一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法

1.本发明属于植物组织和细胞工程技术领域，具体涉及一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法。


背景技术：

2.橡胶树(hevea brasiliensis muell.arg.)属大戟科橡胶树属，是多年生的异花授粉乔木。其所产的天然橡胶是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。而通过体细胞胚发生途径来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。现有技术中，橡胶树经体细胞胚发生途径获得再生植株主要采用1.花药培养、2.内珠被培养和3.次生体胚循环增殖。
3.1.橡胶树花药培养技术是以处于单核期的橡胶树雄花为外植体，剥离雄蕊，接种于诱导愈伤培养基中诱导愈伤组织，再将愈伤组织接种于诱导体胚培养基诱导体胚发生，最后将成熟胚状体接种于植株再生培养基中诱导出完整小植株。2.橡胶树内珠被培养技术是以橡胶树授粉后45-75d天的幼果中的内珠被为外植体，诱导愈伤组织，再经愈伤组织分化体胚，最后由成熟的胚状体分化成植株。3.次生体胚循环增殖是以花药或内珠被诱导的初生胚为外植体，将胚状体切成2-3mm小块，诱导次生胚，此过程循环，直至获得足够量胚状体，最后诱导植株再生。
4.以上所说的再生技术体系均存在以下缺陷：
①
花药、内珠被再生体系：外植体的来源易受到季节和时间的制约，无法做到全年培养。橡胶树每年有三个花期，分别为春花、夏花和秋花，每次进行花药培养的时间有限。一般来说，橡胶树的春花的自然授粉的比率比夏花、秋花要高，因此内珠被的取材时间一般为春花自然授粉后45-75d也就是在中国海南每年的5月中旬至6月中旬为采样进行内珠被培养的最佳时期，这种较短的取材时间严重制约了内珠被的培养。(孙爱花等，橡胶树花药的培养，植物生理学通讯，2006，42(4)：785-789；黄天带等，橡胶树内珠被研究进展，生命科学研究，2011，15(2)：176-183)。
②
次生体胚循环增殖体系：次生体胚在室内扩繁逐渐累积激素，可能造成变异。
5.这些缺点制约了橡胶树遗传转化体系的建立，因此必须在橡胶树中建立一种不受采样时间限制的体细胞胚胎发生技术体系，(1)突破橡胶树组织培养外植体来源的限制，可为将来新品种、转基因或基因编辑植株的早期扩繁提供技术基础；(2)为橡胶树自根幼态无性系规模化繁育及转基因育种提供新的组培体系。大田、苗圃茎段腋芽嫩叶是理想的外植体来源，四季均可获得，然而目前并无该外植体的再生体系报道，本发明为建立室外来源的腋芽嫩叶再生体系奠定技术基础。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，以切除顶芽及子叶以下根部的，橡胶树无菌试管苗茎段诱导出的，新生腋芽嫩叶作为外植体，通过体细胞发生途径获得橡胶树再生植株。本发明的方法不受采样时间和季节的
限制，取材方便，材料丰富，可以完整保持母本植株的遗传稳定性。
7.为实现上述目的，本发明提供一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，具体包括以下步骤：
8.(1)植株预处理：选取橡胶树无菌试管苗，去除顶芽及子叶以下的根部，切成1-2cm的茎段，每个茎段均带有一个或多个腋芽；
9.(2)腋芽诱导：将步骤(1)得到的带有腋芽的茎段，接种到腋芽诱导培养基中，诱导腋芽萌发至1-2mm；
10.(3)外植体的选取：轻轻分离步骤(2)萌发出腋芽的茎段，剥离出新萌发的腋芽嫩叶作为外植体；
11.(4)愈伤组织诱导：将步骤(3)剥离得到的腋芽嫩叶接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养，得到黄色且结构较为疏松的颗粒状组织；
12.(5)继代培养：将步骤(4)得到的疏松的颗粒状组织接种于继代培养基中，进行培养，得到淡黄色且结构较为致密的颗粒状状组织；
13.(6)体胚诱导：将步骤(5)得到的致密的颗粒状组织接种于胚状体诱导培养中，进行培养，得到胚状体；
14.(7)植株诱导：将步骤(6)得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株。
15.在一优选的实施方式中，所述步骤(1)中，选取的橡胶树无菌试管苗其物候期为稳定期的植株。
16.在一优选的实施方式中，所述步骤(2)中，诱导腋芽萌发的条件为：将切好的1-2cm带有腋芽的茎段接种到腋芽诱导培养基中，在24-28℃条件下，暗培养3-20d；
