微生物和钙用于改善植物健康和/或针对植物病原体的恢复力的用途的制作方法

微生物和钙用于改善植物健康和/或针对植物病原体的恢复力的用途
1.本发明涉及包含至少一种酵母和选自由乳杆菌目(lactobacillales)、根瘤菌目(rhizobiales)和双歧杆菌目(bifidobacteriales)组成的组的至少一种细菌，和/或包含钙的试剂盒或组合物用于改善植物健康、用于改善植物对植物病原体的抗性、用于防止或减少植物材料的真菌毒素(mycotoxin)污染、用于改善植物对植物疾病的抗性、用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成、用于植物保护和/或作为植物刺激剂的用途。本发明还涉及相应的组合物和试剂盒以及将这种组合物或试剂盒应用于活的植物或植物碎片的方法。
2.农业相关作物诸如谷类(小麦、硬粒小麦、大麦、黑麦、小黑麦)、玉米、蔬菜或水果受到各种有害病原体例如真菌感染的威胁。由此产生的疾病导致作物歉收或质量损失，并且从而导致从播种到储藏收获的整个生产链的严重损失。
3.谷类中(禾谷镰刀菌(fusarium graminearum))的镰刀菌赤霉病(fusarium head blight，fhb)和玉米中的镰刀菌穗腐病(fusarium ear rot，fer)被认为是农业中的两个主要问题。fhb和fer由于核被真菌毒素的污染而导致质量损失，真菌毒素对家养动物和人类的健康构成严重威胁，并且世界各地都为此制定了食品法规。镰刀菌属种每年在全世界造成数十亿欧元的巨大经济损失。间接成本(例如通过真菌毒素监测程序和牲畜性能的降低)估计甚至会更高。禾谷镰刀菌仅可能在收获后留在田间的受侵扰作物残留物上存活。在春季，当天气状况有利时，真菌(玉蜀黍赤霉(gibberella zeae))的有性阶段在受侵扰作物碎片上发育。真菌的子实体(子囊壳)在这些残留物的表面形成，并且将作为新季节感染的主要接种物的有性孢子(子囊孢子)排放到空气中。适当的作物轮作可以帮助减少孢子的产生，但在许多地区，在玉米和谷类之间实践紧密的作物轮作(玉米之后是小麦，谷物之后是谷物，和小麦之后是小麦)，并且由于相同的镰刀菌病原体影响两种作物，疾病压力逐年增加。
4.在葡萄栽培中最重要的真菌疾病是esca(由真菌嗜蓝孢孔菌属(fomitiporia)、phaeomoniella和phaeoacremonium引起)、霜霉病(downy mildew)(由葡萄霜霉病菌(plasmopara viticola)引起)、白粉病(白粉菌(erysiphe necator))以及灰霉病(灰葡萄孢(botrytis cinerea))。这些疾病会导致巨大的产率损失，直至整个葡萄园中的作物歉收，甚至整个葡萄园的葡萄藤死亡。
5.马铃薯晚疫病，由卵菌纲致病疫霉(phytophtora infestans)引起，是马铃薯生产中危害最大并且难以控制的疾病，其可以导致完全的产率损失。
6.在甜菜中，由病原真菌诸如甜菜生尾孢(cercospora beticola)(尾孢菌叶斑病(cercospora leaf spot))、ramularia betae(柱隔孢叶斑病(ramularia leaf spot))、甜菜锈病菌(uromyces betae)(锈病(rust))、甜菜白粉菌(erysiphe betae)(白粉病(powdery mildew))引起的叶面疾病代表主要问题，并且导致巨大的产率和质量损失，直至整个作物歉收。
7.对于苹果最重要的真菌病原体是苹果黑星菌(venturia inaequalis)(苹果黑星
病(apple scab))以及白粉病的致病真菌白叉丝单囊壳(podosphaera leucotricha)。这些疾病可能导致变形、矮化，并且最终导致产率和质量的损失。
8.在洋葱中，尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)是众所周知的土传病原菌，其导致基根腐病(basal root rot)并且因此危害整个植物。
9.在油菜中，菌核茎腐病(sclerotinia stem rot)由植物病原真菌核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)引起，并且由于扰乱种子发育和因此降低产率而引起主要问题。
10.在向日葵中，核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)是盘和茎腐烂以及根枯萎的病原菌。如果发生早期感染或根感染，植物通常会迅速死亡。与健康植物相比，枯萎植物的盘腐烂通常较小并且种子重量较低。
11.通常，合成杀虫剂用于尝试防止真菌感染的爆发，或至少限制真菌感染的传播。然而，在当今农业中广泛使用的杀真菌剂并不总是显示出所需的功效，因为对这些化学品的抗性已经增加，同时化学合成的杀真菌剂在经处理的植物中引起压力，并且还对土壤和环境具有负面影响。此外，有机农业根本不允许使用化学合成杀真菌剂。
12.xue等人(can.j.plant pathol.31:169
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179)公开了通过使用微生物粉红螺旋聚孢霉(clonostachys rosea)控制镰刀菌赤霉病。
13.us 2019/0133136 a1公开了选自平凡假单胞菌(pseudomonas trivialis)、浅黄色假单胞菌(pseudomonas lurida)、phaeophlebiopsis种、大棘黑团孢(periconia macrospinosa)及其组合的微生物用于治疗镰刀菌赤霉病的用途。
14.wo 2013/174792公开了特定的乳杆菌(lactobacillae)(副干酪乳酪杆菌、植物乳杆菌)用于控制污染物(诸如细菌、酵母或霉菌)在食物或饲料上的生长的用途。
15.无论现有的防止病原体污染扩散的策略如何，本领域仍然非常需要新的方法来防止由于病原体侵扰，特别是真菌侵扰而造成的植物生产损失。因此，本发明的目的是提供此类新方法，特别是用于改善植物健康、用于改善植物对植物病原体的抗性和用于防止或减少植物材料的真菌毒素污染的方法。
16.该问题通过以下和所附权利要求中列出的主题来解决。
17.本发明的发明人惊奇地发现，特定的微生物、钙和两者的组合可以有效地用于增强植物对植物病原体的抗性，特别是增强对植物病原真菌的抗性。
