一种快速鉴别丰年虫新产卵质量的方法

1.本发明属于海洋生物饵料的培养技术领域，特别涉及一种快速鉴别丰年虫新产卵质量的方法。


背景技术：

2.丰年虫，又称丰年虾、卤虫、盐水虾等，为雌雄异体，生殖方式可分为卵生及卵胎生两种，在含盐度低和溶氧高的环境中能直接孵化成幼虫，而在高盐度及低溶氧环境中则通过雌雄交配产生受精卵，该受精卵在第一次越冬之前很难通过常规方法使其正常发育，称为休眠卵或滞育卵。丰年虫卵孵化出的无节幼体具有大量的卵黄，并含有丰富的蛋白质和脂肪(蛋白质约含60％、脂肪约含20％)，世界85％以上的水产养殖动物的苗种繁育都以丰年虫作为饵料，因而一直受到人们的广泛的重视。由于丰年虫卵有自然熟化的过程，未经越冬的丰年虫新产卵孵化率极低(不超过30％)，因此很难通过孵化的方法鉴别卵质的好坏；而且，丰年虫新产卵壳厚、形态差异小，也很难通过外形或大小鉴定卵子质量。随着我国海水养殖业的迅速发展，对丰年虫卵的需求逐年增加，国际市场也逐渐成为丰年虫卵的重要来源，但是，目前尚未有用于快速鉴别丰年虫新产卵(未经过第一次越冬)质量好坏的方法。因此，如何快速鉴别丰年虫新产卵质量的方法，以确保国内采购者购买到高质量的丰年虫新产卵，是目前急需解决的技术问题。


