一种速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1号”的培育方法与流程

1.本发明属于水产养殖育种技术领域，尤其涉及一种速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1号”的培育方法。


背景技术：

2.我国是世界牡蛎养殖大国，2020年我国牡蛎养殖面积16.49万公顷，产量542.46万吨，均位居世界首位。目前我国牡蛎主要养殖品种是长牡蛎、葡萄牙牡蛎等，其中葡萄牙牡蛎养殖面积和产量最大，养殖主产区位于福建、广东等沿海地区。
3.近年来，随着高品质牡蛎需求不断增长，三倍体牡蛎育苗和养殖业也蓬勃发展。葡萄牙牡蛎具有生长速度快、养殖周期短等优点，但其受繁殖活动影响易导致软体部消瘦，而三倍体牡蛎不会受繁殖活动影响，全年保持较高的糖原含量和品质。因此，培育出生长速度快、养殖周期短、品质好的葡萄牙牡蛎三倍体对于推动我国牡蛎养殖产业转型升级以及助力乡村振兴都具有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1 号”的培育方法，能够大规模生产得到生长速度快、抗逆性强、品质优良且有明显优势的速长葡萄牙牡蛎三倍体“世倍1号”。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1号”的培育方法，包括以下步骤：选择体重100-150g，壳高9-12cm的葡萄牙牡蛎作为亲本杂交，以壳高和体重为选育目标进行定向选育，得到葡萄牙牡蛎速长选育系f代；以f代为亲本，诱导得到三倍体，再以所述三倍体为亲本，诱导得到四倍体 g；将四倍体g连续群体自繁，得到倍性稳定的四倍体g＇；以四倍体g＇作为父本，以f代作为母本进行杂交，培育得到速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1号”。
7.优选的，所述葡萄牙牡蛎为2-3龄葡萄牙牡蛎。
8.优选的，所述定向选育的代数为4代以上。
9.优选的，所述诱导的方法为用细胞松弛素b处理受精卵。
10.优选的，所述细胞松弛素b的浓度为0.4-0.6mg/l。
11.优选的，所述细胞松弛素b的处理时间为20-40min。
12.优选的，用细胞松弛素b处理受精卵后，用二甲基亚砜溶液浸泡受精卵。
13.优选的，所述二甲基亚砜溶液的浓度为1％，所述浸泡的时间为15min。
14.优选的，所述诱导后对诱导后的受精卵进行流式细胞筛选。
15.优选的，所述连续群体自繁的代数为2-3代。
16.本发明的有益效果：
17.本发明以壳高和体重作为目标性状，采用群体选育和多倍体育种相结合的方法，开展葡萄牙牡蛎速长系选育，然后用速长选育系诱导出葡萄牙牡蛎四倍体并进行群体自
繁，最后通过速长选育系二倍体和四倍体自繁后代杂交，从而培育出速长葡萄牙牡蛎三倍体“世倍1号”。采用本发明方法培育的“世倍1号”具有生长速度快、抗逆性强、品质优良等优点，非常适合我国沿海养殖，具有广阔的推广应用前景，有利于提高三倍体牡蛎在高端消费市场的知名度，从而推动我国牡蛎产业向高端消费市场转型升级，促进我国牡蛎养殖业的可持续健康绿色发展。
附图说明
18.图1为本发明速长葡萄牙牡蛎三倍体“世倍1号”培育方法技术路线图；
19.图2为“世倍1号”海区生长情况；
20.图3为速长葡萄牙牡蛎三倍体个体的检测峰值图；
21.图4为速长葡萄牙牡蛎四倍体诱导峰值图。
具体实施方式