17.所述腋芽诱导培养基是以ms培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤1-2mg/l，蔗糖20-40g/l，phytagel2.2g/l，补充蒸馏水至1l；调培养基的ph至5.8-6.2。
18.在一优选的实施方式中，所述步骤(3)中，分离新萌发的腋芽嫩叶可以采用任何本领域技术人员所知晓的方式，只要能剥离出嫩叶即可；优选的，在无菌环境中，将萌发后腋芽置于体视显微镜下剥离出嫩叶；而作为外植体的嫩叶可以为完整叶片或者嫩叶的一部分。
19.在一优选的实施方式中，所述步骤(4)中，愈伤组织诱导条件为：在24-28℃条件下，暗培养60-70d；所述愈伤组织培养基选自a培养基或b培养基中的一种；
20.其中，a培养基是以ms培养基为基础培养基，附加2，4-d 1-2mg/l，萘乙酸0.5-1.5mg/l，激动素1-2mg/l，天冬酰胺0.3g/l，肌醇0.1g/l，蔗糖50-70g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6.2；
21.b培养基是以ms培养基为基础培养基，附加毒莠定12-24mg/l，6-苄基氨基嘌呤0.5-2mg/l，蔗糖50-70g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l；补充蒸馏水至1l；调培养基的ph至5.8-6.2。
22.经实际观察验证，a、b两种培养基均可诱导出长势良好的愈伤组织，诱导出的愈伤组织的状态与结构上并无明显区别，a培养基诱导的愈伤组织生长量较b培养基诱导的愈伤组织要多，b培养基原料更为精简。
23.在一优选的实施方式中，所述步骤(5)中，继代培养条件为：在24-28℃条件下，暗
培养50-60d；
24.所述继代培养基是以ms培养基为基础培养基，附加蔗糖20-30g/l，活性炭15-20g/l,phytagel 2.2g/l，补充蒸馏水至1l；调培养基的ph至5.8-6.2。
25.在一优选的实施方式中，所述步骤(6)中，体胚诱导条件为：在24-28℃条件下，培养50-60d；
26.所述的胚状体诱导培养基是以ms培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤0.5-2mg/l，细胞激动素1-3mg/l，2，4-d 0.02-0.06mg/l，赤霉素0.3-0.8mg/l，肌醇0.1g/l，活性碳0.1％(w/v)，蔗糖50-70g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l，补充蒸馏水至1l；调培养基的ph至5.8-6.2。
27.在一优选的实施方式中，所述步骤(7)中，植株诱导条件为：在24-28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的led灯珠按7：1数量共组成84个led灯珠，总光照强度为3500-3800lux，光照周期为12/12h(光照/黑暗)的光照条件下培养30-40d。
28.所述的胚状体诱导培养基是以ms培养基为基础培养基，附加细胞激动素0.2-0.5mg/l，赤霉素2-3mg/l，吲哚乙酸0.1-0.3mg/l，肌醇0.1g/l，活性碳0.1％(w/v)，蔗糖30-50g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l，补充蒸馏水至1l；调培养基的ph至5.8-6.2。
29.与现有技术相比，根据本发明的一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法具有如下优点：
30.1、本发明中，所用的外植体来源不受采样季节限制，可以全年不间断的进行橡胶树试管苗生产，克服了现有技术中，对外植体取材时间和季节上的制约。
31.2、本发明中所用的外植体取材方便，材料丰富，可以完整保持母本植株的遗传稳定性，尤其适合大规模培育。
32.3、本发明还提供了一种新型的橡胶树体胚发生途径，为橡胶树自根幼态无性系规模化繁育及转基因育种提供新的组培体系，对我国橡胶树产业发展及基因育种具有重要意义。
附图说明
33.从下面结合附图对本发明实施例的详细描述中，本发明的这些和/或其它方面和优点将变得更加清楚并更容易理解，其中：
34.图1为植株预处理步骤中，所选取的1-2cm带双芽的稳定期橡胶树无菌试管苗茎段；
35.图2为诱导腋芽的萌发后所选取的外植体，即橡胶树无菌试管苗茎段萌发的1-2mm腋芽嫩叶；
36.图3为愈伤组织诱导步骤中，得到的黄色且结构较为疏松的颗粒状愈伤组织；
