1.本发明属于家畜繁殖和哺乳动物精液冷冻保存技术领域，涉及一种猪精液的冷冻保存方法。
背景技术：
2.近些年来，猪精液冷冻保存技术得到了长足的发展。猪冷冻精液(简称“猪冻精”)采用深部位输精方法能取得接近常温保存精液的效果，继牛之后也开始步入商业化生产和普及应用的进程。
3.与其它动物相比，猪精子对低温更为敏感，故其冻精制作需要较长的降温平衡时间。但在较长的降温平衡过程中，精子呼吸代谢会产生大量的活性氧族(ros)，而ros导致的氧化损伤是猪冻精品质急剧下降的主要原因。因此，如何抑制精子遭受的氧化损伤问题，是提高猪冻精品质的关键。
技术实现要素：
4.本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种猪精液的冷冻保存方法，该方法可提高猪冻精的解冻活力、精子顶体完整率并降低精子氧化损伤程度。
5.为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：
6.一种猪精液的冷冻保存方法，包括如下步骤：
7.(1)配制冷冻基础液tcg，往冷冻基础液中加入20～25％的卵黄，搅拌均匀后，得到冷冻稀释ⅰ液，往冷冻稀释ⅰ液中加入6％的甘油和0.4～0.6％的oep(orvus es past)，搅拌均匀后，得到冷冻稀释ⅱ液；
8.(2)将稀释液bts、冷冻稀释ⅰ液和冷冻稀释ⅱ液分别置于密闭容器中，通入氢气进行加氢处理，得到加氢处理后的稀释液bts、冷冻稀释ⅰ液和冷冻稀释ⅱ液；
9.(3)采精，将猪精液用加氢处理后的稀释液bts等温1∶1稀释，得到预稀释后的精液；
10.(4)将预稀释后的精液在17℃下平衡2～4h，然后离心，去除上清后，将精子沉淀用等温的、加氢处理后的冷冻稀释ⅰ液稀释，稀释至精子密度为20
×
108个/ml，然后降温平衡至4℃，最后用等温的、加氢处理后的冷冻稀释ⅱ液1∶1稀释，得到稀释后的精液；
11.(5)将稀释后的精液用冷冻细管分装并封口，然后置于程序冷冻仪的箱体中进行冷冻，冷冻结束后，将冷冻细管移至液氮中保存。
12.步骤(1)中，所述冷冻基础液tcg的制备方法为：称取葡萄糖1.1g、柠檬酸1.48g、tris 2.42g、青霉素钠0.06g和硫酸链霉素0.1g，溶于到双蒸水中，搅拌溶解后，定容至100ml。
13.步骤(2)中，所述稀释液bts的制备方法为：称取葡萄糖3.7g、二水柠檬酸三钠0.6g、edta0.125g、碳酸氢钠0.125g、氯化钾0.075g、青霉素钠0.06g和硫酸链霉素0.1g，溶于双蒸水中，然后定容至100ml，调ph至7.2，渗透压为310mosm/l。
14.进一步，步骤(2)中，所述加氢处理时，容器内压力为0.6～0.8mpa，处理时间为2～5h。
15.进一步，步骤(4)中，所述离心条件为：17℃，800～2300g，3～15min。
16.进一步，步骤(5)中，所述冷冻的程序为：温度从4℃开始，4℃维持30min后以6℃/min的速率降至-5℃，再从-5℃开始以40℃/min的速率降至-80℃，-80℃保持30s后，以60℃/min的速率降至-145℃，完成冷冻。
17.本发明的有益效果：
18.本发明提供了一种猪精液的冷冻保存方法，操作简单，该方法可有效提高猪冻精的解冻活力和精子顶体完整率，并能降低精子氧化损伤程度，克服了现有技术中猪冻精制作需要较长的降温平衡时间，精子容易遭受氧化损伤的问题。
具体实施方式
19.以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
20.实施例1
21.一种猪精液的冷冻保存方法，包括如下步骤：
22.(1)配制冷冻基础液tcg，往冷冻基础液中加入20-25％的卵黄，搅拌均匀后，得到冷冻稀释ⅰ液，往冷冻稀释ⅰ液中加入6％的甘油和0.4-0.6％的oep(orvus es past)，搅拌均匀后，得到冷冻稀释ⅱ液；
23.所述冷冻基础液tcg的制备方法为：称取葡萄糖1.1g、柠檬酸1.48g、tris 2.42g、青霉素钠0.06g和硫酸链霉素0.1g，溶于到双蒸水中，搅拌溶解后，定容至100ml。