22.本发明提供了一种速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1号”的培育方法，包括以下步骤：选择体重100-150g，壳高9-12cm的葡萄牙牡蛎作为亲本杂交，以壳高和体重为选育目标进行定向选育，得到葡萄牙牡蛎速长选育系f代；以f代为亲本，诱导得到三倍体，再以所述三倍体为亲本，诱导得到四倍体 g；将四倍体g连续群体自繁，得到倍性稳定的四倍体g＇；以四倍体g＇作为父本，以f代作为母本进行杂交，培育得到速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1号”。
23.本发明对于葡萄牙牡蛎的具体来源没有特殊限定，包括养殖牡蛎和野生牡蛎，在本发明中，所述葡萄牙牡蛎优选为2-3龄葡萄牙牡蛎，更优选为2 龄葡萄牙牡蛎。本发明对葡萄牙牡蛎亲本进行筛选时，以体重和壳高作为目标性状，其中体重优选为120-140g，更优选为130-135g，所述壳高优选为 10-11cm。在本发明中，所述定向选育的方法优选为收集选择的繁殖亲本的精子和卵子，采用人工授精方法获得d型幼虫，将d型幼虫在室内养殖池中培育至眼点幼虫，投放附着基，生长至壳高为2-3mm时的牡蛎稚贝，移到自然海区进行养殖至牡蛎成贝，以壳高和体重作为目标性状再次进行筛选，如此连续，即为定向选育。在本发明中，所述定向选育的代数优选为4 代以上，更优选为6-8代，得到葡萄牙牡蛎速长选育系f代。
24.在本发明中，以f代为亲本，诱导得到三倍体，所述诱导的方法优选为用细胞松弛素b处理受精卵，所述细胞松弛素b的浓度优选为0.4-0.6mg/l，更优选为0.5mg/l，所述细胞松弛素b的处理时间优选为20-40min，更优选为30min，本发明对于细胞松弛素b的具体来源没有特殊限定。在本发明中，用细胞松弛素b处理受精卵的方法优选为：将性腺成熟的选育系f代的雌贝和雄贝分别解剖，分别收集精子和卵子，人工授精，待受精卵发育至第一极体时，用所述细胞松弛素b处理。所述人工授精时，卵子和精子的数量比优选为1:5-10，更优选为1:6-8，最优选为1:7。用细胞松弛素b处理受精卵后，优选的用二甲基亚砜溶液浸泡受精卵，之后再进行常规孵化、幼虫培育及海区养殖。所述二甲基亚砜溶液的浓度优选为1％，所述浸泡的时间优选为 15min。
25.在本发明中，以所述三倍体为亲本，诱导得到四倍体g时，受精卵优选以所述速长葡萄牙牡蛎三倍体为母本，以速长选育系f二倍体作为父本进行人工授精得到。诱导速长葡萄牙牡蛎四倍体g的方法与速长葡萄牙牡蛎三倍体的诱导方法操作步骤相同，在此不做赘
述。
26.在本发明中，所述诱导后，优选还包括对诱导后的受精卵进行流式细胞筛选，得到倍性为3n的速长葡萄牙牡蛎三倍体和倍性为4n的速长葡萄牙牡蛎四倍体g。
27.获得四倍体g后，本发明将所述四倍体g连续群体自繁，所述连续群体自繁的代数优选为2-3，得到倍性稳定的四倍体g＇。在本发明中，所述群体自繁的方法优选为分别收集速长葡萄牙牡蛎四倍体g的雌贝和雄贝中的卵子和精子，人工授精，得到的受精卵发育至d型幼虫时，调整密度培育，当幼虫发育至眼点时，投放附着基；当稚贝生长壳高至2-3mm时，放入上升流系统进行养殖；当稚贝生长壳高至1cm以上时脱基，获得单体牡蛎装笼移至自然海区养成。所述d型幼虫培育密度优选为1-2个/ml。所述附着基优选包括牡蛎壳、扇贝壳、塑料片、水泥块、水泥条、水泥饼。
28.得到倍性稳定的四倍体g＇后，以四倍体g＇作为父本，以f代作为母本进行杂交，培育得到速长三倍体葡萄牙牡蛎“世倍1号”。本发明对于所述杂交的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的体外杂交方法即可。
29.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1