18.因此，本发明在第一方面涉及组合物或试剂盒用于改善植物健康、改善植物对植物病原体的抗性、防止或减少植物材料的真菌毒素污染、改善植物对植物疾病(例如由植物病原体引起的)的抗性、用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成、用于植物保护和/或作为植物刺激剂的用途，该组合物或试剂盒包含：
19.a)至少两种、优选至少三种、更优选至少四种、甚至更优选至少五种不同的微生物，最优选六种不同的微生物，其中微生物选自细菌和酵母，其中微生物包含至少一种细菌和一种酵母，并且其中细菌选自由乳杆菌目、根瘤菌目和双歧杆菌目组成的组；和/或
20.b)钙，优选其中钙以氯化钙、丙酸钙或乳酸钙、乙酸钙、柠檬酸钙和碳酸钙，特别是氯化钙、丙酸钙或碳酸钙的形式存在。
21.如本文所用，“改善植物健康”应理解为涵盖任何形式的植物健康的改善，特别是关于与在相同条件下生长的未处理植物相比，用该组合物或试剂盒处理的植物中的疾病发
生率减少。
22.如本文所用，“改善植物对植物病原体的抗性”是指给定植物针对至少一种植物病原体，特别是真菌诸如禾谷镰刀菌的抗性的能力增加。增加的抗性可以例如表现为病原体侵扰发生的减少、由病原体引起的疾病症状的减少和/或减少的由病原体引起的疾病的恢复时间。通过比较用本发明的组合物或试剂盒处理的植物与在相同实验条件下生长的未处理植物，可以观察到改善的对靶病原体的抗性。
23.如本文所用，“改善植物对由植物病原体引起的植物疾病的抗性”是指与在相同条件下生长的未处理植物相比，用该组合物或试剂盒处理的植物中减少的植物疾病的发生率或严重性。感染性植物疾病是由病原生物诸如真菌或细菌引起。
24.如本文所用，术语“包含”不应被解释为限于“由
……
组成”的含义(即排除另外的其他物质的存在)。相反，“包含”意味着可以存在任选地另外的物质、特征或步骤。术语“包含”涵盖落在其范围“由
……
组成”(即排除另外的其他物质的存在)和“包含但不由
……
组成”(即需要另外的其他物质、特征或步骤的存在)内的特别预想的实施方案，前者是更优选的。
25.当在本文中使用时，词语“一”或“一种”的使用可以表示“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
26.在本发明的第一方面(本发明用途)的上下文中，以及在本发明的方法的上下文中，植物可以是受益于用上述组合物(或试剂盒)处理的任何类型的植物。优选地，该植物是农作物。特别优选的植物是选自小粒谷类、玉米和葡萄树的组的植物，对于这些植物，本发明人已经在实施例中证明用包含微生物和/或钙的上述组合物(或试剂盒)的非常有效的处理。本发明人特别预想上述组合物(或试剂盒)在选自下组的植物(和相应植物的植物材料等)上的应用：小麦、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、玉米、葡萄树、马铃薯、甜菜、洋葱、苹果、油菜或向日葵组成的组，特别是小麦、玉米、葡萄树、马铃薯、甜菜、洋葱、苹果、油菜或向日葵。最优选地，植物选自小麦和葡萄树。植物可以受益于用该组合物(或试剂盒)直接处理，导致改善的健康和对来自植物病原体特别是真菌诸如禾谷镰刀菌或其他植物病原真菌的疾病压力的抗性。然而，也如实施例中所示，植物也可以间接受益于包含微生物和/或钙的组合物(或试剂盒)的应用，这通过在来自上一个生长季节的植物碎片和死亡植物材料上应用组合物(或试剂盒)，在其上半活体营养型(hemibiotrophic)/死体营养型(necrotrophic)病原体诸如禾谷镰刀菌可能在冬季期间存活并在春季开始新的感染循环。
27.根据本发明的第一方面待使用的微生物是至少两种，即至少一种细菌和至少一种酵母。优选地，组合物(或试剂盒)包含多于两种微生物，诸如至少三种、至少四种或至少五种微生物，后者是最优选的。组合物或试剂盒可以例如包含2至6种微生物、3至6种微生物、4至6种微生物或恰好6种微生物。所选择的微生物可以自由地选自细菌和酵母，但优选地，组合物或试剂盒包含细菌多过酵母。
28.如先前所述，细菌选自由乳杆菌目、根瘤菌目和双歧杆菌目组成的组。优选地，根据本发明的第一方面使用的组合物(或试剂盒)主要或甚至仅包含乳杆菌目，诸如发酵粘液乳杆菌(l.fermentum)、干酪乳酪杆菌(l.casei)或植物乳植杆菌(l.plantarum)。最优选地，组合物(或试剂盒)包含至少一种植物乳植杆菌株作为细菌。根据本发明(即不考虑本发明的方面)，特别优选的植物乳植杆菌亚种是植物乳植杆菌植物亚种
(lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)。如果组合物(或试剂盒)包含选自根瘤菌目的至少一种细菌，则优选该细菌是沼泽红假单胞菌(r.palustris)。在组合物(或试剂盒)包含选自双歧杆菌目的至少一种细菌的情况下，则优选地该细菌选自由两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)和动物双歧杆菌(b.animalis)组成的组。在本发明的特别优选的实施方案中，组合物(或试剂盒)的所有细菌选自由发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌、沼泽红假单胞菌；两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌组成的组。本发明用途(即本发明的第一方面)的组合物(或试剂盒)中的至少一种酵母优选是酿酒酵母(s.cerevisiae)。最优选地，组合物(或试剂盒)的至少两种、至少三种、至少四种或至少五种微生物选自由发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌组成的组，甚至更优选地选自由发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌和酿酒酵母组成的组。
