一种细胞保存方法与流程

1.该专利涉及细胞生物学领域，具体涉及一种细胞保存方法，特别是一种细针穿刺细胞的保存方法。


背景技术：

2.细针穿刺（吸取）细胞学（fna）是细胞病理学的重要发展方向，通过细针吸取人体细胞的方法，获得临床诊断标本，制备成细胞涂片以及细胞蜡块和细胞切片，并可进一步开展免疫组化和分子病理检测，对疾病进行明确诊断、分型、检测治疗靶点和预后判断指标。
3.fna病理诊断技术具有微创、安全、简便等许多优点，理论上细针可以抵达人体的任一位置取样对疾病进行诊断，降低对疾病诊断的取样难度，但该技术也有明显的局限性，包括其获得的细胞（组织碎片）少，对其保存和处理的技术要求高，处理不当容易造成细胞退变、形态结构改变；标本中含有大量的红细胞，有时使用细针吸取细胞学标本制备的细胞涂片或细胞切片中只有极少量的诊断细胞，有时甚至只有红细胞没有诊断价值细胞； 诊断细胞被细胞碎片覆盖妨碍在显微镜下对细胞观察。因此，对于细针吸取细胞学标本，有效除去标本中的红细胞、细胞碎片以及及时对标本进行固定、防止细胞退变，是通过细针吸取细胞对疾病进行准确病理诊断的关键步骤。
4.目前，临床上有用于保存临床细胞学标本的液基细胞保存液和细胞保存方法，液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞及其制片技术上十分成熟，并在宫颈癌筛查上发挥了十分重要的作用。相似的液基细胞保存液也被应用于细针穿刺细胞的保存，主要有两类：一类是以甲醇、乙醇为基础的保存液，这类保存液不具有除去红细胞的功能；另一类是在醇类固定液中加入红细胞裂解试剂冰醋酸，冰醋酸是一种激烈的除去红细胞的方法，能够迅速除去标本中红细胞，但对诊断细胞也造成明显的损伤，使其形态结构改变；同时，裂解的红细胞碎片和及其释放的血红蛋白在醇类固定剂中会以沉淀形式存在，制片过程中无法除去，沉淀物的存在会遮挡显微镜下对细胞形态的观察。这样，这类细胞保存液保存的细胞制备的细胞涂片（切片），使依据细胞形态及其微细结构为依据的细胞病理学诊断变得很困难，有时甚至做出错误的诊断。
5.因此，需要研究具有同时固定目标细胞，裂解红细胞，并具有使细胞碎片、血红蛋白处于溶解状态的细胞保存方法。


