一种牙髓间充质干细胞保存液及其应用的制作方法

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙髓间充质干细胞保存液及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cell msc)是可形成多种细胞类型的多能干细胞。msc最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多领域开展。
3.目前，已经从骨髓、脐带、脐血、胎盘、脂肪等组织中分离出间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但是骨髓来源的间充质干细胞存在着细胞采集困难、对人体伤害大、有年龄限制等问题。脐血、脐带、胎盘组织中分离出的间充质干细胞，不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且具有更强的增殖、分化能力，采集时对身体无伤害，但是其组织材料的收集时机有很大的局限性。
4.牙髓间充质干细胞具有间充质干细胞的所有生物学特点，而且取材方便，比如6-11岁的小孩自然脱落的牙齿中、成人需要拔掉的智齿中都含有丰富的牙髓间充质干细胞。牙髓间充质干细胞不仅免疫原性低，不须经过严格配对即可使用，不会引起强烈的排异反应，而且还具有免疫调节功能，异体移植不会引起排斥反应。
5.现有技术中对牙髓间充质干细胞保存采用直接保存牙齿的方式，但是由于牙齿中分离的牙髓间充质干细胞的数量较少，需要经过长时间的扩增培养才能得到足够数量的细胞，该过程所需时间较长。直接将扩增的细胞在液氮中低温冻存，在应用时复苏细胞为一种长期保存方法，但是对于短期内要使用的牙髓间充质干细胞采用液氮冻存较为繁琐，增加保存成本。现有的低温保存液普遍存在无法保证细胞活性，对保存条件要求苛刻等问题，不利于降低牙髓间充质干细胞短期保存的成本。因此，有必要研发一种牙髓间充质干细胞保存液，实现牙髓间充质干细胞在体外的短期保存，保证细胞活性的情况下降低细胞的保存成本。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙髓间充质干细胞保存液，实现了牙髓间充质干细胞在体外的短期保存，在保证细胞活性的情况下降低保存成本。
7.本发明的目的之二在于提供一种上述保存液的应用。
8.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
9.一种牙髓间充质干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：0.9％氯化钠溶液90-100份、青霉素1-5份、透明质酸纳3-6份、磷酸氢二钾5-10份、2-羟基苄胺1.5-3份、烟酸乙酯1-3份、聚肌苷酸1-5份、维生素k45.5-8.5份。
10.进一步地，所述牙髓间充质干细胞保存液由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9％的氯化钠溶液95份、青霉素2.5份、透明质酸纳5份、磷酸氢二钾8份、2-羟基苄胺2份、
烟酸乙酯2份、聚肌苷酸3.5份、维生素k47份。
11.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
12.上述述保存液在牙髓间充质干细胞保存中的应用。
13.进一步地，保存温度为0-6℃。
14.进一步地，所述保存液中细胞的密度为5
×
10
6-1
×
107个/ml。
15.进一步地，所述牙髓间充质干细胞保存液的应用，包括以下步骤：
16.(1)向0.9％氯化钠溶液中加入青霉素、透明质酸纳、磷酸氢二钾、2-羟基苄胺、烟酸乙酯、聚肌苷酸和维生素k4混合均匀
17.(2)将步骤(1)制备的牙髓间充质干细胞保存液放入0-6℃的环境下预降温，然后将待保存的牙髓间充质干细胞加入至保存液中，继续在0-6℃条件下保存。
18.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种牙髓间充质干细胞保存液，保存液中的2-羟基苄胺、烟酸乙酯、聚肌苷酸等成分有效维持牙髓间充质干细胞在0-6℃保存条件下的活性，对牙髓间充质干细胞在体外的短期保存有重要意义。本发明的保存液成分明确安全，有效降低了牙髓间充质干细胞体外保存的成本，为牙髓间充质干细胞短期的保存及运输提供便利。
19.本发明还提供了上述保存液的应用，将其用于牙髓间充质干细胞的保存中，保存过程简便易于操作，为细胞的科研和临床应用提供便利。
附图说明
20.图1为本发明实施例1中保存48h后的牙髓间充质干细胞和未经保存的牙髓间充质干细胞的增殖曲线。
具体实施方式
21.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
22.牙髓间充质干细胞的来源如下：收集25-30岁成人拔除的智齿，pbs清洗后，夹裂牙齿，用无菌镊子取出牙髓组织，加入ⅰ型胶原酶进行消化后加入完全培养基终止消化，离心后加入含有10％fbs的dmem/f12培养基重悬，细胞密度为1
×
104个/ml，接种至12孔板中在37℃，5％co2的培养箱中培养，细胞生长至80％汇合后用0.25％的胰酶消化，进行传代培养，取传代培养的p3、p4、p5代牙髓间充质干细胞进行保存。
23.实施例1
24.一种牙髓间充质干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9％的氯化钠溶液95份、青霉素2.5份、透明质酸纳5份、磷酸氢二钾8份、2-羟基苄胺2份、烟酸乙酯2份、聚肌苷酸3.5份、维生素k47份。
25.上述保存液的应用，步骤如下：
26.(1)向0.9％氯化钠溶液中加入青霉素、透明质酸纳、磷酸氢二钾、2-羟基苄胺、烟酸乙酯、聚肌苷酸和维生素k4混合均匀
27.(2)将步骤(1)制备的牙髓间充质干细胞保存液放入6℃的环境下预降温，然后将
p3代牙髓间充质干细胞加入至保存液中，保存液中细胞的密度为5
×
106个/ml，继续在6℃条件下保存。
28.实施例2
29.一种牙髓间充质干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：0.9％氯化钠溶液90份、青霉素1份、透明质酸纳3份、磷酸氢二钾5份、2-羟基苄胺1.5份、烟酸乙酯1份、聚肌苷酸1份、维生素k