29.不同的微生物可以仅在株水平上不同，即不需要是不同的种。例如，包含至少三种不同微生物的组合物(或试剂盒)可以包含至少一种细菌和相同酵母的两种不同株，例如两种不同类型的酿酒酵母。同样，组合物可以包含至少一种酵母和相同细菌的两种不同株，例如发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌或植物乳植杆菌，特别是植物乳植杆菌的两种不同株。优选地，根据本发明的第一方面待使用的组合物(或试剂盒)包含多于一种乳杆菌株。在一些实施方案中，组合物(或试剂盒)将包含相同细菌的至少两种株，例如相同种的两种乳杆菌株，以及并行的相同酵母的两种不同株，例如两种酿酒酵母株。待使用的组合物(或试剂盒)中特别优选的细菌组合是i)发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌和沼泽红假单胞菌，ii)发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌、沼泽红假单胞菌、两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌，和iii)发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌和两种不同种类的植物乳植杆菌株，后者是最优选的实施方案。如上所述，特别优选的植物乳植杆菌亚种是植物乳植杆菌植物亚种。
30.在实施例部分中例举的组合物(和相应的试剂盒)是在本发明的第一方面的上下文中待使用的特别优选的组合物(和试剂盒)，并且可以包含：
31.i)发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌(例如植物乳植杆菌植物亚种)、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌；
32.ii)发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌(例如植物乳植杆菌植物亚种)、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌；或(最优选地)
33.iii)发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、两种不同的植物乳植杆菌株(例如亚种植物乳植杆菌植物亚种的)和两种不同的酿酒酵母。
34.使用本发明的第一方面所需的微生物对于本领域技术人员而言是容易获得的，并且例如可从以下微生物保藏中心商业获得，诸如美国典型培养物保藏中心(atcc，美国)、捷克微生物保藏中心(ccm)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(dsmz，德国)、荷兰细菌和cbs培养物保藏中心(nccb/cbs)、日本国立技术与评价研究院生物资源中心(ifo，日本)或韩国微生物培养中心(kccm)。
35.代替微生物，或与微生物组合，根据本发明的第一方面使用的组合物(或试剂盒)也可以包含钙，即钙离子形式。正如本发明人所证明的，钙也确实对植物健康提供积极影响，并且可以(单独或与微生物组合)用于改善植物健康、用于改善植物对植物病原体的抗
性、用于防止或减少植物材料的真菌毒素污染、用于改善植物对植物疾病(例如由植物病原体引起)的抗性、用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成、用于植物保护和/或作为植物刺激剂。
36.钙可以例如以氯化钙、丙酸钙、乳酸钙、乙酸钙、柠檬酸钙、碳酸钙或其混合物等形式提供。最优选其作为氯化钙提供。特别地，钙应以水溶性形式存在于组合物(或试剂盒)中，以允许易于被植物或植物材料分配和/或摄取。钙应优选不作为碳酸钙提供，特别是由于微弱的溶解度。如果使用相对不溶形式的钙诸如碳酸钙，则例如并行使用酸，特别是有机酸诸如乳酸、丙酸、乙酸或柠檬酸是可取的，以促进可溶性钙化合物的形成。本发明组合物可以包含例如以下浓度的钙：约5mm至约250mm，更优选约15mm至约100mm，更优选约20mm至约70mm并且最优选约30mm。例如，在钙以氯化钙的形式提供的那些实施方案中，组合物(或试剂盒)可以包含约0.3％至5％(w/v)、0.6％至3％(w/v)、0.6％至1.8％(v/w)，0.3％至0.6(w/v)，或例如0.9％(v/w)的氯化钙。最优选的浓度范围可以随着待处理的植物而稍微变化。例如，如果待处理小麦，氯化钙的范围优选为0.6％至1.2％(w/v)，最优选为0.9％(w/v)。如果待处理葡萄树，氯化钙的浓度优选在0.3至0.6％(w/v)的范围。在一些实施方案中，并且特别是在葡萄树处理的情况下，本发明的组合物也可以在每个田间季节应用多于一次。例如，它可以每个田间季节应用至少3次。
37.根据本发明的第一方面，包含微生物和/或钙的组合物(或试剂盒)可以用于改善植物健康、改善植物对植物病原体的抗性、防止或减少植物材料的真菌毒素污染、改善植物对植物疾病(例如由植物病原体引起)的抗性、用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成、用于植物保护和/或作为植物刺激剂。在组合物(或试剂盒)用于改善植物对植物病原体的抗性、改善植物对由植物病原体引起的植物疾病的抗性、或用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成的情况下，已经提到靶植物病原体可以是例如真菌。优选地，植物病原体不是纯活体营养的，而是半活体营养或死体营养的，优选半活体营养。植物病原体可以是例如针对以上提及的农作物(特别是小粒谷类、玉米和葡萄树的病原体)中的任一者的病原体。本发明的发明人特别考虑的病原体的实例是禾谷镰刀菌、葡萄霜霉病菌、白粉菌、致病疫霉、甜菜生尾孢、ramularia betae、苹果黑星菌、白叉丝单囊壳、尖孢镰刀菌和核盘菌。最优选地，植物病原体是禾谷镰刀菌和葡萄霜霉病菌。
38.根据本发明的第一方面，包含微生物和/或钙的组合物(或试剂盒)还可以用于改善植物对由植物病原体引起的植物疾病的抗性。本领域技术人员将容易地熟悉个体植物的植物疾病和植物病原体，特别是对于农作物。例如，植物疾病可以是镰刀菌赤霉病或镰刀菌穗腐病，两者均是由禾谷镰刀菌引起。此外，本发明人还考虑包含如上定义的微生物和/或钙的组合物(或试剂盒)用于改善植物对霜霉病(葡萄霜霉病菌(plasmopara viticola))或白粉病(白粉菌(erysiphe necator))抗性的应用。根据本发明，小麦或玉米针对镰刀菌赤霉病或镰刀菌穗腐病(由禾谷镰刀菌引起)抗性的改善是特别优选的。