24.(2)制备稀释液bts：称取葡萄糖3.7g、二水柠檬酸三钠0.6g、edta0.125g、碳酸氢钠0.125g、氯化钾0.075g、青霉素钠0.06g和硫酸链霉素0.1g，溶于双蒸水中，然后定容至100ml，调ph至7.2，渗透压为310mosm/l；
25.将稀释液bts、冷冻稀释ⅰ液和冷冻稀释ⅱ液分别置于密闭容器中，通入氢气，在0.7mpa下处理4h，得到加氢处理后的稀释液bts、冷冻稀释ⅰ液和冷冻稀释ⅱ液；
26.(3)采精，精液来自1.5～2岁、繁殖性能良好的3头杜洛克种公猪，采用半自动采精系统收集猪精液，采集后，将猪精液用加氢处理后的稀释液bts等温1∶1(体积比)稀释，得到预稀释后的精液；
27.(4)将预稀释后的精液在17℃下平衡3h，然后离心(17℃，1100g，9min)，去除上清后，将精子沉淀用等温的、加氢处理后的冷冻稀释ⅰ液稀释，稀释至精子密度为20
×
108个/ml，然后降温平衡至4℃，最后用等温的、加氢处理后的冷冻稀释ⅱ液1∶1(体积比)稀释，得到稀释后的精液；
28.(5)将稀释后的精液用冷冻细管分装并封口，然后置于程序冷冻仪的箱体中进行冷冻，提前启动精子程序冷冻仪，将冷冻箱体内温度降至4℃，冷冻程序为：温度从4℃开始，4℃维持30min后以6℃/min的速率降至-5℃，再从-5℃开始以40℃/min的速率降至-80℃，-80℃保持30s后，以60℃/min的速率降至-145℃，冷冻结束后，将冷冻细管移至液氮中保存。
29.对比例1
30.将步骤(2)中“将稀释液bts、冷冻稀释ⅰ液和冷冻稀释ⅱ液分别置于密闭容器中，通入氢气，在0.7mpa下处理4h，得到加氢处理后的稀释液bts、冷冻稀释ⅰ液和冷冻稀释ⅱ液”删掉，不进行加氢处理，其余与实施例1相同。
31.细管冻精的解冻和质量评定：
32.用镊子将冷冻细管迅速从液氮罐中取出，50℃水浴16s解冻，用纸巾擦除细管表面水珠、剪开细管两端，将精液(0.5ml)与解冻液(4.5ml，35℃)混合，然后测试下述指标：
33.(1)精子活力
34.将解冻精液37℃水浴15min，然后取10μl精液于专用精子计数板，利用计算机辅助分析系统(casa)检测精子活力。
35.(2)精子顶体完整率
36.利用fitc-pna染液染色后，荧光显微镜观察精子顶体形态，具体方法如下：
37.将解冻精液加到2ml 3％聚乙烯吡咯烷酮液面上，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液洗2次，1500rpm离心6min，弃上清；用磷酸缓冲盐溶液(37℃)重悬精子，调整密度至1～2
×
106/ml；吸取30μl精子悬液，涂片，空气干燥，用甲醇固定10min；再加入30μlfitc-pna染液，37℃黑暗潮湿环境孵育30min；磷酸缓冲盐溶液冲洗，空气干燥后滴少量封片剂、盖片并用无色指甲油封片，尽快在400
×
荧光显微镜下观察。每次检查200～300个精子，重复5次。
38.(3)总抗氧化能力(t-aoc)检测
39.使用t-aoc比色法检测试剂盒(南京建成，a015-1)检测精液抗氧化能力(检测方法参照说明书)。
40.(4)精子线粒体活性检测
41.使用rh123-pi双染的方法检测精子线粒体活性，方法如下：
42.取解冻后鲜精或冻精50μl于500μl离心管中；取稀释后的rh123和pi混合溶液(取，分别取rh123和pi各2μl加至50μl的pbs溶液并混匀)5μl添加入提前准备好的精液中，37℃孵育15min；孵育好的精液涂片后观察。计数200个精子以上，线粒体鞘没有荧光或荧光强度弱的为线粒体活性差线粒体鞘部分荧光强度强为线粒体活性高。统计线粒体活性好的所占比例即为线粒体完整率。
43.测试结果见表1：
44.表1
45.处理精子活力％顶体完整率％t-aoc精子线粒体活性对比例145.72
±
1.26a62.09
±
7.98a114.44
±
12.95a68.67
±
8.9a实施例150.00
±
3.67b81.89
±
4.57b208.33
±
11.67b87.83
±
7.00b
46.由表1的试验结果可以看出：应用本发明的冷冻保存方法，解冻后精子活力和顶体完整率等显著高于应用对比例1的方法，精子t-aoc和线粒体活性等也显著强于应用对比例1的方法。