一种改良MS培养基及其制备方法与应用

一种改良ms培养基及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种改良ms培养基及其制备方法与应用。


背景技术：

2.甘薯作为集能源、食品加工、保健和药用、出口创汇等功能于一身的经济作物，越来越受到人们的关注。甘薯是一种杂种优势作物，采用营养繁殖常会导致甘薯病毒病传播蔓延，致使产量和质量下降。ms培养基是murashige和skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而ms培养基常作为甘薯组织培养的培养基。但是传统的ms培养基在甘薯组织培养茎尖分生组织时，分化效率低、生长周期长并不适宜甘薯快繁和大规模生产。因此得到一种分化效率高、生长周期短的改良ms培养基成为急需解决的问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种改良ms培养基及其制备方法与应用。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种改良ms培养基，以水为溶剂，每升所述改良ms培养基中包括如下质量的组分：
6.硫酸铵1.3～1.34g、硝酸钾1.8～2.2g、7水硫酸镁0.35～0.39g、磷酸二氢钾0.16～0.18g、氯化钙0.42～0.46g、硫酸锰0.0167～0.0171g、7水硫酸锌0.0082～0.0090g、硼酸0.0062～0.0066g、碘化钾0.00080～0.00086g、钼酸钠0.00023～0.00027g、硫酸铜0.000023～0.000027g、氯化钴0.000023～0.000027g、7水硫酸铁0.0276～0.0280g、乙二胺四乙酸二钠0.0371～0.0375g、甘氨酸0.0018～0.0022g、盐酸硫胺素0.0003～0.0005g、盐酸吡哆醇0.0004～0.0006g、肌醇0.08～0.12g、吲哚乙酸0.0004～0.0006g、6-苄氨基嘌呤0.0005～0.0015g、、卡拉胶3.5～4.5g、黄原胶1.5～2.5g。
7.作为优选，以水为溶剂，每升所述改良ms培养基中包括如下质量的组分：
8.硫酸铵1.31～1.33g、硝酸钾1.9～2.1g、7水硫酸镁0.36～0.38g、磷酸二氢钾0.165～0.175g、氯化钙0.43～0.45g、硫酸锰0.0168～0.0170g、7水硫酸锌0.0084～0.0088g、硼酸0.0063～0.0065g、碘化钾0.00082～0.00084g、钼酸钠0.00024～0.00026g、硫酸铜0.000024～0.000026g、氯化钴0.000024～0.000026g、7水硫酸铁0.0277～0.0279g、乙二胺四乙酸二钠0.0372～0.0374g、甘氨酸0.0019～0.0021g、盐酸硫胺素0.00035～0.00045g、盐酸吡哆醇0.00045～0.00055g、肌醇0.09～0.11g、吲哚乙酸0.00045～0.00055g、6-苄氨基嘌呤0.00075～0.00125g、卡拉胶3.8～4.2g、黄原胶1.8～2.2g。
9.作为优选，以水为溶剂，每升所述改良ms培养基中包括如下质量的组分：
10.硫酸铵1.32g、硝酸钾2g、7水硫酸镁0.37g、磷酸二氢钾0.17g、氯化钙0.44g、硫酸
锰0.0169g、7水硫酸锌0.0086g、硼酸0.0064g、碘化钾0.00083g、钼酸钠0.00025g、硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g、7水硫酸铁0.0278g、乙二胺四乙酸二钠0.0373g、甘氨酸0.0020g、盐酸硫胺素0.0004g、盐酸吡哆醇0.0005g、肌醇0.1g、吲哚乙酸0.0005g、6-苄氨基嘌呤0.001g、卡拉胶4g、黄原胶2g。
11.作为优选，所述改良ms培养基的ph为5.8～6.0。
12.本发明还提供了所述的改良ms培养基的制备方法，包括如下步骤：
13.(1)将除卡拉胶和黄原胶以外的组分溶于水中，得到液体ms培养基；
14.(2)在所述液体ms培养基中加入卡拉胶和黄原胶，在0.1～0.15mpa、118～121℃的条件下，灭菌15～20min得到改良ms培养基。
