一种PopW蛋白的可湿性粉剂及其应用

一种popw蛋白的可湿性粉剂及其应用
技术领域
1.本技术属于生物农药技术领域，具体涉及一种popw蛋白的可湿性粉剂及其应用。


背景技术：

2.popw是本实验室从青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)zj3721的基因组dna中克隆获得一种新的胞外蛋白，全程长为1143bp，大小39.79kda。popw与以前文献报道的harpin类物质具有相同的性质，其中包括富含甘氨酸(gly)，缺乏半胱氨酸(cys)，酸性，水溶性，热稳定性高，对蛋白酶敏感等，同时，它能在非寄主植物烟草上引起hr反应。一级结构上，popw由两个结构域组成，一个是n-末端159氨基酸组成的harpin结构域，一个是c-末端207个氨基酸组成的类似果胶酶结构域。popw能够诱导植物抵抗多种病害，其中包括黄枝孢菌(fulvia fulva)引起的番茄叶霉病、古巴假霜霉病(pseudoperonospora cubensis)引起的黄瓜霜霉病以及烟草花叶病毒病(tobacco mosaic virus,tmv)引起的烟草花叶病毒等。因此，popw蛋白被认为是一种在生物防治上发挥重要作用的广谱性抗病蛋白。最新研究结果显示，popw喷雾处理可显著降低番茄疮痂病的发生。此外，popw蛋白在抗逆和促生方面也发挥着一定的作用。popw蛋白外源喷雾处理后，可促进烟草、黄瓜及辣椒等植物的生长发育。但是由于popw蛋白水溶液粘附性小，在使用的过程需要添加0.03％silwet l-77(美国ge公司生产)的表面活性剂才能具有实际生防效果，为了降低对外国产品的依赖、降低使用成本同时达到增效的目的，迫切解决popw蛋白制剂开发的问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供一种popw蛋白的可湿性粉剂。
4.本发明的另一目的是提供该可湿性粉剂的应用。
5.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
6.一种popw蛋白的可湿性粉剂，由以下重量份的组分组成：
7.popw蛋白：60-70重量份；
8.润湿剂：8-12重量份；
9.分散剂：木质素磺酸钠0.8-1.5重量份，羧甲基纤维素0.3-0.8重量份，三聚磷酸钠0.8-1.5重量份；
10.崩解剂：1.5-3重量份；
11.载体：膨润土15-22重量份。
12.作为本发明的一种优选，所述的润湿剂选自十二烷基苯磺酸钠或拉开粉。
13.作为本发明的一种优选，所述的崩解剂选自尿素、硫酸钠、可溶性淀粉、无水碳酸钠。
14.作为本发明的一种优选，所述的可湿性粉剂，由以下重量份的组分组成：
15.popw蛋白：60-70重量份；
16.润湿剂：十二烷基苯磺酸钠8-12重量份；
17.分散剂：木质素磺酸钠0.8-1.5重量份，羧甲基纤维素0.3-0.8重量份，三聚磷酸钠0.8-1.5重量份；
18.崩解剂：尿素1.5-3重量份；
19.载体：膨润土15-22重量份。
20.作为本发明的进一步优选，所述的可湿性粉剂，由以下重量份的组分组成：
21.popw蛋白：64.5重量份；
22.润湿剂：十二烷基苯磺酸钠10重量份；
23.分散剂：木质素磺酸钠1重量份，羧甲基纤维素0.5重量份，三聚磷酸钠1重量份；
24.崩解剂：尿素2-3重量份；
25.载体：膨润土15-22重量份。
26.本发明所述的popw蛋白的可湿性粉剂在防治番茄青枯病中的应用。
27.有益效果：
28.本发明针对popw蛋白水溶液粘附性小的缺陷，通过处方优化成功开发了popw蛋白的可湿性粉剂，不仅解决了popw蛋白水溶液粘附性小的问题，而且处方所有原料均不依赖进口，更具有增效作用，为番茄青枯病的防治提供了一种有效的生物农药制剂。
附图说明
29.图1载体种类筛选结果
30.注：同列数据后不同小写字母表示经duncan氏新复极差法检验在p＝0.05水平差异显著，下同。
31.图2膨润土比例筛选结果
32.图3各处理对番茄青枯病的病情指数
33.图4各处理对番茄青枯病的生防效果
具体实施方式
34.实施例1：一种可湿性粉剂的配方筛选及制备
35.1材料和方法
36.1.1材料
37.popw蛋白：将popw蛋白基因经过原核表达和电转到大肠杆菌escherichia coli bl21(de3)中，获得阳性转化子blpopw，该菌株保存在南京农业大学植物保护学院生物农药及绿色植保实验室。将blpopw菌株接种到含有50μg/ml kan的lb固体培养基上，37℃恒温培养箱培养24h。挑取单菌落接种于5ml含有相同抗性的lb液体培养液中，37℃震荡培养12h，然后将种子液按1％体积转接到含有相同抗性的100ml的lb液体培养液中扩大培养，37℃震荡培养至od600＝0.6-0.8，加入终浓度为1.0mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-bata-d-thiogalactopyranoside,iptg),37℃继续震荡培养4h，将震荡培养好的菌液以10000