39.优选地，根据本发明的第一方面使用的组合物(或试剂盒)不包含光养细菌，因为此类细菌对于获得期望的效果(即，用于改善植物健康、改善植物对植物病原体的抗性、防止或减少植物材料的真菌毒素污染、用于改善植物对植物疾病(例如由植物病原体引起)的抗性、或用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成)不是必需的。然而，当实施本发明的教导时，当然也不排除这种细菌的存在。
40.根据本发明的第一方面使用的组合物(或试剂盒)可以允许组合物(或试剂盒)在感兴趣的植物、植物材料或植物碎片上的任何期望应用。它可以是例如液体或粉末。优选地，组合物是液体(或试剂盒的各组分以液体形式存在)。此类液体组合物和组分可以方便地喷洒在植物(植物材料、植物碎片)上，允许组合物(或试剂盒组分)均匀分布。然而，且特别是为了储存的目的，干燥的组合物(或试剂盒组分)也是可以想到的，并且涵盖在本发明的第一方面的范围内。干燥的组合物或试剂盒组分可以例如包含冻干的微生物。
41.在第二方面，本发明涉及组合物，其包含至少两种、优选至少三种、更优选至少四种并且最优选至少五种微生物和任选地钙，其中微生物的至少一种是细菌并且至少一种是酵母(优选酿酒酵母)，并且其中细菌是乳杆菌目，并且其中组合物优选不包含沼泽红假单胞菌。根据本发明的第二方面的本发明组合物可以任选地另外包含其他细菌，诸如双歧杆菌目，特别是两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌。然而，本发明人还特别考虑不含双歧杆菌目，例如不含两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌的组合物。本发明的特别优选组合物将既不包含沼泽红假单胞菌，也不包含两歧双歧杆菌，也不包含动物双歧杆菌。另外，本发明组合物的微生物可以与以上根据本发明的第一方面的本发明用途所定义的相同。如前，根据本发明的第二方面的本发明组合物的微生物是至少两种，即至少一种细菌和至少一种酵母。优选地，本发明组合物包含多于两种微生物，诸如至少三种、至少四种或至少五种微生物，后者是最优选的。组合物可以例如包含2至5种微生物、3至5种微生物、4至5种微生物或恰好5种微生物。所选择的微生物可以自由地选自细菌(优选地沼泽红假单胞菌除外)和酵母，但是优选地，组合物包含细菌多过酵母。本发明的第二方面的本发明组合物可以主要或甚至仅包含乳杆菌目，诸如发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌或植物乳植杆菌。最优选地，根据第二方面的本发明组合物包含至少一种植物乳植杆菌株(优选亚种植物乳植杆菌植物亚种的)作为细菌。在本发明组合物包含选自双歧杆菌目的至少一种细菌的情况下，则优选地，细菌选自由两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌组成的组。在本发明的特别优选实施方案中，本发明组合物的所有细菌选自由发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌、两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌组成的组。本发明的第二方面的本发明组合物中的至少一种酵母优选是酿酒酵母。更优选地，组合物的至少两种、至少三种、至少四种或至少五种微生物选自由发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌、酿酒酵母、两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌组成的组。最优选地，组合物的至少两种、至少三种、至少四种或至少五种微生物选自由发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌和酿酒酵母组成的组。
42.本发明的第二方面的本发明组合物的不同微生物可以仅在株水平上不同，即不需要来自不同的种。例如，包含至少三种不同微生物的本发明组合物可以包含至少一种细菌和相同酵母的两种不同株，例如两种不同类型的酿酒酵母。同样，组合物可以包含至少一种酵母和相同细菌的两种不同株，例如发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌或植物乳植杆菌，特别是植物乳植杆菌(优选亚种植物乳植杆菌植物亚种的)的两种不同株。优选地，本发明的第二方面的本发明组合物包含多于一种乳杆菌株。在一些实施方案中，组合物将包含相同细菌的至少两种株，例如相同种的两种乳杆菌株，以及并行的相同酵母的两种不同株，例如两种酿酒酵母株。第二方面的本发明组合物中的特别优选细菌组合是发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌和两种不同种类的植物乳植杆菌株(优选亚种植物乳植杆菌植物亚种的)。
43.本发明的第二方面和实施例部分中例举的组合物是包含发酵粘液乳杆菌、干酪乳
酪杆菌、两种不同的植物乳植杆菌株(优选亚种植物乳植杆菌植物亚种的)和酿酒酵母的组合物。如前，对于根据本发明的第一方面的本发明用途，本发明的第二方面的组合物所需的微生物对于本领域技术人员是容易获得的。
44.第三方面，本发明涉及包含至少以下细菌的组合物：发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、两个不同种类的植物乳植杆菌株和至少两种酿酒酵母株。此类组合物还可以包含另外的细菌，例如选自由乳杆菌目、根瘤菌目和双歧杆菌目组成的组的细菌。优选地，根据本发明的第三方面的组合物主要或甚至仅包含乳杆菌目，诸如发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌或植物乳植杆菌(优选亚种植物乳植杆菌植物亚种的)。如果组合物包含选自根瘤菌目的至少一种细菌，则优选该细菌为沼泽红假单胞菌。在组合物包含选自双歧杆菌目的至少一种细菌的情况下，则优选该细菌选自由两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌组成的组。