15.本发明还提供了所述的改良ms培养基在甘薯组织培养中的应用。
16.作为优选，所述甘薯组织为甘薯茎尖分生组织。
17.作为优选，所述组织培养的方法为：将甘薯茎尖分生组织接种至所述改良ms培养基中培养。
18.作为优选，所述甘薯茎尖分生组织的大小为0.1～0.3mm。
19.作为优选，所述培养的温度为26～28℃，所述培养的光照强度为2800～3200lux，每天的光照时间为12～14h，所述培养的时间为18～22d。
20.本发明提供了一种改良ms培养基及其制备方法与应用。本发明改良ms培养基具有如下优点：
21.(1)本发明改良ms培养基安全，本发明改良ms培养基中利用硫酸铵将易制爆危险化学品硝酸铵进行替代，使本发明的培养基更安全；
22.(2)本发明改良ms培养基中加入了适宜甘薯茎尖分生组织分化的生长素组合吲哚乙酸和6-苄氨基嘌呤，促进了甘薯茎尖分生组织的分化，提高了分化效率和分化速度；
23.(3)培养基中优化了固化剂组分，将适宜甘薯分生组织分化的卡拉胶和黄原胶进行组合较琼脂更适宜甘薯生长。
24.综上本发明改良的ms培养基较传统的ms培养基更适宜培养甘薯茎尖组织，可以提高分化效率，分化率至少提高1.9倍。
具体实施方式
25.本发明提供了一种改良ms培养基，以水为溶剂，每升所述改良ms培养基中包括如下质量的组分：
26.硫酸铵1.3～1.34g，优选为1.31～1.33g，进一步优选为1.32g；
27.硝酸钾1.8～2.2g，优选为1.9～2.1g，进一步优选为2g；
28.7水硫酸镁0.35～0.39g，优选为0.36～0.38g，进一步优选为0.37g；
29.磷酸二氢钾0.16～0.18g，优选为0.165～0.175g，进一步优选为0.17g；
30.氯化钙0.42～0.46g，优选为0.43～0.45g，进一步优选为0.44g；
31.硫酸锰0.0167～0.0171g，优选为0.0168～0.0170g，进一步优选为0.0169g；
32.7水硫酸锌0.0082～0.0090g，优选为0.0084～0.0088g，进一步优选为0.0086g；
33.硼酸0.0062～0.0066g，优选为0.0063～0.0065g，进一步优选为0.0064g；
34.碘化钾0.00080～0.00086g，优选为0.00082～0.00084g，进一步优选为0.00083g；
35.钼酸钠0.00023～0.00027g，优选为0.00024～0.00026g，进一步优选为0.00025g；
36.硫酸铜0.000023～0.000027g，优选为0.000024～0.000026g，进一步优选为0.000025g；
37.氯化钴0.000023～0.000027g，优选为0.000024～0.000026g，进一步优选为0.000025g；
38.7水硫酸铁0.0276～0.0280g，优选为0.0277～0.0279g，进一步优选为0.0278g；
39.乙二胺四乙酸二钠0.0371～0.0375g，优选为0.0372～0.0374g，进一步优选为0.0373g；
40.甘氨酸0.0018～0.0022g，优选为0.0019～0.0021g，进一步优选为0.0020g；
41.盐酸硫胺素0.0003～0.0005g，优选为0.00035～0.00045g，进一步优选为0.0004g；
42.盐酸吡哆醇0.0004～0.0006g，优选为0.00045～0.00055g，进一步优选为0.0005g；
43.肌醇0.08～0.12g，优选为0.09～0.11g，进一步优选为0.1g；
44.吲哚乙酸0.0004～0.0006g，优选为0.00045～0.00055g，进一步优选为0.0005g；
45.6-苄氨基嘌呤0.0005～0.0015g，优选为0.00075～0.00125g，进一步优选为0.001g；
46.卡拉胶3.5～4.5g，优选为3.8～4.2g，进一步优选为4g；
47.黄原胶1.5～2.5g，优选为1.8～2.2g，进一步优选为2g。
48.在本发明中，所述改良ms培养基的ph为5.8～6.0，优选为5.9。
49.在本发明中，调节所述改良ms培养基的ph的试剂为盐酸或氢氧化钠。
50.本发明还提供了所述的改良ms培养基的制备方法，包括如下步骤：
51.(1)将除卡拉胶和黄原胶以外的组分溶于水中，得到液体ms培养基；