技术实现要素：

3.为解决以上现有技术的不足，本发明提出了一种快速鉴别丰年虫新产卵质量的方法。
4.一种快速鉴别丰年虫新产卵质量的方法，包括：如下操作步骤：
5.(1)取适量(一般5-10g)丰年虫新产卵，所述丰年虫新产卵是指未经过第一次越冬的卵子，用淡水清洗干净；
6.(2)将清洗干净的丰年虫新产卵浸泡于盛有淡水的烧杯中，浸泡一段时间以补充丰年虫新产卵失去的水分，之后微充气直至丰年虫新产卵呈圆形；
7.(3)滤干，之后将上一步得到的呈圆形的丰年虫新产卵先置于激活液中浸泡，再置于整理液中浸泡，最后用淡水冲洗干净并阴干，激活液为过氧化氢水溶液，整理液为氯化钠水溶液；
8.(4)取适量(一般0.5-1g)上一步得到的丰年虫新产卵进行孵化并计算孵化率，如孵化率达到80％以上，则为优质卵。
9.本发明在利用淡水迅速补充丰年虫新产卵内失去的水分的基础上，先利用弱碱性的激活液刺激细胞内的酶类，使其达到较好的活化状态；再以整理液进行浸泡，进一步调整细胞内渗透压以及提高含水量，从而增强卵质流动性，使滞育卵在短时间内即可自然熟化，达到与成熟卵相当的孵化能力，继而通过孵化达到快速鉴别丰年虫新产卵质量好坏的目的。
10.进一步来说，步骤(3)中，激活液为0.0226-0.0452g/ml的过氧化氢水溶液，整理液为0.008-0.015g/ml的氯化钠水溶液。过氧化氢浓度过高会损伤卵子，浓度过低达不到活化效果，氯化钠浓度过高或过低会导致卵内渗透压过高或过低，继而不利于卵子的发育；上述浓度范围，有助于激活液与整理液协同作用，最终促使滞育卵在短时间内即可自然熟化，达到与成熟卵相当的孵化能力。
11.优选的，步骤(2)中，微充气具体为：利用增氧泵向淡水中充入空气，形成气泡但是水体未形成上下对流；步骤(3)中，在激活液中浸泡时采用充气浸泡，充气浸泡的操作具体为：利用增氧泵向激活液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于激活液中。
12.优选的，步骤(3)中，阴干的具体操作为：将丰年虫新产卵在筛绢网上摊成1-2mm厚的薄层，之后放置于18-28℃的阴凉处，直至其含水量25％-35％。
13.优选的，步骤(4)中，孵化的具体操作为：将阴干后的丰年虫新产卵放置于锥形瓶内，加入200-300倍体积于丰年虫新产卵的孵化液，充气，在25-28℃下孵化24-28h；其中，孵化液为ph调至8.2的0.015-0.025g/ml的氯化钠水溶液；充气的操作具体为：利用增氧泵向孵化液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于孵化液中。在促使滞育卵短时间内自然熟化，达到与成熟卵相当的孵化能力的基础上，本发明采用呈弱碱性的氯化钠水溶液对其进行刺激和孵化，能进一步提高丰年虫新产卵的孵化率。
14.更为优选的，步骤(4)中，计算孵化率的具体操作为：用移液器取250ul样品，滴于计数板，加100ul溶解液溶解丰年虫卵的卵壳，显微镜下统计幼虫数量以及未孵化完成的胚胎数量，孵化率＝幼虫数/(幼虫数+胚胎数)。
15.最为优选的，溶解液为有效氯浓度10％-12％的次氯酸钠溶液，丰年虫幼虫为发育至无节幼体ⅰ期及之后的幼虫。
16.本发明有效的解决了丰年虫新产卵质量难以鉴别的问题，不仅操作简单、易于实现，而且效率高、成本低、结果可靠，值得推广应用。
17.与现有技术相比，本发明至少存在如下有益效果：
18.1、首次提供了一种快速鉴别丰年虫新产卵(未经过第一次越冬)质量好坏的方法，检测耗时短、检测方法简单。
19.2、检测结果稳定可靠；
20.本发明充分激活了丰年虫新产卵，使得越冬前后的丰年虫卵孵化率差异不明显；而采用传统的孵化方法，越冬前后的丰年虫卵孵化率则分别为30％左右和80％以上，本发明能准确反映新产卵(未经历越冬)的孵化潜力，检测结果稳定可靠。
21.3、检测所用仪器及原料简单、易得且成本低；
22.本发明所用的检测原料、仪器等均为常规原料及仪器，便于携带且易于获得，有助于实现在采购地进行检测，为国外采购者提供了方便。
附图说明
23.图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.按照实施例1-3所示的鉴定方法分别对购自乌兹别克斯坦的咸海湖，俄罗斯的雅拉窝湖，新疆的艾比湖的三种丰年虫新产卵进行鉴定。
26.实施例1
27.一种丰年虫新产卵质量的快速鉴定方法，包括：如下操作步骤：
28.(1)取10g丰年虫新产卵，所述丰年虫新产卵是指未经过第一次越冬的卵子，用淡水清洗干净，清洗3次，清洗总时间不超过2min；
29.(2)将清洗干净的丰年虫新产卵浸泡于盛有200ml淡水的烧杯中，浸泡一段时间以补充丰年虫新产卵失去的水分，之后微充气直至丰年虫新产卵呈圆形，微充气的操作具体为：利用增氧泵向淡水中充入空气，形成气泡但是水体未形成上下对流；