45.本发明的第二和第三方面的组合物还可以包含钙，即以钙离子的形式。钙可以例如以氯化钙、丙酸钙、乳酸钙、乙酸钙、柠檬酸钙、碳酸钙或其混合物等形式存在。最优选其作为氯化钙、碳酸钙或丙酸钙提供。特别地，如前面已经概述的本发明用途，钙应以水溶性形式存在于本发明的第二或第三方面的组合物中，以允许组合物易于被植物或植物材料分配和/或摄取。理想地，钙不应作为碳酸钙提供，特别是由于微弱的溶解度。如果使用相对不溶形式的钙诸如碳酸钙或硫酸钙，则如果本发明组合物并行地包含酸，特别是有机酸诸如乳酸以促进可溶钙化合物的形成是可取的。本发明组合物可以包含例如以下浓度的钙：约5mm至约250mm、约15mm至约100mm、约20mm至约70mm和约30mm。例如，在钙以氯化钙的形式提供的那些实施方案中，组合物(或试剂盒)可以包含约0.3％至5％、0.6％-3％、0.6％至1.8％、0.3％至0.6％或例如0.9％的氯化钙。最优选的浓度范围可以随着待处理的植物变化。例如，如果待处理小麦，氯化钙的范围优选为0.6％至1.2％，最优选为0.9％(始终为(w/v))。如果待处理葡萄树，氯化钙的浓度优选是0.3至0.6％(w/v)的范围。
46.优选地，第二或第三方面的本发明组合物不包含光养细菌，因为此类细菌对于获得本发明的期望效果(即，用于改善植物健康、改善植物对植物病原体的抗性、防止或减少植物材料的真菌毒素污染、改善植物对植物疾病(例如由植物病原体引起)的抗性，或用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成)不是必需的。然而，当实施本发明的第二和第三方面的教导时，当然也不排除这种细菌的存在。
47.如之前根据本发明的第一方面的本发明用途，本发明的第二和第三方面的组合物可以采取允许将本发明组合物应用于植物的任何期望形式。组合物可以是例如液体或粉末。优选地，本发明组合物是液体，以允许植物或植物材料上组合物的均匀分布。然而，并且特别是为了储存目的，干燥的组合物也是可以想到的，并且涵盖在本发明的第二和第三方面的范围内。
48.本发明的第二和第三方面的组合物可以在实施本发明用途，即本发明的第一方面(见上文)或用于本发明方法(见下文)时使用。
49.在第四方面，本发明涉及试剂盒(或成套部件)，其包含至少两种、优选至少三种、更优选至少四种、甚至更优选至少五种不同的微生物，最优选甚至六种微生物和任选地钙，其中微生物的至少一种是细菌并且至少一种是酵母，并且其中细菌是乳杆菌目，并且其中试剂盒优选不包含沼泽红假单胞菌。根据本发明的第四方面的本发明试剂盒可以任选地另外包含其他细菌，诸如双歧杆菌目，特别是两歧双歧杆菌，和动物双歧杆菌。然而，本发明人
也特别考虑不含双歧杆菌目，例如不含两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌的组合物。本发明的特别优选组合物将既不包含沼泽红假单胞菌，也不包含两歧双歧杆菌，也不包含动物双歧杆菌。另外，本发明试剂盒的微生物可以与上述根据本发明的第二和第三方面的本发明组合物所定义的相同。微生物可以包含在单独的容器中，或者它们中的一些或全部可以包含在同一容器中。本发明试剂盒可以进一步包含钙，并且以上对本发明组合物所列出的内容同样适用于本发明试剂盒。钙优选在单独的容器中提供，但也可以与微生物中的一种或多种包含在同一容器中。微生物可以以干燥(例如冻干)或液体形式存在于试剂盒中。根据本发明的特别优选试剂盒是不包含沼泽红假单胞菌的试剂盒和包含发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌和两种不同种类的植物乳植杆菌株，特别是包含发酵粘液乳杆菌、干酪乳酪杆菌、两种不同种类的植物乳植杆菌株和两种不同类型的酿酒酵母的试剂盒。根据本发明的本发明试剂盒可以例如用于产生根据本发明的第二或第三方面的组合物，并且还可以用于实施根据本发明的第一方面的本发明用途。在试剂盒包含植物乳植杆菌的实施方案中，其优选包含植物乳植杆菌植物亚种。
50.在第五方面，本发明涉及包括将组合物或试剂盒应用于活的植物和/或植物碎片的步骤的方法，该组合物或试剂盒包含：
51.a)至少两种、优选至少三种、更优选至少四种、甚至更优选至少五种不同的微生物，其中微生物选自细菌和酵母，其中微生物的至少一种是细菌并且至少一种是酵母(优选酿酒酵母)，并且其中细菌选自由乳杆菌目、根瘤菌目和双歧杆菌目组成的组，和/或
52.b)钙，其中钙以氯化钙、碳酸钙、乙酸钙、柠檬酸钙、丙酸钙或乳酸钙，特别是氯化钙、碳酸钙或丙酸钙的形式存在。
53.在根据本发明的第五方面的本发明方法的上下文中，组合物可以是如在本发明的第一方面的上下文中所定义的组合物或根据本发明的第二或第三方面的组合物。试剂盒可以是例如根据本发明的第四方面的试剂盒。植物(和相应的植物碎片)也可以是(即，与本发明的第一方面类似)受益于本发明方法处理的任何类型的植物。优选地，植物是农作物。特别优选的植物是选自由小粒谷类、玉米和葡萄树组成的组的植物。本发明人特别设想将上述方法应用于选自由小麦、大麦、燕麦、黑麦、小黑麦、玉米、葡萄树、马铃薯、甜菜、洋葱、苹果、油菜或向日葵，特别是由小麦、玉米、葡萄树、马铃薯、甜菜、洋葱、苹果、油菜和向日葵组成的组的植物(和相应植物的植物材料等)。最优选地，植物选自小麦和葡萄树。
54.根据本发明的方法可以例如是用于改善植物健康的方法、用于改善植物对植物病原体的抗性的方法、用于防止或减少植物材料的真菌毒素污染的方法、用于改善植物对植物疾病(例如由植物病原体引起)抗性的方法和/或用于防止植物病原体在植物碎片上的子囊壳形成的方法。
55.本发明的方法可以涉及将包含如上定义的微生物的组合物(或试剂盒)应用于感兴趣的植物或植物碎片，以及将包含如上定义的钙的组合物应用于感兴趣的植物或植物碎片。该方法还可以涉及将两者，即微生物和钙应用于感兴趣的植物，其中对感兴趣的植物的应用可以并行发生(例如通过包含在相同的组合物中或通过并行应用但是来自不同的容器中)。在替代物中，组合物或试剂盒可以以序贯方式应用于感兴趣的植物或植物碎片，例如以一种、多于一种或所有的微生物开始并且随后应用钙(相反的顺序当然也是可能的)。
56.优选地，组合物或试剂盒的组分以液体形式应用于植物或植物碎片上。特别优选