37.图4为继代培养步骤中，得到的淡黄色且结构较为致密的颗粒状愈伤组织；
38.图5为体胚诱导步骤中，得到的橡胶树腋芽嫩叶的心型胚；
39.图6为体胚诱导步骤中，得到的橡胶树腋芽嫩叶的双子叶型胚；
40.图7为植株诱导步骤中，由双子叶型胚萌发形成的古铜期橡胶树试管苗；
41.图8为植株诱导步骤中，得到的橡胶树腋芽嫩叶淡绿期试管苗；
42.图9为不同腋芽嫩叶大小诱导的愈伤组织，其中，a为1-2mm长度的腋芽嫩叶所诱导
的愈伤组织，b为2-3mm的腋芽嫩叶所诱导的愈伤组组织。
具体实施方式
43.若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
44.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到；
45.本实施例中，所用的橡胶树试管苗名称为：无菌橡胶树试管苗商业化品种热研917，来源为：中国热带农业科学院橡胶研究所天然橡胶新型种植材料创新基地；
46.本实施例中，所述“常规方法对培养基进行灭菌”，均是指采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，即在1.05kg/cm2蒸汽压力下于121℃灭菌20分钟。
47.实施例
48.(1)植株的预处理：选取无菌橡胶树试管苗商业化品种热研917，选取物候期为稳定期的无菌橡胶树试管苗，用无菌医用手术刀切除顶芽及子叶以下的根部，去除茎段上已着生的叶子，将试管苗切成1-2cm带有腋芽的茎段(如图1所示)。将带有腋芽的茎段，接种到腋芽诱导培养基上，诱导腋芽的萌发。
49.(2)腋芽嫩叶诱导：将切好的橡胶树茎段接种于腋芽诱导培养基中，于24-28℃暗培养3-20d。腋芽嫩叶诱导培养基是以ms培养基为基础培养基，附加6-ba(6-苄基氨基嘌呤)1-2mg/l，蔗糖20-40g/l，phytagel 2.2g/l；补充蒸馏水至1l。灭菌前调培养基的ph至5.8。按照常规方法对培养基进行灭菌。
50.(3)愈伤组织诱导：将诱导出腋芽的茎段于无菌条件下置于体视显微镜中，剥离新萌发腋芽嫩叶作为外植体(如图2所示)，将剥离得到的嫩叶接种于愈伤组织诱导培养基中，于24-28℃条件下，暗培养60-70d，得到黄色且结构较为疏松的颗粒状组织(如图3所示)；
51.愈伤诱导培养基以a培养基或b培养基中的一种；
52.其中，a培养基是以ms培养基为基础培养基，附加2，4-d 1-2mg/l，萘乙酸0.5-1.5mg/l，激动素1-2mg/l，天冬酰胺0.3g/l，肌醇0.1g/l，蔗糖50-70g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l；调培养基的ph至5.8-6.2；
53.b培养基是以ms培养基为基础培养基，附加毒莠定12-24mg/l，6-苄基氨基嘌呤0.5-2mg/l，蔗糖50-70g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l；补充蒸馏水至1l；调培养基的ph至5.8-6.2。
54.(4)继代培养：将黄色且结构较为疏松的颗粒状愈伤组织接种于继代培养基中，在24-28℃条件下，暗培养50-60d，得到淡黄色且结构较为致密的颗粒状状组织(如图4所示)；
55.继代培养基是以ms培养基为基础培养基，附加蔗糖20-30g/l，活性炭15-20g/l，phytagel 2.2g/l；补充蒸馏水至1l。灭菌前调培养基的ph至5.8。按照常规方法对培养基进行灭菌。
56.(5)体胚诱导：将淡黄色且结构较为致密的颗粒状状组织接种于体胚诱导培养基中，在24-28℃条件下，暗培养30-40d，可获得心型胚(如图5所示)；继续暗培养10-20d时，可获得双子叶型胚(如图6所示)，体胚诱导共计培养50-60d；
57.体胚诱导培养基是以ms培养基为基础培养基，附加6-ba 0.5-2mg/l，kt 1-3mg/l，
2，4-d 0.02-0.06mg/l，ga3(赤霉素)0.3-0.8mg/l，肌醇0.1g/l，活性碳0.1％(w/v),蔗糖50-70g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l；补充蒸馏水至1l；灭菌前调培养基的ph至5.8；按照常规方法对培养基进行灭菌。
58.(6)植株诱导：将成熟的双子叶型胚接种于植株诱导培养基中，于24-28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的led灯珠按7：1数量共组成84个led灯珠，总光照强度为3500-3800lux，光照周期为12/12h(光照/黑暗)的光照条件下培养13-17d，植株长出古铜期叶片(如图7所示)，继续培养13-27d，叶片由古铜期变为淡绿期，形成完整的植株(如图8所示)，植株诱导共计培养30-40d；