技术实现要素：

6.该发明涉及一种细胞保存方法，包括：（1）一种细胞保存瓶；（2）一种细胞保存液；（3）细胞保存方法。
7.细胞保存瓶具有a和b两个独立且密闭的腔室，有3种结构类型（1）上下结构细胞保存瓶；（2）左右结构细胞保存瓶；（3）两个腔室不相连。上下结构细胞保存瓶，指其a腔室位于b腔室上方，有2中连接方式，（1）a腔室拧紧在b腔室上，瓶盖拧紧在a腔室上，形成a、b两个独立的密闭空间；（2）a腔室套叠在b腔室内，瓶盖拧紧在b腔室的外壁上使a、b两个腔室分割为
独立的密闭空间；左右结构的细胞保存瓶指细胞保存瓶并列有a、b两个腔室，两个腔室之间设有隔离层并低于保存瓶外壁，在靠近瓶口位置设有能够与a、b两个腔室内口相嵌合的密闭垫，瓶盖拧紧以后通过挤压密闭垫将a、b两个腔室分割为独立的密闭空间。
8.细胞保存液由a液和b液组成,分别储存在细胞培养瓶的a腔室和b腔室中 a液为0.1mol/l～0.2mol/l nh
4+
、渗透压200mosm/l～400mosm/l、ph 6.0-8.0；b液为2%～6%甲醛、渗透压200mosm/l～400mosm/l、ph 6.0-8.0。
9.细胞保存方法是指将细胞保存液a液储存在细胞培养瓶a腔室中，细胞保存液b液储存在细胞保存瓶b腔室中，将临床穿刺细胞学标本首先在a液中处理，使红细胞破裂，随后将a液与b液混合，利用b液中的甲醛与nh
4+
发生的化学反应清除溶液中的nh
4+
，防止nh
4+
持续存在对诊断目标细胞的损伤；同时，b液中的甲醛对细胞进行固定，有效保存目的细胞的形态结构。 并将红细胞裂解以后的细胞碎片和血红蛋白溶解在甲醛-pb缓冲系统中。
10.此发明的有益技术效果：（1）通过使用该细胞保存方法，达到了三个关键的技术效果：（1）完全除去细针吸取细胞学标本中的红细胞；（2）对细胞进行及时有效固定；（3）使细胞碎片和蛋白处于溶解状态。
11.（2）该方法采用温和的方法除去红细胞（有核细胞保持生物学），并及时除去溶液的nh
4+
，能够在完全除去红细胞以后仍然保持良好的细胞形态结构。
12.（3）该方法裂解红细胞的细胞碎片和血红蛋白能够完全溶解在甲醛-pb缓冲系统中，通过一次简单离心与诊断细胞分离，从而除去标本中的细胞碎片和蛋白组分。
13.（4）通过及时甲醛固定作用，保持细胞形态结构，标本适用于开展免疫组化和分子病理检测。
14.（5）使用该细胞保存方法制备的细胞涂片或细胞切片，片子上只有诊断细胞（目的细胞）；细胞的形态结构完整、清晰；背景干净；有优良的免疫组化和分子病理检测结果。易于通过细针吸取细胞学标本对疾病进行明确诊断、分型，提供治疗靶点和预后判断指标。具有巨大的社会经济效益。
附图说明
15.图1上下结构细胞保存瓶的结构示意图一。
16.图2上下结构细胞保存瓶的结构示意图二。
17.图3左右结构细胞保存瓶的结构示意图。
18.图4细胞保存方法的实施方案流程图。
具体实施方式
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，需要说明的是，术语“上”、
ꢀ“
下”、
ꢀ“
左”、
ꢀ“
右”、
ꢀ“
内”、
ꢀ“
外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系， 仅是为了便于描述和简化描述，而不是指或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位， 此外，本发明的描述中，术语“安装”、
ꢀ“
连接”应做广义理解。
20.下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。
21.如图1所示，上下结构细胞保存瓶，其a腔室1位于b腔室2上方， a腔室1拧紧在b腔室2上，瓶盖5拧紧在a腔室1上，形成a1、b2两个独立的密闭空间，将细胞保存液a液3储存在
细胞培养瓶a腔室1中，细胞保存液b液4储存在细胞保存瓶b腔室2中。
22.如图2所示，上下结构细胞保存瓶，其a腔室1套叠在b腔室2内，瓶盖5拧紧在b腔室2的外壁上使a1、b2两个腔室分割为独立的密闭空间，将细胞保存液a液3储存在细胞培养瓶a腔室1中，细胞保存液b液4储存在细胞保存瓶b腔室2中。
23.如图3所示，左右结构的细胞保存瓶指细胞保存瓶并列有a1、b2两个腔室，两个腔室之间设有隔离层7并低于保存瓶外壁，在靠近瓶口位置设有能够与a、b两个腔室内口相嵌合的密闭垫6，瓶盖5拧紧以后通过挤压密闭垫6将a1、b2两个腔室分割为独立的密闭空间，将细胞保存液a液3储存在细胞培养瓶a腔室1中，细胞保存液b液4储存在细胞保存瓶b腔室2中。
24.如图4所示 细胞保存方法实施流程图包括二种具体实施方案，具体实施方案一：拧下瓶盖 s1、将细胞洗入a液中s2、静置5分钟s3、将a液细胞混悬液倒入b液中s4、离心s5、制片s6具体实施方案二：拧下瓶盖s1、取下隔离垫s2、将细胞洗入a液中s3、静置5分钟s4、颠倒细胞培养瓶s5、离心s6、制片s7。
25.具体实施方案一，上下结构保存瓶实施方案。
26.（1）拧开细胞保存瓶的瓶盖5。
27.（2）将细针吸取细胞打入细胞保存液a液3中，抽吸保存液洗涤注射器后再将洗液打入到a液3中。
28.（3）静置约5分钟裂解红细胞，直到a液3颜色从鲜红变为暗红（红细胞裂解以后的颜色）。
29.（4）取下a管1，将裂解红细胞后的细胞混悬液倾倒入b液4中，对诊断细胞进行固定，并使红细胞碎片和血红蛋白分散溶解在甲醛-pb缓冲液中，拧上瓶盖5适时送检。
30.（5）检测时，将保存瓶放入离心机中1500rpm离心5分钟，吸除上层液体，上层液体主要含有溶解状态的红细胞碎片和血红蛋白。将沉淀细胞制备成细胞涂片或制备成细胞蜡块、细胞切片对疾病进行病理诊断。
31.具体实施方案二，左右结构保存瓶实施方案。
32.（1）拧开细胞保存瓶的瓶盖5，取下密封垫6。
33.（2）将细针吸取细胞打入细胞保存液a液3中，抽吸保存液洗涤注射器后再将洗液打入到a液3中。
34.（3）盖上瓶盖5，静置约5分钟裂解红细胞，直到a液3颜色从鲜红变为暗红（红细胞裂解以后的颜色）。
35.（4）将细胞保存瓶颠倒混匀几次，将a腔1中裂解红细胞后的细胞混悬液与b腔2中的b液4通过密闭（隔离）垫6留下的空隙混合，对诊断细胞进行固定，并使红细胞碎片和血红蛋白分散溶解在甲醛-pb缓冲液中，适时送检。
36.（5）检测时，将保存瓶放入离心机中1500rpm离心5分钟，吸除上层液体，上层液体主要含有溶解状态的红细胞碎片和血红蛋白。将沉淀细胞制备成细胞涂片或制备成细胞蜡块、细胞切片对疾病进行病理诊断。