的应用模式中将组合物或试剂盒的组分应用于植物的穗(前提是植物具有穗，诸如在小麦和玉米的情况下)，或者通过将组合物或试剂盒的组分应用于植物的叶。在将组合物或试剂盒的组分应用于植物的叶(诸如在小麦和玉米的情况下)的实施方案中，如果在穗出现之前，例如提前两到三天，将组合物或试剂盒的组分应用于植物，这是优选的。
57.此外，本发明的方法还涵盖将组合物或试剂盒的组分应用于植物碎片(即死亡的植物材料)。这将通常在收获后和留在田地中的植物碎片上完成。通常，这将发生在下一个生长季节之前。下一个生长季节不一定要依赖同一种植物。例如，植物碎片可以是玉米的植物碎片，并且下一个生长季节可以涉及在相同(或相邻)田地上生长小麦。
58.当本发明的方法涉及包含氯化钙的组合物(或试剂盒)时，该组合物(或试剂盒的钙组分)优选以约5mm至约250mm，更优选约30mm至约100mm应用于植物生长(或植物碎片所位于)的田地。例如，在钙以氯化钙形式提供的那些实施方案中，组合物(或试剂盒)可以包含约0.3％至3％的氯化钙。最优选的浓度范围可以随着待处理的植物而稍微变化。
实施例
59.在下文中，呈现说明本发明的各种实施方案和方面的具体实施例。然而，本发明的范围不应受到本文所描述的具体实施方案的限制。实际上，除了本文所描述的那些，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述、附图和下面的实施例中变得显而易见。所有此类修改落入所附权利要求的范围内。
60.表1.所使用组分的概述
[0061][0062]
实施例1：微生物和钙对活的谷类植物(小麦)的作用
[0063]
1.1小规模田地实验季节1
[0064]
两个冬小麦品种(“lennox”和“capo”)和2个春小麦品种(“trappe”和“kronjet”)播种在1m2地块(96个地块/品种)中。第一个小规模田地季节的实验设计是完全随机的块，分别具有3次重复。在这些实验中，用感兴趣的品种处理完整的地块(1m2)。
[0065]
使用了用于人工接种的特定技术以尽可能接近地模拟自然镰刀菌感染过程：所谓的核-产卵法(kernel-spawn method)。将禾谷镰刀菌(f.graminearum)定殖的玉米粒在开花前约3周分布在小麦植株之间的土壤表面(约15gr/m2)。在果仁上产生子囊壳，该子囊壳将子囊孢子排出到空气中。这些孢子感染小麦穗，导致在较长时间周期内持续的感染压力，并且因此接近地模仿自然感染过程。为了支持感染，对整个实验进行喷雾灌溉，为疾病的萌生提供足够的湿度。
[0066]
表2汇总了实施例1.1中使用的所有原型。实验变体w1含有微生物种(见表1)。变体w2-w4用阳离子ca
2+
、mg
2+
和si
3+
处理。它们仅应用于穗上。本发明人特意选择高浓度的阳离子以确保看到效果(如果存在)，然而不能太高以防止由过量阳离子浓度引起的植物毒性反应。
[0067]
表2.第一个小规模田地实验的设置的汇总
[0068][0069]
在小麦穗的约50％抽穗(heading)后和开花前不久(约2-3天)对穗进行处理。在这种情况下，测试物质可以通过sir的诱导起作用。但是由于与测试有机体/钙的物理接触，与植物病原体的直接相互作用也是可能的。可以用这种方法测试其他拮抗机制，包括对病原体的直接抑制或对营养的竞争。为此，使用手动喷雾器以应用100ml/地块的悬浮液/溶液。对于每种小麦基因型，发明人使用每种处理的3个重复和10个对照地块。所有处理在每个小麦基因型内完全随机化。在小麦品种的开花期间，将实验每隔一天喷雾灌溉一次，持续约20小时，每20分钟重复20秒的水脉冲，以促进镰刀菌感染。接种物以起源于子囊壳的子囊孢子的形式连续产生，该子囊壳在分布于土壤表面的镰刀菌(玉蜀黍赤霉(gibberella zeae))定殖的核上发育。
[0070]
表3表示在开花后21天评估的fhb症状减少的数据。对地块中的所有主穗(从96到225穗)进行fhb症状评估，并计算病穗的百分比。对照中的疾病发生率(病穗)设定为100％，并且处理的数据表示为未处理对照的百分比。例如，对于杀真菌剂处理(ppp)(活性成分：戊唑醇，bayer crop science)，相对于所有基因型的对照，平均症状水平为32％(数据未显示)：这表示与对照相比68％的症状的减少。对疾病发生率数据进行anova分析。
[0071]
表3.第一个小规模田地实验的结果的汇总。
[0072]
[0073]
***，p≤0.001(高度显著)；**，p≤0.01；*，p≤0.05；+，p≤0.10；ns，p》0.10(不显著)
[0074]
结果汇总如下(见表3)：
[0075]
1)杀真菌剂(ppp)显示出最大的症状减少：与对照处理相比68％的减少。
[0076]
2)微生物处理变体w1将症状减少了23％。
[0077]
3)含有钙的变体w2导致fhb的症状显著减少29％。
[0078]
4)硅和镁对fhb症状减少没有影响，即使在以高浓度应用时。
[0079]
1.2小规模田地实验季节2
[0080]
在第二个小规模田地季节中，再次研究了第一个田地实验中包含钙和微生物组分的最有效的处理，现在与表4中列出的新原型处理组合。测试和分析方法与第一个实验中所描述的相同，但有以下例外：
[0081]
在第二季节中，仅处理了地块的一半(3行(row))，而地块的第二半不处理，作为正在研究的原型的直接对照(5次重复)。由于穗出现期间具有挑战性的天气状况，最终仅可以评估一个品种“trappe”的fhb症状(表5)。
[0082]
表4.第二个田地实验的设置的汇总。
[0083][0084][0085]
在该实验中，将微生物株数量减少的新组合物与钙(w6)组合使用。此外，分析了单一株对fhb减少的潜在影响(w12-23)(见表4)。一方面，筛选为微生物组分b的一部分的所有单一株。此外，还评估了从公共仓库购买的来自同一属的其他单一株对fhb症状减少的潜在
影响。最后，还将另一种钙变体，来自天然资源的碳酸钙(caco3)对于症状减少(w25)进行了测定。
[0086]
表5.第二个田地实验的结果的汇总。
[0087][0088][0089]
结果，当应用单一微生物株(w12-w23)时，没有观察到症状的显著减少(见表5)。单独使用碳酸钙将fhb症状减少13％，而微生物成分b与cacl2的组合将症状减少28％。在该田地实验中，总体感染压力高，由于化学品将fhb症状减少不超过58％。
[0090]
1.3温室实验1
[0091]