52.(2)在所述液体ms培养基中加入卡拉胶和黄原胶，在0.1～0.15mpa、118～121℃条件下，灭菌15～20min得到改良ms培养基。
53.在本发明中，所述灭菌的压力优选为0.125mpa；所述灭菌的温度优选为119～120℃，进一步优选为119.5℃；所述灭菌的时间优选为17～18min，进一步优选为17.5min。
54.本发明还提供了所述的改良ms培养基在甘薯组织培养中的应用。
55.在本发明中，所述甘薯组织为甘薯茎尖分生组织。
56.在本发明中，所述组织培养的方法为：将甘薯茎尖分生组织接种至所述改良ms培养基中培养。
57.在本发明中，所述茎尖分生组织获得的方法为：
58.选取生长健硕、茎尖饱满的甘薯植株，取顶芽2cm，用水冲洗2～3遍备用，于无菌环境中，将茎尖用75％的酒精浸泡30s后，再用2％的次氯酸溶液消毒5min，浸泡于无菌水中备用。在无菌环境中，将茎尖置于解剖镜下剥去顶芽或腋芽上较大的幼叶，切取0.1～0.3mm的茎尖组织，得到茎尖分生组织。
59.在本发明中，每个所述的茎尖分生组织带有1个叶原基。
60.在本发明中，所述甘薯茎尖分生组织的大小为0.1～0.3mm，优选为0.2mm。
61.在本发明中，所述培养的温度为26～28℃，优选为27℃；
62.所述培养的光照强度为2800～3200lux，优选为3000lux；
63.每天的光照时间为12～14h，优选为13h；
64.所述培养的时间为18～22d，优选为20d。
65.下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
66.在本发明实施例和对比例中所述成苗率＝(成苗数/接种茎尖分生组织数)
×
100％。
67.在本发明实施例和对比例中所述分化率＝(分化出的总芽数/接种茎尖分生组织数)
×
100％。
68.在本发明实施例和对比例中所用的甘薯品种为商薯19。
69.实施例1
70.取硫酸铵1.3g、硝酸钾2.0g、7水硫酸镁0.39g、磷酸二氢钾0.17g、氯化钙0.42g、硫酸锰0.0171g、7水硫酸锌0.0082g、硼酸0.0065g、碘化钾0.00086g、钼酸钠0.00025g、硫酸铜0.000023g、氯化钴0.000027g、7水硫酸铁0.0278g、乙二胺四乙酸二钠0.0375g、甘氨酸0.0018g、盐酸硫胺素0.0003g、盐酸吡哆醇0.0005g、肌醇0.12g、吲哚乙酸0.0005g、6-苄氨基嘌呤0.0005g溶于800ml水中，溶解后用水补足至1000ml，调节ph至6.0。然后放入4.5g卡拉胶，1.5g黄原胶，配置完成后，置于121℃，0.01mpa的高压灭菌锅中灭菌15min，得到改良ms培养基。
71.选取生长健硕、茎尖饱满的甘薯植株，取顶芽2cm，用水冲洗2遍备用，用75％的酒精擦拭消毒，之后在氯化汞溶液中浸泡10min，在无菌环境中，将茎尖置于解剖镜下剥去顶芽或腋芽上较大的幼叶，切取0.2mm的茎尖组织，得到茎尖分生组织。
72.将待接种的茎尖组织接种于上述改良ms培养基中，在温度为26℃，光照强度为2800lux，每天光照14h的条件下培养20d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
73.实施例2
74.取硫酸铵1.34g、硝酸钾1.8g、7水硫酸镁0.36g、磷酸二氢钾0.18g、氯化钙0.46g、硫酸锰0.0167g、7水硫酸锌0.0090g、硼酸0.0062g、碘化钾0.0008g、钼酸钠0.00027g、硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g、7水硫酸铁0.0276g、乙二胺四乙酸二钠0.0371g、甘氨酸0.002g、盐酸硫胺素0.0005g、盐酸吡哆醇0.0006g、肌醇0.08g、吲哚乙酸0.0004g、6-苄氨基嘌呤0.0015g溶于800ml水中，溶解后用水补足至1000ml，调节ph至6.0。然后放入3.5g卡拉胶，2.0g黄原胶，配置完成后，置于118℃，0.015mpa的高压灭菌锅中灭菌20min，得到改良ms培养基。
75.选取生长健硕、茎尖饱满的甘薯植株，取顶芽2cm，用水冲洗3遍备用，用75％的酒精擦拭消毒，之后在氯化汞溶液中浸泡10min，在无菌环境中，将茎尖置于解剖镜下剥去顶芽或腋芽上较大的幼叶，切取0.3mm的茎尖组织，得到茎尖分生组织。得到待接种的茎尖分生组织。
