一种应用于烟草育苗期TMV钝化的钝化剂及其应用的制作方法

一种应用于烟草育苗期tmv钝化的钝化剂及其应用
技术领域
1.本发明属于烟草病害防治领域，具体地提供了一种应用于烟草苗期tmv钝化的钝化剂及其应用，所述钝化剂以脱脂牛奶和磷酸三钠为主要活性成分制得。


背景技术：

2.烟草漂浮育苗技术已在国内烟叶生产过程中广泛应用。烟草花叶病毒(tmv)引起的病毒病已成为育苗期的主要病害，易通过剪叶等农事操作迅速传播，造成大量移栽苗的隐症带毒，以及移栽后大田花叶病的大面积发生。研究表明，病残体、育苗盘、基质及剪叶工具等是tmv传播的重要初侵染源。目前漂浮育苗过程中消毒措施主要是利用消毒剂对多孔育苗盘、育苗池和剪叶工具进行清洗和消毒。生产上常用消毒药剂很多，主要有含氯化合物、氧化剂和铜制剂等，但消毒方法和消毒效果报道不一，且易造成烟苗药害、环境污染以及工作人员呼吸不适和皮肤灼伤等问题。近期研究表明，生物制剂可用于育苗棚、剪叶机械、基质及育苗盘中烟苗残留干叶及干根中的tmv钝化，但生物制剂受有机质的影响较大。筛选安全、高效的消毒剂对育苗期tmv的防控具有重要意义。
3.脱脂牛乳对番茄黄化花叶病毒和烟草花叶病毒均有钝化作用，抑制其复制增殖，并降低病毒的侵染能力。此外，脱脂牛乳具有诱导烟草寄主抗tmv的作用。磷酸三钠对tmv和其他病原菌具有较好的杀灭效果，常被用于洗手消毒液、种子处理剂和植物病毒污染工具的消毒剂中，且药液稳定，持效期长，消毒效果不受有机物的影响。但目前尚没有两者合用的记载。