将两个小麦品种(“remus”，春小麦，对镰刀菌赤霉病(fhb)敏感，和“capo”，冬小麦，中等抗性)播种在温室中的盆中(10株/盆，装有7l基质)。基质是堆肥、泥炭和沙子的混合物。在分蘖期应用矿物质肥料。对于每个处理，随机选择4个盆并以相同的方式处理。将4个花盆视为单个条目，并在温室中共同放置和评估(作为由4个相邻盆组成的二次单元)。在实验中，使用3至4个重复(每个单位为四个盆)。
[0092]
用气泡培养法在绿豆汤中生产植物病原体禾谷镰刀菌的孢子悬浮液，并将小等分试样在-80℃下冷冻直至使用。最终的孢子悬浮液含有20.000(用于“remus”的低浓度)或
50.000(用于“capo”的高浓度)镰刀菌大分生孢子/ml。
[0093]
为了能够处理穗，将该面积(0.038m2/盆)所需的产品的量悬浮在20ml水中。通过在抽穗后但在开花前至少2-3天将悬浮液喷洒在穗上来施用测试有机体/阳离子。将部分叶冠被弄湿(特别是旗叶)。这是对每个盆单独操做。通过这种策略，可以测试若干拮抗剂机制的组合，包含系统诱导抗性(sir)的诱导，还包含直接拮抗作用，例如对营养的竞争以及对病原体(钙)的直接抑制。
[0094]
在开花时，用镰刀菌孢子悬浮液处理每个盆中的穗。为此，用手动喷雾器将20ml的低或高浓度的孢子悬浮液应用于每个盆中的开花穗上。随后，用塑料袋覆盖穗24或48小时，以确保足够的湿度进行感染。在实验期间，温室内的温度为18/20℃(夜间/白天)，并且植物每天光照16小时。
[0095]
表6.第一个温室实验的设置的汇总
[0096][0097]
在第一个温室实验中，微生物组分b和cacl2的组合在不同的cacl2浓度(w5-6)下进行测试(见表6)。此外，测试了另外的钙变体，其包括在与丙酸的混合物中的caco3，从天然来源产生丙酸钙(w7-8)。实验还包含未处理的对照用于参考。
[0098]
在接种后7、11、15和18/19天，评估2个疾病参数：疾病发生率(病穗％)和疾病严重性(仅病穗的患病小穗(spikelet)％)。此后，计算疾病强度(所有穗上患病小穗％)。最后，对每个疾病参数计算症状的减少％(相比于对照处理)。进行anova分析用于统计分析。
[0099]
表7.第一个温室实验的结果的汇总
[0100]
[0101]
结果，仅一种含有丙酸钙的原型(w8)与组分b的组合对fhb的症状减少没有统计学显著作用。所有其他原型导致疾病强度的减轻。总体而言，包含氯化钙的变体(w5-6)在减少疾病症状中表现更好。然而，如原型w6所示，cacl2的输入从5l/ha到3l/ha的减少，相比于具有45.7％的减少的w5，导致甚至改善了结果并减少了72.4％的疾病强度。
[0102]
1.4温室实验2
[0103]
该实验以与第一个温室实验(见1.3)相同的方式进行和评估，但在该实验中具有例外，包括两个春小麦品种capo和remus。
[0104]
表8.第二个温室实验的设置的汇总
[0105][0106]
在该实验中，微生物组分b再次与包含cacl2(w6)、caco3(w9)或丙酸钙(w10-11)的不同钙变体组合，同样对比杀真菌剂folicur(见表8)。
[0107]
表9.第二个温室实验的结果的汇总
[0108]
[0109][0110]
类似地，如在第一个温室实验中，微生物组分b与不同钙变体的组合显示出作用(见表9)，其中cacl2产生最高的减少(w6，39.7％)，单独的caco3(w9)产生26.5％的较不明显的减少，caco3加丙酸(w10)产生21％的轻微减少(w10)或没有显著减少(w11)。杀真菌剂folicur使症状减少82.4％。
[0111]
1.5温室实验3
[0112]
第三个温室实验基本上以与第一个温室实验(见1.3)相同的方式进行和评估，但在该实验中具有例外，仅使用冬小麦品种capo。
[0113]
表10.第三个温室实验的设置的汇总
[0114][0115]
在第二个温室实验中，微生物组分b再次与包含cacl2(w6)、caco3(w9、w24)或丙酸钙(w10)的不同的钙变体组合，同样对比杀真菌剂folicur(见表10)。
[0116]
表11.第三个温室实验的结果的汇总
[0117][0118][0119]
类似地，如在第一和第二个温室实验中，微生物组分b与不同钙变体的组合显示出作用，其中cacl2产生最高疾病强度的减少(w6，47,9％)，几乎达到ppp(的水平54,6)(见表
11)。在该实验中，单独的caco3(w9)仅显著减少疾病严重性，而不是总体强度，较低浓度的单独caco3没有显著效果(w24)。caco3加丙酸(w10)再次显示出疾病强度减少27.6％。
[0120]
1.6大规模田地实验季节1
[0121]
这些实验的目的是在真实的实际条件下测试有希望的组分。这意味着农民用他们自己的设备来应用原型。农场位于奥地利的3个重要气候区中：北阿尔卑斯地区(潮湿和温暖)、pannonicum(干燥和炎热)和illyricum(潮湿和炎热)。这种方法给出了原型在不同环境条件下有效性的很好的概述。选择用于测试的田地是用于耕作的普通田地。在所有情况下，前茬作物都是玉米，这导致下一季小麦中镰刀菌感染的概率更高。
[0122]
开始使用具有适当统计设计的重复良好的实验。这包含重复(通常3至4次)，并注意在处理的变体(原型w6)附近具有各自的对照(＝无处理)。在50％抽穗期或此后不久，但不迟于开花前2-3天，以规定的浓度(以l/ha计)将原型应用于穗部。镰刀菌感染是在自然条件下发生的，因此没有使用镰刀菌孢子进行人工感染。根据开花期间不同的气候条件，地点之间的感染压力不同，总体镰刀菌感染率从低到高不等。
[0123]
开花后两到三周，评估对fhb疾病。为此，对每个条目的多达500个穗进行典型fhb症状的目视评估，包含水浸斑和疾病的传播(枯萎的小穗或穗段)。将每个穗分类为患病或健康，并计算疾病发生率(di＝病穗的百分比)。计算症状的减少的百分比(相比于对照)。
[0124]
表12.大规模田地试验的结果的汇总
[0125][0126][0127]
结果(见表12)显示，相比于未处理的对照，在原型w6中使用的微生物和含钙组分的组合导致所有地点中fhb症状的减少。根据田地中气候条件和感染压力，在低至中等感染压力的地点，fhb症状分别减少49.7％和45.7％。在高镰刀菌感染压力下，仍然可以观察到22.8％的fhb症状减少。总体而言，用原型w6获得的结果与所使用的所有不同测试系统和基因型(从温室到大规模田地)都相当好地对应。