30.(3)滤干，之后将上一步得到的呈圆形的丰年虫新产卵先置于200ml、0.0226g/ml的过氧化氢水溶液中充气浸泡5min，充气浸泡的操作具体为：利用增氧泵向过氧化氢水溶液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于激活液中；再置于200ml、0.015g/ml的氯化钠水溶液中浸泡1h，之后用淡水冲洗干净，最后将冲洗干净的卵放置于24℃的阴凉处，在筛绢网上摊开成1mm厚的薄层，直至卵子含水量为35％；
31.(4)取0.5g上一步得到的丰年虫新产卵放入500ml锥形瓶内，加ph调至8.2的0.025g/ml的氯化钠水溶液300ml，充气，26℃下孵化24h；所述充气的具体操作为：利用增氧泵向氯化钠水溶液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于所述氯化钠水溶液中；用移液器取250ul样品，滴于计数板，加100ul、有效氯为10％的次氯酸钠溶液溶解丰年虫卵的卵壳，显微镜下统计幼虫数量以及未孵化完成的胚胎数量，所述幼虫为发育至无节幼体ⅰ期及之后的幼虫，孵化率＝幼虫数/(幼虫数+胚胎数)；孵化率达到80％以上为优质虫卵。
32.实施例2
33.一种丰年虫新产卵质量的快速鉴定方法，包括：如下操作步骤：
34.(1)取5g丰年虫新产卵，所述丰年虫新产卵是指未经过第一次越冬的卵子，用淡水清洗干净，清洗2次，清洗总时间不超过2min；
35.(2)将清洗干净的丰年虫新产卵浸泡于盛有200ml淡水的烧杯中，浸泡一段时间以补充丰年虫新产卵失去的水分，之后微充气直至丰年虫新产卵呈圆形，微充气的操作具体为：利用增氧泵向淡水中充入空气，形成气泡但是水体未形成上下对流；
36.(3)滤干，之后将上一步得到的呈圆形的丰年虫新产卵先置于200ml、0.0452g/ml的过氧化氢水溶液中充气浸泡5min，充气浸泡的操作具体为：利用增氧泵向过氧化氢水溶液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于激活液中；再置于200ml、0.01g/ml的氯化钠水溶液中浸泡1h，之后用淡水冲洗干净，最后将冲洗干净的卵放置于18℃的阴凉处，在筛绢网上摊开成2mm厚的薄层，直至卵子含水量为30％；
37.(4)取0.8g上一步得到的丰年虫新产卵放入500ml锥形瓶内，加ph调至8.2的
0.015g/ml的氯化钠水溶液300ml，充气，28℃下孵化24h；所述充气的具体操作为：利用增氧泵向氯化钠水溶液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于所述氯化钠水溶液中；用移液器取250ul样品，滴于计数板，加100ul、有效氯为11％的次氯酸钠溶液溶解丰年虫卵的卵壳，显微镜下统计幼虫数量以及未孵化完成的胚胎数量，所述幼虫为发育至无节幼体ⅰ期及之后的幼虫，孵化率＝幼虫数/(幼虫数+胚胎数)；孵化率达到80％以上为优质虫卵。
38.实施例3
39.一种丰年虫新产卵质量的快速鉴定方法，包括：如下操作步骤：
40.(1)取8g丰年虫新产卵，所述丰年虫新产卵是指未经过第一次越冬的卵子，用淡水清洗干净，清洗3次，清洗总时间不超过2min；
41.(2)将清洗干净的丰年虫新产卵浸泡于盛有200ml淡水的烧杯中，浸泡一段时间以补充丰年虫新产卵失去的水分，之后微充气直至丰年虫新产卵呈圆形，微充气的操作具体为：利用增氧泵向淡水中充入空气，形成气泡但是水体未形成上下对流；
42.(3)滤干，之后将上一步得到的呈圆形的丰年虫新产卵先置于200ml、0.03g/ml的过氧化氢水溶液中充气浸泡5min，充气浸泡的操作具体为：利用增氧泵向过氧化氢水溶液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于激活液中；再置于200ml、0.008g/ml的氯化钠水溶液中浸泡1h，之后用淡水冲洗干净，最后将冲洗干净的卵放置于28℃的阴凉处，在筛绢网上摊开成2mm厚的薄层，直至卵子含水量为25％；
43.(4)取1g上一步得到的丰年虫新产卵放入500ml锥形瓶内，加ph调至8.2的0.02g/ml的氯化钠水溶液300ml，充气，25℃下孵化24h；所述充气的具体操作为：利用增氧泵向氯化钠水溶液中充入空气，形成气泡的同时水体形成上下对流，使得丰年虫新产卵悬浮于所述氯化钠水溶液中；用移液器取250ul样品，滴于计数板，加100ul、有效氯为12％的次氯酸钠溶液溶解丰年虫卵的卵壳，显微镜下统计幼虫数量以及未孵化完成的胚胎数量，所述幼虫为发育至无节幼体ⅰ期及之后的幼虫，孵化率＝幼虫数/(幼虫数+胚胎数)；孵化率达到80％以上为优质虫卵。
44.经测试，三种样品分别采用三个实施例所示的方法测出来的孵化率如下表1所示：
45.表1三种丰年虫新产卵采用三种方法所测得的孵化率
[0046][0047]
由表1可知，对于同一样品，实施例1-3所示的方法测出来的孵化率基本相同，可见，本发明的检测结果稳定可靠。
[0048]
在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。