一种基于氯酸盐敏感性的氮高效大麦筛选方法

1.本发明属于大麦育种技术领域，具体涉及一种基于氯酸盐敏感性的氮高效大麦筛选方法。


背景技术：

2.氮是植物生长发育所必需的大量元素之一，会影响作物的产量和品质。因此在农业生产上，通常施用大量的氮肥，以保证获得最大的作物产量。但是氮肥的有效利用率不超过50％，大部分的氮肥最终流失到土壤和水体中，造成许多环境问题，如土壤酸化、水体富营养化、全球变暖等等。因此，开展作物氮高效育种，可以提高作物产量，同时减少氮肥的使用，是当前可持续农业发展的理想途径。
3.大麦(hordeum vulgare l)是世界上仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物，其耐旱、耐盐、耐瘠和耐低温的特点使其在世界各地广泛种植，并且大麦用途广泛，可用于食品、啤酒、饲料等。因此，在大麦中开展氮高效育种，具有重要的意义。
4.不同基因型的大麦品种对氮素吸收和利用的能力不同，因而开展大麦氮高效育种，首先就需要筛选获取耐低氮或者氮高效的大麦种质资源。目前耐低氮或者氮高效的大麦筛选方式有三种方式：1)成熟期根据籽粒产量直接计算的氮素利用效率；2)根据低氮胁迫和正常供氮条件下幼苗地上部干重的相对值区分；3)同位素标记。
5.目前这些筛选方法存在问题：1)周期长、费时费力，环境影响大，可重复性差，大规模开展难；2)低氮胁迫的浓度和处理时间，没有统一标准，同时相对值也无法做统计分析，对于临界值附近数据或者差异小的材料区分困难；3)不适合大样本筛选。
6.氮素利用效率是一个非常复杂的数量性状，主要由氮素吸收效率和氮素利用效率两部分组成的。然而，到目前为止，关于大麦氮高效品种的筛选鉴定还没有统一的标准。田间产量通常是筛选氮高效或耐低氮大麦品种的最佳性状，而田间试验往往需要较长的时间和较大的空间，而且受到环境的影响比较大，因此，其使用常常受到很大的限制。
7.研究人员试图建立一套基于苗期的早期大麦氮高效或耐低氮筛选鉴定体系。目前，通常主要是利用低氮胁迫下苗期的地上部干重(sdw)来筛选耐低氮种质。另外，n15标记虽然是鉴定氮高效吸收的有效方法，但不适合样本容量较大的群体的表型测量。
8.地方品种是适应当地环境条件的早期驯化群体，具有丰富的遗传多样性。而且早期的作物生产使用的肥力水平比较低，因而这些地方品种中很可能蕴含着大量氮高效种质或者与氮高效相关的基因。因此，对大麦地方品种的研究将可以为开展大麦氮高效育种奠定较好的材料基础。
9.氯酸盐是硝酸盐的类似物，同样能够被硝酸盐转运蛋白吸收到植物体内，然后在硝酸盐还原酶的作用下被还原为亚氯酸盐，而亚氯酸盐对植物具有毒害作用，从而抑制植物的生长并引起失绿症状(m
é
sz
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ros等2002；siddiqi等1992；harper 1981)。因而，很多研究人员利用植物对氯酸盐处理的反应来筛选获得氮高效种质材料，并解析内在的分子机理。迄今为止，这一筛选体系已经在水稻(oryza sativa l.)(hu等2015；teng等2006)、玉米
(zea mays l.)(mclure等2010；魏杰等2020)等植物中得到应用，并且在水稻中克隆了相关基因。
10.目前，利用氯酸盐在水稻和玉米氮高效筛选中有相应的报道，但是均是以苗高作为氯酸盐敏感性筛查指标。在大麦生长过程中苗高仅是幼苗生长的一种性状，其代表性可能不够，或者说在区分材料生长的整体状况存在不足。
11.karunarathne等利用氯酸盐处理大麦后，根据叶片的失绿程度作为筛选鉴定指标，即叶片不失绿为0级，1-20％叶片失绿为1级，20-40％叶片失绿为2级，40-60％叶片失绿为3级，60-80％叶片失绿为4级，80-100％叶片失绿为5级，失绿程度越高，表明受到氯酸盐毒害的程度越深，也说明其氮素利用效率越大。尽管这一基于氯酸盐处理的判定标准能够进行氮高效大麦材料的筛选鉴定，但通过叶色判断往往存在一定的主观性，而且实际估算也相对困难，特别是难以对差异小的材料进行区分，无法准确对氮高效大麦进行分类。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于提供一种基于氯酸盐敏感性的氮高效大麦筛选方法，选取大麦苗高和地上部干重作为氯酸盐敏感度的氮高效大麦筛选指标，并确定获得了氮高效差异的品种，可以在大麦早期快速区分氮素吸收效率，效率更高，可以进行大规模筛选鉴定，表型明显，相关指标便于统计分析，准确率更高。
13.为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
14.一种基于氯酸盐敏感性的氮高效大麦筛选方法，包括以下步骤：