59.植株诱导培养基是以ms培养基为基础培养基，附加kt 0.2-0.5mg/l，ga3 2-3mg/l，iaa(吲哚乙酸)0.1-0.3mg/l，肌醇0.1g/l，活性碳0.1％(w/v)蔗糖30-50g/l，椰子水5％(v/v),phytagel 2.2g/l；补充蒸馏水至1l；灭菌前调培养基的ph至5.8。
60.对比例
61.1.不同物候时期橡胶试管苗对腋芽嫩叶萌发的影响
62.根据橡胶树无菌试管苗的叶子形态进行分类，可划分为四个物候时期，分别为古铜期、变色期、淡绿期、稳定期。古铜期试管苗存在的时间较为短暂，取材的难易程度上不如其他时期容易。因此，选取变色期、淡绿期、稳定期测试橡胶试管苗对腋芽嫩叶萌发的影响，结果如表1所示。
63.由表1可以看出，稳定期的试管苗做茎段诱导腋芽萌发，可获得相较于其他时期更高的腋芽嫩叶萌发率。而且，稳定期属于橡胶树无菌试管苗生长的最后一个阶段，处在这一阶段的橡胶树无菌试管苗具有根壮、茎粗、叶大且呈深绿色的形状特征，更适宜培育。
64.表1不同物候时期橡胶试管苗对腋芽嫩叶萌发的影响
[0065][0066][0067]
2.不同茎段长度对橡胶树腋芽嫩叶萌发的影响
[0068]
选取橡胶树无菌试管苗，去除顶芽及子叶以下的根部，切成带单芽1cm、带双芽1cm、带双芽2cm及保留母株，仅截断顶芽，4种试验处理，每次试验重复三次，试验数据经过sas软件统计分析可知(表2)，在5％及1％的显著水平下，4种试验处理具有显著性差异，其中，带单芽1cm的腋芽嫩叶的萌发率最高，达80％以上。同时在实际操作及根据橡胶树无菌试管苗的芽点分布情况来看，在相同的条件下，为获得较多的嫩叶材料，茎段可选择1-2cm之间带双芽的茎段。
[0069]
表2不同茎段长度对橡胶树腋芽嫩叶萌发的影响
[0070]
试验处理腋芽嫩叶平均萌发率100％5％显著水平1％显著水平带单芽1cm80.00
±
0.00aa
带双芽1cm63.33
±
5.77abab带双芽2cm43.33
±
5.77bb保留母株，仅截断顶芽48.28
±
18.84bb
[0071]
3.腋芽诱导的长度选择：
[0072]
将带有腋芽的茎段接种到腋芽诱导培养基中，得到(0-1mm)、(1-2mm)、(2-3mm)、基部，4种不同类型的腋芽嫩叶，统计其愈伤发生率，试验数据经过sas软件统计分析结果如表3和表4所示。由表3和表4可以看出，x
c2
＝11.9806，p＝0.0074＜0.05，即(0-1mm)、(1-2mm)、(2-3mm)、基部，4种不同类型的腋芽嫩叶对愈伤的诱导的影响有显著性差异，2-3mm长度的腋芽嫩叶材料诱导的愈伤发生率高于其余三种类型的腋芽嫩叶，除此之外，从愈伤组织的状态来看，1-2mm长度的腋芽嫩叶所诱导的愈伤组织(图9a)整齐度、大小、颗粒饱满等指标均优于2-3mm的腋芽嫩叶所诱导的愈伤组组织(图9b)，因此，在腋芽嫩叶大小的选择上，建议选择1-2mm长度的腋芽嫩叶。
[0073]
表3不同腋芽嫩叶大小对愈伤诱导的影响
[0074][0075]
表4不同腋芽嫩叶长度诱导愈伤影响的sas统计分析结果
[0076]
statisticdfvalueprobchi-square311.98060.0074likelihood ratio chi-square312.84800.0050mantel-haenszel chi-square13.75830.0525phi coefficient 0.2979 contingency coefficient 0.2855 cramer
′
s v 0.2979 [0077]
4.愈伤组织的培育周期与萌发率：
[0078]
在无菌环境中，将萌发后的腋芽置于体视显微镜下剥离出嫩叶，接种到a、b两种愈伤诱导培养基中，在24-28℃条件下，暗培养60-70d可得到所示结构的愈伤组织，将a、b两种愈伤培养基诱导的愈伤组织量进行统计，每次试验重复三次，试验数据经过sas软件统计分析结果如表5所示。
[0079]
由表5可以看出，a、b两种培养基诱导的愈伤组织发生率具有显著性差异，b培养基的愈伤发生率要显著性的高于a培养基，a培养基诱导愈伤生长量上要高于b培养基；a、b两种培养基均可诱导出愈伤组织。
[0080]
表5不同培养基对腋芽嫩叶愈伤诱导的影响
[0081]
培养基编号愈伤平均发生率100％5％显著水平1％显著水平a27.25
±
4.56bbb50.00
±
4.17aa
[0082]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。