技术实现要素：

4.一方面，本技术提供了应用于烟草苗期tmv钝化的钝化剂，其包含脱脂牛奶和磷酸三钠。
5.进一步地，所述钝化剂中脱脂牛奶的含量为2-15％，所述磷酸三钠的含量为2-10％。
6.进一步地，所述钝化剂中脱脂牛奶的含量为10％，所述磷酸三钠的含量为3％。
7.进一步地，所述钝化剂中还包含吐温。
8.进一步地，所述钝化剂中还包含0.1％吐温20。
9.另一方面，本技术提供了上述钝化剂用于钝化烟草育苗期tmv的应用。
10.另一方面，本技术提供了上述钝化剂用于诱导烟草防御基因npr1、pal、pr1b和pr1a表达的用途。
11.进一步地，钝化剂500-1000倍稀释后应用。
12.进一步地，钝化剂500倍稀释后应用。
13.进一步地，所述应用中使用钝化剂处理1分钟以上。
14.本技术的钝化剂可用于钝化处理剪叶器具和育苗基质等育苗过程中所用工具或材料。
15.有益效果：
16.(1)本发明的钝化剂稀释液共孵育后的病毒粒体断裂成微小片段，外壳蛋白受损严重，螺旋结构和柱状基本消损完。
17.(2)本发明的钝化剂稀释液喷施不会对烟苗造成药害，适合实际生产中应用。
18.(3)本发明的钝化剂可以提高防御酶ppo和pal的活性，对烟草pod酶也具有活性提高作用。
附图说明
19.图1为不同稀释倍数的钝化剂对tmv的钝化作用；
20.图2为不同浓度钝化剂溶液处理20min的病毒立体投射电镜图像；
21.图3为钝化剂处理对烟草防御酶活性的影响；
22.图4为钝化剂诱导烟草防御基因表达相对量。
具体实施方式
23.为了便于理解本发明，下面将结合具体实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
24.实施例1试验材料与方法
25.试验材料
26.钝化剂的制备：按照有效成分为10％脱脂牛奶(脱脂牛奶,w/v)+3％磷酸三钠+0.1％吐温20制得本发明的钝化剂；
27.供试烟草品种为
‘
枯斑三生烟’和
‘
k326’，于中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地大棚温室(25-30℃)中光照16h、黑暗8h培养培育至7-8叶期，选取健康且生长一致的烟苗供试验用。
28.tmv毒源由中国农业科学院烟草研究所植物保护中心病毒课题组提供。
29.供试病毒接种液制备方法：将新鲜tmv病叶按照1:80的比例用0.01mol/l磷酸缓冲液(pbs，ph 7.2)研磨，双层纱布过滤后获得上清液，备用。对照消毒剂为10％的二氧化氯粉剂(兆冠，潍坊兆冠化工有限公司)。对照抗病毒剂为8％宁南霉素水剂(ningnanmyein，德强生物股份有限公司)。
30.剪叶工具：普通剪刀。
31.枯斑法测定钝化剂对tmv的体外钝化作用
32.采用秦元霞的方法。用无菌水将钝化剂稀释成500、800、1000倍液，然后将不同浓度的钝化剂与tmv接种液等量(v/v)混合均匀，室温下分别静置1、3min后摩擦接种，接种前叶片表面均匀洒适量金刚砂。对照组接种pbs和tmv混合液，每片叶接种混合液300μl，然后用医用脱脂无菌棉签轻轻擦涂叶片，使混合液均匀分布。接种后10min喷洒无菌水进行叶面清洗，每个处理3次重复，每次试验重复3遍。接种3天左右后进行枯斑数统计，并计算抑制率。
33.34.钝化剂对剪叶器具和育苗基质中tmv的钝化作用
35.钝化剂对剪叶器具中tmv的钝化作用
36.取tmv侵染的新鲜病叶5片，将反复剪切病叶多次的剪刀模拟感染tmv的剪叶器具，然后将污染剪刀在不同浓度的钝化剂中分别浸泡3、5、10min，无菌水冲洗2次后进行剪叶，另设pbs缓冲液浸泡的污染剪刀和未污染剪刀为阳性对照和阴性对照。每个处理10株烟苗，每株剪3片烟叶，每个处理重复3次，剪叶后每个处理分开单独培养。30天后统计发病率、病情指数。
[0037][0038][0039][0040]
由表1可知，不同时间的pbs处理中tmv发病率约35.62％、35.65％和35.79％，而不同浓度的钝化剂处理中tmv发病率为0％-15.66％，相对防效为51.42％-100.00％，显著抑制了剪叶器具上tmv对幼苗的侵染，其中500倍钝化剂稀释液处理剪叶器具3min时，tmv发病率为6.35％，相对防效达到77.30％。随着钝化剂处理浓度升高，处理时间延长，tmv发病率显著下降，防治效果明显增加，且不同浓度的钝化剂处理间发病率和相对防效差异显著。剪叶器具经稀释500倍的钝化剂浸泡不少于5min时对tmv的钝化效果可达100％。而800倍二氧化氯稀释液处理剪叶器tmv发病率和相对防效与800倍钝化剂稀释液处理组表现无显著差异。
[0041]
表1钝化剂对剪叶器具中tmv的钝化效果
[0042][0043]
注：数据为3次重复试验的平均值。同列数据后的不同字母表示差异显著(p《0.05)，下同。钝化剂对基质中tmv的钝化作用
[0044]
5g新鲜tmv病叶加入100ml 0.01mol/l pbs(ph 7.2)缓冲液研磨成匀浆，4层纱布过滤。然后将稀释500、800、1000倍的钝化剂和稀释800倍的二氧化氯分别按照1:5(ml:g)比
例与tmv滤液混合后浇灌基质，室温静置15天，以此基质种植4叶期
‘
k326’幼苗。以0.16μg/ml宁南霉素水剂按照1:5(ml:g)比例处理病毒汁液浇灌过的基质为药剂对照，pbs缓冲液处理为空白对照。30天后统计发病率、病情指数，并再采集各处理的基质，进行离心处理，后利用powersoiltm rna extraction kit(mobio，usa)进行总rna提取，提取方法参照试剂和说明书进行操作，每个样品进行3次重复提取。利用real-time rt-pcr测定其tmv相对含量。
[0045]