15.1)将大麦种子消毒，冲洗干净，室温浸种5～6小时，催芽过夜，待种子露白后放到湿润的滤纸上，移至3～6℃环境中暗处理1～3天，暗处理结束后发芽；
16.2)取生长一致的大麦幼苗，放入正常供氮营养液中培养，营养液ph为5.8～7.0；
17.3)在一叶一心期以氯酸盐营养液进行胁迫处理，以在正常供氮营养液中生长的大麦幼苗作为对照，每种处理各设3次以上重复，胁迫处理时间1～5天；
18.其中，所述的氯酸盐营养液中利用氯酸根代替硝酸根，且氯酸根浓度为0.001～0.004mol/l，其余成分及含量与正常供氮营养液相同；
19.4)胁迫处理结束后收苗，冲洗干净，测量苗高，将根和地上部分开装袋，杀青，烘干至恒重，测定地上部干重；
20.5)将氯酸盐营养液胁迫处理的大麦幼苗与正常供氮营养液处理的大麦幼苗的地上部干重和苗高分别进行对比，利用苗高和地上部干重作为氮高效大麦的筛选指标。
21.优选的，步骤2)中，所述正常供氮营养液中：kno3：0.001～0.003mol/l，kcl：0.001mol/l，cacl2：0.00036mol/l，mgso4：0.00054mol/l，kh2po4：0.00018mol/l。本发明的正常供氮营养液配方参考huetal等人(huetal,variation in nrt1.1b contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies,nature genetics)2015年发表的的配方。
22.优选的，步骤4)中，所述杀青温度为100～105℃。
23.优选的，步骤4)中，所述烘干温度为70～80℃。
24.本发明中利用氯酸盐营养液对大麦开展大麦氮高效筛选鉴定，基于苗高和地上部干重的氯酸盐敏感度作为筛选指标，简单、准确的筛选出氮高效大麦。
25.氯酸盐是硝酸盐的类似物，能够被硝酸盐转运蛋白吸收到植物体内，然后在硝酸盐还原酶的作用下被还原为亚氯酸盐，而亚氯酸盐对植物具有毒害作用，但是作物类型不同，对氯酸盐的反应也不同，因此，通过研究揭示氯酸盐对氮高效大麦各指标的关系也是非常重要的。需要研究并确立适合大麦的氯酸盐筛选体系及评价指标。
26.本发明建立的大麦氮高效筛选体系，在氯酸盐营养液的配置过程中，利用氯酸盐代替硝酸盐，并以含有硝酸盐的正常供氮营养液作为对照，这样在氯酸盐胁迫处理的时，营养液成分中仅缺少氮元素，可以避免由于其它元素的缺乏对植物形状产生的影响。并且以正常供氮营养液处理的大麦幼苗作为参照，对比结果更加准确。
27.发明人通过研究发现，在氯酸盐营养液和正常供氮营养液胁迫下，根干质量、地上部干重和根长受基因型的影响较强，而苗高受基因型的影响则较弱，可见苗高可以作为大麦对氯酸盐敏感度的重要指标。
28.地上部干重通常作为作物苗期耐低氮品种的筛选指标，本研究也发现，无论是在正常供氮还是氯酸盐处理条件下，地上部干重的变异系数都较大，因此，本发明进一步确定地上部干重作为大麦对氯酸盐处理的敏感度指标。
29.结果表明，本表明通过大麦苗期苗高和地上部干重这两个指标的同时考虑，更能反映大麦受氯酸盐抑制的状况，将苗高和地上部均对氯酸盐敏感的大麦定义为氮高效大麦，可以准确、有效的将耐氮高效大麦品种和其它品种进行区分。
30.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
31.本发明利用氯酸盐开展大麦氮高效筛选和鉴定，研究获得了大麦苗期各性状对氯酸盐敏感度的关联，确定了苗高和地上部干重作为大麦氮高效的筛查指标，只有苗高和地上部干重同时满足对氯酸盐敏感的大麦品种，才能被认定为氮高效大麦品种。
32.本发明所述的氮高效大麦筛选方法，可以在大麦早期快速区分不同品种大麦对氮素吸收效率，表型明显，可以进行大规模筛选鉴定，效率更高，准确率更高，避免单一指标的不准确性。
33.本发明以大麦的地上部分作为筛选研究对象，在幼苗阶段就可以开展筛查，节省了鉴定时间，提高了鉴定效率；又是采用水培方式，重复性好，适合大规模的材料鉴定。
具体实施方式
34.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
35.实施例
36.1、选取上海地区的21份材料作为供试材料，见表1。
37.具体包括如下步骤：
38.取适量大麦种子消毒，冲洗干净，室温浸种5～6小时，催芽过夜，待种子露白后放到湿润的滤纸上，移至3～6℃环境中暗处理1～3天，再移入人工气候室发芽。
39.5天后，取生长一致的大麦幼苗，用海绵条包裹，移入打孔的泡沫板中，每块泡沫板平均分布88个孔(8
×
11)，随后放入盛有正常供氮营养液的周转箱，ph6.0。