×
g，4℃，离心10min，收集菌体，然后用1/10体积的无菌水将菌体重悬，煮沸破壁10min，10000
×
g，4℃，离心10min，收集上清液即为初步纯化的可溶性蛋白。
38.1.2载体及助剂
39.载体：膨润土、白炭黑、轻质碳酸钙、滑石粉(麦克林)；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠、
拉开粉(麦克林)；分散剂：木质素磺酸钠(木林森)、羧甲基纤维素(木林森)、三聚磷酸钠(西陇科学)；崩解剂：尿素、硫酸钠、可溶性淀粉、无水碳酸钠(西陇科学)。水：去离子水、标准硬水(342mg/l，ph＝6-7，按照gb/t 14825-93制备)。
40.1.3仪器及设备
41.千分之一电子天平(上海英衡称重设备有限公司)，高速万能粉碎机(皇代电器)，烘箱(天津泰斯特仪器有限公司)，恒温振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)，冻干机。
42.1.4其他材料
43.lb培养基，培养皿、烧杯、500/250/100/50ml具塞量筒、研钵、移液枪、玻璃棒、325标准筛，番茄幼苗(合作903)、silwet l-77(美国ge公司)等。
44.1.5载体种类的筛选
45.将蛋白分别与载体按照1:1比例进行混合研磨并通过325目标准筛，将过筛后的样品用离心管封装，然后称取0.1g样品，投入250ml具塞量筒中，在2min内颠倒30次，然后在25℃水浴锅中静置30min，抽去9/10内容物，将剩下的干燥，干燥后称取质量，计算固体悬浮率。原药与载体混合后所测得的固体悬浮率越高，其载体的吸附性能越好。
46.有效成分固体悬浮率＝10/9
×
(0.1-干燥后质量)/0.1
47.1.6载体用量的筛选
48.根据上个试验筛出的载体种类与蛋白进行混合。将载体以20％、30％、40％、60％的比例与蛋白进行混合，将过筛后的样品用离心瓶封装，测定固体悬浮率，方法同1.5。
49.1.7润湿剂种类及用量的筛选
50.将筛好的载体与蛋白进行混合制成母粉，然后将各润湿剂以10％的用量研磨过325目标准筛之后加入到一定量的母粉中混匀，制成样品。将500毫升标准硬水加入500毫升刻度量筒中，用称量皿快速倒入1.0g样品于量筒中，不搅动，立刻记秒表，记录99％样品沉入桶底时间。润湿时间越短，用量越小者可选定为润湿剂。
51.1.8分散剂的筛选
52.分散剂主要包括表面活性剂、水溶性高分子物质和无机盐三部分。表面活性剂选定木质素磺酸钠，水溶性高分子物质选定羧甲基纤维素(cmc)，无机盐选定三聚磷酸钠，主要是这几种物质均为最常见无毒、环境相容、价廉易得的分散剂。将蛋白与已经筛选好的载体、润湿剂按比例配成一定规格的母粉，将分散剂木质素磺酸钠、cmc、三聚磷酸钠用正交表设计实验。如表1所示。
53.水平a：木质素磺酸钠％b：cmc％c：三聚磷酸钠％110.50.5331.51
54.按表所示，不同因素不同水平的配方组合在母粉中加入不同用量的分散剂研磨后过325目标准筛制成样品，然后98毫升去离子水加入100毫升量筒中，称2g样品加入量筒中，颠倒十次，每次2s，记录30分钟和60分钟时的沉积物体积，60分钟后再颠倒至完全分散，静置24小时后再颠倒，记录使沉积物完全分散所需的次数。通常认为少于10次为合格。
55.1.9崩解剂的筛选
56.在初步确定载体、润湿剂、分散剂的基础上，将各崩解剂以2％、3％的比例与母粉混合过筛后制成样品，然后在25摄氏度下向盛有90毫升去离子水的100毫升量筒中加入
0.5g后，以8转/min的速度转动至完全溶解，记录时间。一般以小于3分钟为合格。
57.1.10 64.5％popw蛋白可湿性粉剂质量标准测定
58.可湿性粉末质量标准分别参照gb/t1600、gb/t1601、gb/t5451、gb/t14825、gb/t16150方法进行水分含量，定ph值、润湿性，悬浮率、细度测定。
59.2结果与分析
60.2.1配方筛选
61.2.2载体种类筛选
62.根据图1可以看出膨润土的固体悬浮率与其他三种载体悬浮率之间存在着显著差异，膨润土与popw蛋白混合后，粉末均匀易分散，吸附水分效果好。故选择膨润土作为载体。
63.2.3载体比例筛选
64.根据图2由数据显著性分析结果(p＝0.05水平)可以看出，四种比例膨润土中20％比例膨润土的固体悬浮率与其他三种存在显著差异。故选择20％比例膨润土作为载体添加比例。