76.将待接种的茎尖组织接种于上述改良ms培养基中，在温度为28℃，光照强度为3200lux，每天光照12h的条件下培养22d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
77.实施例3
78.取硫酸铵1.32g、硝酸钾2.2g、7水硫酸镁0.35g、磷酸二氢钾0.16g、氯化钙0.45g、硫酸锰0.017g、7水硫酸锌0.0088g、硼酸0.0066g、碘化钾0.00084g、钼酸钠0.00023g、硫酸铜0.000027g、氯化钴0.000023g、7水硫酸铁0.0280g、乙二胺四乙酸二钠0.0373g、甘氨酸0.0022g、盐酸硫胺素0.0004g、盐酸吡哆醇0.0004g、肌醇0.1g、吲哚乙酸0.0006g、6-苄氨基嘌呤0.001g溶于800ml水中，溶解后用水补足至1000ml，调节ph至5.9。然后放入4g卡拉胶，2.5g黄原胶，配置完成后，置于120℃，0.01mpa的高压灭菌锅中灭菌20min，得到改良ms培养基。
79.选取生长健硕、茎尖饱满的甘薯植株，取顶芽2cm，用水冲洗2遍备用，用75％的酒精擦拭消毒，之后在氯化汞溶液中浸泡10min，在无菌环境中，将茎尖置于解剖镜下剥去顶芽或腋芽上较大的幼叶，切取0.2mm的茎尖组织，得到茎尖分生组织。得到待接种的茎尖组织。
80.将待接种的茎尖组织接种于上述改良ms培养基中，在温度为27℃，光照强度为3000lux，每天光照13h的条件下培养18d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
81.对比例1
82.按照实施例1的方法设置本对比例1的方案，与实施例1不同的是，本对比例1的培养基中不加入吲哚乙酸、6-苄氨基嘌呤，并且硫酸铵替换为相同质量的硝酸铵，卡拉胶和黄原胶替换为相同质量的琼脂。培养20d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
83.对比例2
84.按照实施例2的方法设置本对比例2的方案，与实施例2不同的是，本对比例2的培养基中用相同质量的a-萘乙酸钠替换吲哚乙酸和6-苄氨基嘌呤，培养22d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
85.对比例3
86.按照实施例3的方法设置本对比例3的方案，与实施例3不同的是，本对比例3的培养基中用相同质量的琼脂替换卡拉胶和黄原胶，培养18d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
87.对比例4
88.按照实施例1的方法设置本对比例4的方案，与实施例1不同的是，本对比例4的培养基中不加入吲哚乙酸。培养20d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
89.对比例5
90.按照实施例1的方法设置本对比例5的方案，与实施例1不同的是，本对比例5的培养基中不加入6-苄氨基嘌呤。培养20d后，观察成苗数，计算成苗率，结果如表1所示。观察分化出的总芽数，计算分化率，结果如表2所示。
91.表1 不同培养基对甘薯成苗率的影响
92.组别接种茎尖分生组织数(个)成苗数(个)成苗率％实施例1402665
实施例2403075实施例3403280对比例1401025对比例2401640对比例3401845对比例4401947.5对比例5402050
93.表1显示，本发明的培养基培养甘薯茎尖分生组织后，成苗率在65％以上，高于传统对比例1的ms培养基培养的成苗率，高于a-萘乙酸钠刺激后的成苗率，高于琼脂作为ms培养基的一部分后培养的成苗率。说明本发明改良的ms培养基能显著提高甘薯的成苗率。
94.表2 不同培养基对甘薯分化率的影响
[0095][0096][0097]
表2显示，本发明的培养基诱导甘薯茎尖分生组织后，分化率显著高于对比例1～3培养的分化率，是对比例1～3培养基分化率的1.9倍以上。
[0098]
由以上实施例可知，本发明提供了一种改良ms培养基及其制备方法与应用。本发明的改良ms培养基能显著提高甘薯分生组织的成苗率和分化率，为批量和大规模的甘薯组织培养提供依据。
[0099]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。