40.在一叶一心期，以氯酸盐营养液进行胁迫处理，以在正常供氮营养液中生长的大麦幼苗作为对照，每个品种每个处理设10个重复。其中，所述的氯酸盐营养液中利用氯酸根代替硝酸根，且氯酸根浓度为0.002mol/l，其余成分及含量与正常供氮营养液相同；
41.胁迫处理4天后收苗，冲洗干净，将根和地上部分开装袋，105℃杀青30分钟，然后70℃烘干至恒重，地上部干重和根干质量。每种处理，每个品种，每2株为1个重复，各5次生物学重复。
42.2、数据整理与分析
43.采用microsoft excel 2007进行数据整理和指标计算，采用spss 24进行方差分析、多重比较、相关性分析等统计分析。
44.2.1不同盐胁迫处理下大麦形状值的方差分析
45.表2为正常供氮和氯酸盐处理下不同大麦品种相关性状的方差分析。
46.从表2中我们可以看出，在氯酸盐处理和正常供氮处理条件下(对照)所有性状间都呈极显著差异(p《0.01)；在不同大麦品种间，除根长存在显著差异外(p《0.05)，其它性状都存在极显著差异(p《0.01)；并且，在氯酸盐处理和不同大麦品种间，所有性状均存在极显著的互作(p《0.01)。说明本实施例选择的大麦品种和氯酸盐胁迫条件是合理、有效的，可以通过氯酸盐胁迫区别出不同氮高效的大麦品种。
47.2.2不同盐胁迫处理对大麦幼苗表型的影响
48.不同大麦地方品种各性状在正常供氮处理和氯酸盐胁迫下的比较结果见表3。均值和标准差后面的字母仅代表每个品种在两种供氮处理下是否有显著差异，字母不同表示差异显著，反之则不显著，不涉及不同品种间的比较。
49.由表3可以看出，与正常供氮处理相比，经氯酸盐处理后，除了b016的地上部干重外，所有大麦地方品种的所有性状都表现出下降，并且除b016所有性状和b008的根长外，都达到显著水平(p《0.05)。这说明氯酸盐处理对大麦的生长具有严重的抑制作用。
50.在正常供氮条件下，所有大麦地方品种苗高最小为17.36cm，最大为25.26cm，根长最小为7.84cm，最大为17.85cm，地上部干重的变化范围为0.0325-0.0749g，根干质量的变化范围为0.0113-0.0283g。各性状的基因型变异系数依次为：根干质量》地上部干重》根长》苗高，这说明根干质量、地上部干重和根长受基因型的影响较强，而苗高受基因型的影响则较弱。
51.在氯酸盐处理条件下，所有大麦地方品种苗高的变化范围为11.79-16.94cm，根长最小为2.98cm，最大为8.86cm，地上部干重的变化范围为0.0204-0.0465g，根干质量的变化范围为0.0115-0.004g。各性状的基因型变异系数依次为：根干质量》根长》地上部干重》苗高，这和正常供氮条件类似，也是前面三个性状受基因型的影响较强，而苗高受基因型的影响则较弱。
52.2.3大麦苗期各性状的相关分析
53.本发明不同大麦地方品种在正常供氮处理和氯酸盐胁迫下各形状间的相关性详见表4。
54.由表4可以看出，在正常供氮条件下，不同大麦地方品种各性状间都呈现极显著正相关；而在氯酸盐处理下，除了地上部干重和根长间呈显著正相关关系，其余性状间也呈极显著正相关关系，只是除了地上部干重和苗高间的相关系数提高外，其余则都有所下降。
55.2.4不同大麦品种对氯酸盐敏感度
56.利用株高和地上部干重作为筛选指标时，将苗高对氯酸盐敏感度作为大麦对氯酸盐敏感度1；将地上部干重对氯酸盐敏感度作为大麦氯酸盐敏感度2，具体测量结果详见表
5。
57.由表5可以看出，以苗高作为不同大麦品种对氯酸盐敏感度的评价指标，从不同大麦品种敏感度排序可以看出，其中b092、b104、b002、b014、b068、b053这些品种对氯酸盐处理更敏感，而b016、花22、b008、花11、花30、b006这些品种对氯酸盐处理的敏感度更低。
58.本发明依据地上部干重来作为不同大麦品种对氯酸盐敏感度的评价指标，不同大麦品种敏感度排序见表5，其中b053、b104、b002、b068、b046、b092这些品种对氯酸盐处理的敏感度更高，而b016、b006、b098、b025、b008、b086这些品种对氯酸盐处理的敏感度更低。
59.而综合考虑这两个指标时，发现b104、b053、b002、b092、b068这些品种对氯酸盐的敏感度相对较高，说明其氮素吸收效率可能也较高；而b006、b008、b016、等这些品种对氯酸盐的敏感度相对较低，说明这些品种的氮素吸收效率可能也比较低。
60.综上所述，在18个大麦地方品种和3个栽培品种中，b104、b002、b068、b092、b053是氯酸盐高敏感材料，其氮素吸收效率可能也较高；而b016、b006、b008是氯酸盐低敏感材料，其氮素吸收效率可能也较低。这些材料的获得，将对于研究大麦氮高效的分子机理和氮高效育种具有重要意义。
61.62.63.64.65.66.67.