4 5.5份。
30.上述保存液的应用，步骤如下：
31.(1)向0.9％氯化钠溶液中加入青霉素、透明质酸纳、磷酸氢二钾、2-羟基苄胺、烟酸乙酯、聚肌苷酸和维生素k4混合均匀
32.(2)将步骤(1)制备的牙髓间充质干细胞保存液放入4℃的环境下预降温，然后将p4代牙髓间充质干细胞加入至保存液中，保存液中细胞的密度为8
×
1068个/ml，继续在4℃条件下保存。
33.实施例3
34.一种牙髓间充质干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：0.9％氯化钠溶液100份、青霉素5份、透明质酸纳6份、磷酸氢二钾10份、2-羟基苄胺3份、烟酸乙酯3份、聚肌苷酸5份、维生素k48.5份。
35.上述保存液的应用，步骤如下：
36.(1)向0.9％氯化钠溶液中加入青霉素、透明质酸纳、磷酸氢二钾、2-羟基苄胺、烟酸乙酯、聚肌苷酸和维生素k4混合均匀
37.(2)将步骤(1)制备的牙髓间充质干细胞保存液放入0℃的环境下预降温，然后将p5代牙髓间充质干细胞加入至保存液中，保存液中细胞的密度为1
×
107个/ml，继续在0℃条件下保存。
38.对比例1
39.对比例1提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去2-羟基苄胺，其余均和实施例1相同。
40.对比例2
41.对比例2提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去烟酸乙酯，其余均和实施例1相同。
42.对比例3
43.对比例3提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：将烟酸乙酯替换为烟酸，其余均和实施例1相同。
44.对比例4
45.对比例4提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：将烟酸乙酯替换为烟酰胺，其余均和实施例1相同。
46.对比例5
47.对比例5提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去聚肌苷酸，其余均和实施例1相同。
48.对比例6
49.对比例6提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：将聚肌苷酸替
换为肌苷，其余均和实施例1相同。
50.对比例7
51.对比例7提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：将维生素k4替换为维生素k3，其余均和实施例1相同。
52.对比例8
53.对比例8提供一种牙髓间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：将维生素k4替换为维生素k1，其余均和实施例1相同。
54.对实施例1至3，对比例1至8中保存的牙髓间充质干细胞分别在0h、24h、48h取样，采用台盼蓝染色法统计细胞活率，结果如表1所示。
55.表1
56.样品0h细胞活率24h细胞活率48h细胞活率实施例198.03％94.79％85.61％实施例298.54％93.37％83.15％实施例397.27％93.06％84.38％对比例197.83％84.72％72.47％对比例298.02％82.15％71.96％对比例398.19％79.32％65.49％对比例497.33％85.79％72.07％对比例598.04％80.26％61.48％对比例697.63％86.27％73.99％对比例796.97％89.57％79.38％对比例897.66％85.84％71.25％
57.由表1可以看出实施例1至3中的牙髓间充质干细胞在保存24h时，细胞的存活率在93％以上，在保存48小时后细胞的存活率在83％以上，高于对比例1至8，对比例1至8中分别调整了保存液的组成。
58.对比例1中省去了2-羟基苄胺，随着保存时间的延长，细胞的存活率有不同程度的下降，在保存48h后细胞的存活率为72.47％，低于实施例中的85.61％，说明2-羟基苄胺的加入有助于保存液中的细胞维持活性。
59.对比例2中省去了烟酸乙酯，对比例3和对比例4中分别将烟酸乙酯替换为烟酸和烟酰胺，其中对比例3中将烟酸乙酯替换为烟酸后细胞的存活率不及对比例2中省去烟酸乙酯，说明烟酸对维持牙髓间充质干细胞的活性没有明显效果。对比例4中将烟酸乙酯替换为烟酰胺后，细胞的存活率高于对比例2，但是低于对比例1，说明添加烟酰胺的效果不及烟酸乙酯。
60.对比例5中省去了聚肌苷酸，对比例6中将聚肌苷酸替换为肌苷，细胞的存活率均有不同程度的下降，对比例6中的存活率高于对比例5，但不及实施例1，说明肌苷在维持牙髓间充质干细胞活性上的效果不及聚肌苷酸。
61.对比例7和对比例8中分别把维生素k4替换为维生素k3和维生素k1，细胞的存活率和实施例1相比也有一定程度的下降，其中以添加维生素k1的保存液细胞的存活率最低，说明维生素k4在维持牙髓间充质干细胞的活性上效果更好。
62.综上，本发明保存液中的2-羟基苄胺、烟酸乙酯、聚肌苷酸、维生素k4等成分有效维持牙髓间充质干细胞在0-6℃保存条件下的活性，对牙髓间充质干细胞在体外的短期保存有重要意义。本发明的保存液成分明确安全，有效降低了牙髓间充质干细胞体外保存的成本，为牙髓间充质干细胞短期的保存及运输提供便利。
63.取实施例1中保存48h后的牙髓间充质干细胞，接种在含有10％fbs dmem/f12培养基中，细胞密度为1
×
104个/ml，在37℃，5％co2的培养箱中培养7天，将未经保存的p3代牙髓间充质干细胞作为对照组，每天统计牙髓间充质干细胞的数量，绘制细胞生长曲线，结果如图1所示。
64.由图1可以看出和对照组相比，本发明提供的经保存48h后的细胞在增殖速度上和对照组相当，在细胞数量和对照组相比有轻微降低，说明本发明提供的保存液对牙髓间充质干细胞的增殖活性无影响，经保存后的细胞仍可用于正常的增殖培养。
65.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。