[0128]
1.7大规模田地实验季节2
[0129]
在第二个大规模田地季节中，再次研究了包含钙和微生物组分的第一个田地实验的处理。测试和分析的方法与第一个实验中所描述的相同，但有以下例外：
[0130]-仅上奥地利州的一个地点被纳入分析，因为该国其他地区严重干旱，观察不到镰刀菌感染。
[0131]-这次，试验包含2个处理变体：(1)如1.6中所描述的单一处理和(2)在旗叶出现时
(大约bbch 37-39)和在50％穗出现时(大约bbch 55)或之后不久的双重处理。
[0132]-为此，对每个条目的250个穗进行典型fhb症状的目视评估，包含水浸斑和疾病的传播(枯萎的小穗或穗段)。
[0133]
表13.季节2中大规模田地实验的设置和结果的汇总
[0134][0135]
在第二季中，大规模田地试验的结果汇总于表13中，并再次显示约30％的症状的减少，即使在高感染压力下用原型w6的单次应用。原型w6双重应用导致68％的高度显著的症状减少。同样，这些数据与在先前试验中和在不同测试条件下观察到的数据一致。
[0136]
实施例2：微生物和钙对作物碎片上子囊壳生产的作用
[0137]
减少真菌的初级接种物是控制镰刀菌赤霉病疾病的重要策略之一。禾谷镰刀菌(f.graminearum)在冬季期间腐生在作物残留物上。在真菌子实体(子囊壳)的子囊内形成的玉蜀黍赤霉(gibberella zeae)(＝禾谷镰刀菌的完全形式)的子囊孢子(有性孢子)作为春季的主要接种物。子囊孢子被迫从子囊壳排出，落在植物的易感部位并开始感染。因此，抑制上一季谷类和玉米作物的镰刀菌污染的作物碎片上的子囊壳产生，导致减少新作物的感染。
[0138]
因此，本发明人旨在鉴定抑制作物碎片上产生子囊壳的手段。
[0139]
对于田地实验，首先将玉米秸秆切成7cm长的段，然后将每一段纵向切成两半。将三个茎段的一半放置于10cm耐高压加热的塑料网袋中，并将相同段的相应一半放置于单独的袋中，该袋以容易识别相同茎段的两个对应等份的方式进行标记，用于实验评价。一袋用于拮抗剂治疗，另一袋充当对照。对于每个处理或对照，使用12个含有总共36个茎段(36个重复)的袋。将袋中的段浸入蒸馏水中过夜，倒出水后，放入铝盘中并且随后高压灭菌。然后将袋浸入强子囊壳产生的玉蜀黍赤霉(g.zeae)株的分生孢子悬浮液(3
×
104个孢子/ml)中3分钟。将接种的段在22℃黑暗中温育48小时。
[0140]
表14.在玉米秸秆上的子囊壳测定中测定的变体的汇总
[0141][0142]
为了处理，两个相应的袋中的一个用各自的原型变体(见表14)喷洒，直到流出，第二个袋仅用无菌蒸馏水喷洒。将袋在室温(rt)实验室中放置过夜，并且第二天转移到小麦或玉米田地中，并随机放置在小麦或玉米植物之间的土壤表面上。3-4周后，对袋进行评估，
并对玉米秸秆表面1cm2的总面积内的子囊壳数量进行计数。
[0143]
然后通过与对照比较来计算处理中子囊壳减少的百分比。进行anova分析以统计分析。
[0144]
表15.玉米秸秆上的子囊壳测定结果
[0145]
使用的原型处理的组织子囊壳的减少(％)对照玉米秸秆-化学品ppp玉米秸秆48,74***m1玉米秸秆69,79***m2玉米秸秆60,09**
[0146]
结果，含钙的m1使田地中玉米秸秆上的子囊壳数量减少约70％，并且微生物组合物m2将子囊壳形成抑制了60％(见表15)。商业化学杀菌剂ppp减少子囊壳数量仅约49％。
[0147]
实施例3：微生物和钙对农作物中其他疾病的作用
[0148]
3.1葡萄树中的霜霉病(downey mildew)
[0149]
本发明人还观察到，单独或组合的微生物和钙降低了其他疾病对其他作物的疾病压力。对霜霉病(葡萄霜霉病菌(plasmopara viticola)，“peronospora”)和白粉病(白粉菌(erysiphe necator)；“oidium”)和洋葱中的尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)得到各自的结果。
[0150]
用于减少霜霉病症状的示例性测试如下在葡萄树叶盘上进行。首先用原型接种10个叶盘20分钟，然后用真菌的孢子悬浮液(20000个孢子囊/ml)处理，直到游动孢子从孢子囊中释放。然后，将叶盘置于水琼脂平板上，并在23℃温育5天(16小时光照/8小时黑暗)。因此，通过测量病变盘面积的百分比来计算疾病的严重性。通过使用水或通过应用基于铜的、市售植物保护产品cuprozin包含对照处理。
[0151]
表16.葡萄树叶盘测定中测试的变体的汇总。
[0152][0153][0154]
表17.按疾病严重程度描述的不同处理对葡萄霜霉病的作用的汇总。
[0155][0156]
这些数据表明，微生物的组合物以及钙离子对各种植物疾病和病原体有效，并且当组合应用时，这种效果更强且更显著(见表17)。
[0157]
3.2甜菜中的叶斑病
[0158]
甜菜生尾孢(cercospora beticola)和ramularia betae是甜菜中叶斑病的致病真菌。在真实的实际条件下，在下奥地利州地区进行了控制甜菜中叶斑病的示例性测试。这意味着农民用他们自己的设备来应用原型。选择用于测试的田地是用于耕作的普通田地。
[0159]
用原型w6处理两个相邻的行，具有组分a的浓度降低到2l/ha的例外。在整个季节的历程中，总共进行了4-5次w6处理，以围绕bbch39开始，最后的应用围绕bbch85。第二行用常规植物保护计划处理，其使用3-5次商业杀真菌剂的处理。
[0160]
自然感染发生在整个田地季节的历程，但由于大降雨，特别是在8月和9月初。
[0161]
症状的评估和评价基于由eppo指南pp1-4-甜菜叶疾病(foliar diseases of sugar beet)建议的标度法(scaling procedure)。对每个处理位置彼此相邻的20株植物进行了评价。只考虑中年叶用于评估，对每株植物的7-15片叶之间进行症状评价。每个处理的疾病发生率计算为超过得分植物的加权平均值(％)。
[0162]
表18.两种不同处理对甜菜中叶斑病的作用的汇总
[0163][0164]
杀真菌剂处理的甜菜显示出1,19％的非常低水平的叶斑病致病真菌感染。用原型w6处理也导致3,75％的低水平的感染，即使田地季节期间的天气条件非常有利于真菌生长(表18)。