65.2.4润湿剂筛选
66.根据表2十二烷基苯磺酸钠对酸碱不敏感，不易产生变质，对硬水适应性强，具有软化水质的特性，润湿时间为47s，相比拉开粉润湿时间更短，故选择十二烷基苯磺酸钠10％作为润湿剂。
67.表2润湿剂筛选结果
68.种类平均润湿时间(s)gb十二烷基苯磺酸钠(10％)47≤1min拉开粉(10％)52≤1min
69.2.5分散剂筛选
70.根据表3可知，通过正交分析a1b1c2组合在30min和60min的沉降物体积最小，悬浮效果最好，在30min和60min相对于其他处理存在显著差异，故选择木质素磺酸钠1％、羧甲基纤维素0.5％、三聚磷酸钠1％组合作为分散剂。
71.表3分散剂的筛选结果
72.配方组合30min/ml60min/mla1b1c14a5aa1b1c21b1.5ca1b2c13ab3.5ba1b2c25a5.5aa2b1c13.5a4ba2b1c23ab3bca2b2c13ab3bca2b2c23ab3bc
73.2.6崩解剂筛选
74.根据表4对于各处理崩解时间的测试，3％尿素的崩解时间相对于其他处理时间更短，同时由数据显著性分析结果(p＝0.05水平)可以看出3％尿素存在显著差异。
75.表4崩解剂的筛选结果
76.类型崩解时间s无水碳酸钠2％186a无水碳酸钠3％135d可溶性淀粉2％177b可溶性淀粉3％125e尿素2％132d尿素3％122f硫酸钠2％143c硫酸钠3％147c
77.2.7 popw可湿性粉剂配方
78.64.5％popw可湿性粉剂配方：popw蛋白64.5％、润湿剂十二烷基苯磺酸钠10％、分散剂木质素磺酸钠1％；羧甲基纤维素0.5％；三聚磷酸钠1％、崩解剂尿素2％、载体膨润土20％。
79.首先按照1.1popw蛋白制备方法获得液体popw蛋白，采用冻干机将液体popw蛋白冻干成固态popw蛋白，然后按照64.5％popw可湿性粉剂配方比例将蛋白与各助剂混合，使用高速万能粉碎机进一步粉碎后过325标准筛，重复操作直至所有样品都通过标准筛，此时通过标准筛收集的样品为64.5％popw可湿性粉剂，将该样品保存在密封离心管中，遮光常温保存。
80.2.8 popw可湿性粉剂质量控制标准测定
81.64.5％popw可湿性粉剂主要质量控制标准测定结果见表5，该可湿性粉剂呈淡黄色粉末状，肉眼下无大颗粒存在，遇水易溶解形成悬浮剂，溶解后微沉淀。使用考马斯亮蓝的方法，测定了粉剂中的popw蛋白浓度为400mg/g。
82.表5质量标准测定结果
[0083][0084][0085]
实施例2
[0086]
1.试验方法：
[0087]
1.1供试菌株
[0088]
番茄青枯病菌(gmi1000)由南京农业大学植物保护学院生物农药及绿色植保实验
室保存。
[0089]
1.2温室番茄青枯病诱导抗病防效测定
[0090]
制剂以100.00μg/ml稀释液喷雾处理番茄幼苗，以喷施灭菌水为阴性对照组，喷施助剂为阳性对照1组，喷施100.00μg/mlpopw蛋白稀释液为阳性对照2组，阴性和阳性对照1、2组还需要分别加入0.03％silwet l-77的表面活性剂，处理5天后采用灌根的方法往每颗番茄幼苗接入od＝1的青枯病菌培养液20ml，每个处理24颗番茄幼苗，共重复三次，接菌10天后按以下分级标准调查发病情况，根据以下公式计算病情指数及诱导抗病效果。
[0091]
助剂(即阳性对照1组)配方：
[0092]
十二烷基苯磺酸钠10％、木质素磺酸钠1％；羧甲基纤维素0.5％；三聚磷酸钠1％、尿素2％、膨润土20％。
[0093]
病情指数＝[∑(各级病株数
×
相对级数值)/(调查病株数
×
最高级数值)]
×
100
[0094]
生防效果％＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病指数
×
100
[0095]
病情分级标准为：
[0096]
0级：无症状；1级：1片叶枯萎；2级：2-3片叶枯萎；3级：除底部2-3片叶外，其他叶片均枯萎；4级：整株叶片枯萎
[0097]
2温室番茄青枯病诱导抗病防效测定结果
[0098]
根据图3可知，阴性对照组番茄青枯病病情指数将近80％，使用100μg/ml popw蛋白稀释液处理后病情指数下降到50％左右，而使用100μg/ml 64.5％popw可湿性粉剂处理后病情指数下降到30％左右，与其他处理对比存在显著差异。
[0099]
根据图4可知，使用100μg/ml 64.5％popw可湿性粉剂处理后对番茄青枯病的防治效果高达50.84％以上，而只使用相同浓度的popw蛋白稀释液处理防治效果只有25.49％，虽然蛋白稀释液中添加了提高粘附性的表面活性剂0.03％silwet l-77，但是方差分析表明popw蛋白制剂与popw蛋白稀释液对番茄青枯病诱导抗病效果之间存在差异。