由图1、表2、表3可知，钝化剂稀释液对tmv的钝化作用表现出时间和浓度依赖性，且呈正相关。钝化剂与tmv接种液混合1min后的接种叶片枯斑数均较对照显著减少，浓度越高，抑制效果越好，对tmv抑制率分别为500倍99.08％、800倍75.60％、1000倍69.62％，而混合3min的处理中tmv的抑制率分别为100.00％、86.71％、74.89％，且不同处理间抑制率差异显著。采用500倍钝化剂消毒1min以上时间抑制效果最佳。
[0046]
与空白对照相比，经不同浓度的钝化剂处理基质中tmv含量显著降低，且不同浓度的钝化剂处理的基质中tmv拷贝数差异显著，其中500倍钝化剂处理最低(2506.49个/g)，为空白对照的9.73％，对照药剂宁南霉素的44.96％。随着钝化剂浓度的升高，tmv的发病率显著下降，防效明显增强，相对防效达54.83％-85.45％，其中800倍钝化剂处理基质中tmv发病率比宁南霉素处理组略低，相对防效在70％左右，无显著差异，而不同浓度的钝化剂处理组间tmv发病率和相对防效均表现出差异显著性。由此可知，钝化剂可明显钝化育苗基质中tmv，抑制其复制增殖，进而降低发病率，500倍钝化剂对tmv的钝化作用最佳。
[0047]
表2钝化剂对基质中tmv的钝化作用
[0048][0049]
注：基质中tmv拷贝数为6个采样点的平均值。
[0050]
表3不同浓度钝化剂(smtp)对tmv体外钝化作用
[0051][0052][0053]
钝化剂对tmv粒体的影响
[0054]
利用透射电镜观察脱脂牛奶和磷酸三钠复配制剂钝化剂(smtp)对tmv病毒粒体外观的影响，取100μl浓度为10μg/ml的tmv病毒，加入等体积不同浓度的smtp稀释液旋涡混匀；室温静置20min。不加smtp的病毒溶液作为空白对照。
[0055]
由图2可知，未经smtp溶液处理的病毒粒体长条柱状，比较集中，完整；经1000倍液处理的tmv病毒粒体，部分tmv粒体外部出现裂痕，粒体长条柱状仍然较完整；与500倍smtp
液共孵育后，病毒粒体断裂成微小片段，表面受损严重，基本消损完。经800倍smtp液处理后，粒体长条柱状断裂成段，表面裂痕增加，部分tmv粒体上出现多条裂痕。
[0056]
钝化剂诱导烟草抗tmv效果测定
[0057]
选用生长健壮且一致的
‘
k326’烟苗(8-9叶期)进行以下试验处理。阳性对照组(pbs+tmv)为喷施pbs缓冲液+tmv混合液，处理组1(钝化剂+tmv)为喷施钝化剂500倍稀释液+tmv混合液，处理组2(宁南霉素+tmv)为喷施宁南霉素800倍稀释液+tmv混合液。各处理10株烟苗，每株烟苗喷施3ml混合液，每处理重复3次。分别于试验处理后1、3、5、7、9天采集处理叶，液氮速冻后于-80℃保存。
[0058]
总蛋白含量测定采用bca(bicinchoninic acid)比色法，具体步骤根据总蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)使用说明进行操作。采用比色法测定多酚氧化酶(ppo)、苯丙氨酸解氨酶(pal)和过氧化物酶(pod)酶活。根据酶活测试盒(碧云天生物技术有限公司)使用说明测定不同时间点的酶活变化；pal酶活性以每毫克蛋白每分钟od290值变化0.01为一个酶活力单位；ppo酶活性以每毫克蛋白每分钟od420值变化0.01为一个酶活力单位；pod酶活性以每毫克蛋白催化1μg底物为一个酶活力单位；3个酶活力单位均为u/mg。每处理重复3次。
[0059]
钝化剂诱导烟草抗病相关基因分析
[0060]
烟草总rna的提取使用超纯rna提取试剂盒(康为世纪生物科技股份有限公司)，使用hifi-script cdna第一链合成试剂盒(康为世纪生物科技股份有限公司)进行逆转录试验，具体操作按试剂盒说明书进行。以β-actin为内参基因，分别以pr1a、pr1b、npr1、pal抗病相关基因特异引物进行real-time rt-pcr(表1)，引物由宝生物工程(大连)有限公司(takara)合成。
[0061]
表4诱导烟草抗病性相关基因的qrt-pcr引物
[0062][0063]
药害试验
[0064]
选用160孔泡沫漂浮育苗盘播种育苗，传统漂浮育苗技术操作处理按照中国烟草总公司《烟草漂浮育苗操作规程》进行。第1次剪叶时间为5叶龄，在第4次剪叶烟苗大十字期进行喷药处理。钝化剂浓度设置为稀释500、800倍，10％的二氧化氯粉剂浓度设置为稀释800、1000倍，每处理2盘，每盘160株烟苗，选择生长健壮一致的烟苗试验。然后采用手持式喷雾器进行药剂喷施，每盘6ml，至叶面雾滴均匀，无明显液滴流下。以无菌水处理为对照，施药后第7天进行显症株数和药害症状调查，记录无明显侵染性病害症状的不正常现象为药害症状。
[0065]
[0066]
由表5可知，钝化剂稀释500倍和800倍液喷施不会对烟苗造成药害，而10％的二氧化氯粉剂稀释800倍和1000倍液喷施会对烟苗造成轻微药害，药害率分别为4.9％和2.6％。
[0067]
表5钝化剂处理烟苗的药害情况
[0068][0069]
吐温20对钝化剂钝化tmv效果的影响试验
[0070]
由表6和表7可知，吐温20的添加显著增强了脱脂牛奶和磷酸三钠对剪叶工具和基质中tmv的钝化效果。含有吐温20的钝化剂对tmv钝化效果在剪叶工具中85％以上，在基质中是74％以上。机理推测：吐温20可增强脱脂牛奶和磷酸三钠在剪叶工具和基质中分散，展布和浸润，增加钝化剂与tmv粒体接触几率和面积，进一步提高钝化效果。
[0071]
表6吐温20增强钝化剂对剪叶工具中tmv的钝化效果
[0072][0073]
表7吐温20增强钝化剂对基质中tmv的钝化作用
[0074][0075]
注：基质中tmv拷贝数为6个采样点的平均值。
[0076]
本技术的钝化剂对烟草漂浮育苗中tmv的钝化效果显著，与其他化学抗病毒制剂或消毒剂相比，具有直接作用于病毒粒体和诱导寄主获得抗性的能力，且安全、高效、持续，对植物病毒病的防治有潜在的应用价值。但是为了进一步明确钝化剂对tmv的灭活和钝化作用，需对其田间抗病毒病发生效果进一步观测。