郁化火证模型组小鼠在旷场实验中行走的总距离，进入中心的时间和次数，平均速度与对照组小鼠对比显著降低，而经过了丹栀逍遥散治疗干预后，小鼠的总距离、平均速度和进入中心的次数都有显著的恢复。
[0071]
图7为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的高架十字迷宫实验结果对比图，表明在高架十字迷宫实验中，抑郁症肝郁化火证模型组小鼠基本不进入开放臂，活动范围基本在闭合臂，与对照组小鼠对比有显著性差异，而经丹栀逍遥散治疗干预后，丹栀逍遥散(dzxys)组小鼠的活动增强，在开放臂和闭合臂的时间与对照组小鼠接近，说明有明显的恢复。
[0072]
图8为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的强迫游泳实验结果对比图，表明抑郁症肝郁化火证模型组小鼠在强迫游泳实验中的不动时间较对照组显著增加，经丹栀逍遥散治疗干预后，丹栀逍遥散(dzxys)组得到了明显的恢复。
[0073]
图9为对照组、模型组以及丹栀逍遥散(dzxys)组的小鼠5-ht、gaba、da以及ach含
量对比图，表明抑郁症肝郁化火证模型组小鼠5-ht、gaba、da(即图中dba)明显高于对照组，经过丹栀逍遥散治疗干预后，丹栀逍遥散(dzxys)组5-ht、gaba、da明显升高；抑郁症肝郁化火证模型组小鼠ach明显高于对照组，经过丹栀逍遥散干预治疗后，dzxy组得到明显恢复改善。
[0074]
通过以上技术方法，取得的模型小鼠悬尾、强迫游泳不动时间明显增加，旷场活动路程、进入旷场中心的时间、次数和平均速度以及高架十字迷宫中进入开放臂的次数和时间显著降低，说明模型组在整体的行为学指标上表现出明显的抑郁状态；同时模型组小鼠出现皮毛杂乱无光，并伴有眯眼﹑倦怠等症状，对外界刺激反应迟缓、挣扎时无力且时间短，体重显著下降。尿液颜色明显偏黄，饮水量显著增加，舌象及爪色明显偏红的肝郁化火的症状，说明模型小鼠具备了抑郁症肝郁化火证的症状学表现。疾病模型小鼠具备成功模拟的抑郁症的病和肝郁化火的证的临床表型，符合其因情志失调或不畅，郁结日久化火，而引起的急躁易怒，胸闷胀痛等的病机，可作为抑郁症肝郁化火证的病机、治疗的进一步研究。
[0075]
综合以上“病”和“证”的特点，本发明提供了一种符合临床证型的抑郁症肝郁化火证的建模及评价方法。根据现代学科理论和相关实验动物科学知识，利用现代医学复制疾病到动物身上，再利用病因等因素观察中医的“证”在动物模型上的体现。这样做的目的是为了让“病证结合”动物模型不仅有西医疾病的特征，又有中医证候的特点，为个体化、精准化医疗提供研究基础，有利于更全面、直观地借鉴中医临床进行科学研究和实验结果可以及时应用临床。
[0076]
以上所述仅为本发明的优选实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。