31.葡萄牙牡蛎速长选育系f选育：从福建、浙江沿海地区收集20000个葡萄牙牡蛎养殖和野生2-3龄群体，截取壳高和体重前5％的个体1000个作为繁殖亲贝，所述繁殖亲贝的体重为120-150g，壳形整齐，壳高为10-12cm。通过人工授精方法获得d型幼虫，在室内水泥池中培育至眼点幼虫，投放牡蛎壳作为附着基；当牡蛎稚贝生长至2-3mm时，移到自然海区进行养成。最后以相同选育目标、育苗技术和养成方法，经过连续6代群体选育出葡萄牙牡蛎速长选育系f6。
32.速长葡萄牙牡蛎四倍体g诱导：
①
三倍体诱导：解剖100个性腺成熟的葡萄牙牡蛎速长选育系f6亲本，用显微镜分出雌(28个)雄(32个)；挤出性腺较好的20对雌雄分别获得精卵，精、卵分别先用200目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；采用单对单的方法进行受精，同时控制每个卵子周围有5-10个精子；当10％受精卵发育至第一极体时，马上加入0.5mg/l细胞松弛素b，处理受精卵30min，之后用含1％二甲基亚砜的海水浸泡15min；将各组受精卵收集放入室内水泥池进行孵化、幼虫培育，用流式细胞仪检测三倍体诱导率在90％以上，最后在海区养成。
②
四倍体诱导：解剖性腺成熟的速长葡萄牙牡蛎三倍体，利用流式细胞仪检测出倍性为3n的个体100个，通过显微镜观察，筛选出30个卵子发育良好的雌性3n个体作为母本；解剖 100个性腺成熟的葡萄牙牡蛎速长选育系f6亲本，用显微镜辨别雌雄，选择性腺饱满、精子活力强的30个个体作为父本；分别挤出精、卵，先用200 目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；采用单对单的方法进行受精，同时控制每个卵子周围有5-10个精子；当50％受精卵发育至第一极体时，马上加入0.5mg/l细胞松弛素b，处理受精卵30min，之后用含1％二甲基亚砜的海水浸泡15min；将各组受精卵收集放入室内水泥池进行孵化、幼虫培育，用流式细胞仪检测四倍体诱导率在40％以上，最后在海区养成速长葡萄牙牡蛎四倍体约10000个。
33.速长葡萄牙牡蛎四倍体群体g自繁：在牡蛎繁殖季节，以速长葡萄牙牡蛎四倍体g为基础群体，通过流式细胞仪筛选出倍性为4n雌雄个体共100 个；分别挤出精、卵，先用200
目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；在人工授精过程中，控制每个卵子周围有3-5个精子；受精卵发育至d型幼虫时，全池收集幼虫并放入新的消毒好的水泥池中培育，幼虫培育密度为1-2个 /ml；当幼虫发育至眼点时，投放聚乙烯塑料壳作为附着基；当稚贝生长至 2-3mm时，将聚乙烯塑料片分散放入上升流系统进行养殖；当稚贝生长至 1cm以上时，采用脱基方法获得单体牡蛎，并将单体牡蛎装笼移至自然海区养成。采用相同方法进行连续2代四倍体群体自繁，从而生产出倍性稳定的速长葡萄牙牡蛎四倍体g2。
34.速长葡萄牙牡蛎三倍体“世倍1号”生产：将1000个葡萄牙牡蛎速长选育系f6个体和100个速长葡萄牙牡蛎四倍体g2个体移到室内水泥池进行恒温(23℃)促熟，生物饵料为人工培育的金藻、角毛藻、小硅藻、扁藻；当性腺成熟后，通过流式细胞仪检测和显微镜观察获得速长葡萄牙牡蛎四倍体g2雄性个体90个，待用；解剖1000个葡萄牙牡蛎速长选育系f6个体，通过显微镜观察，挑选出雌性个体600个待用；以g2雄性个体为父本，以 f6雌性个体为母本，进行杂交，具体从亲本中挤出精卵，精、卵分别先用 200目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；在人工授精过程中，控制每个卵子周围有3-5个精子；受精后，将受精卵平均分到20口30m2水泥池中进行孵化；发育至d型幼虫时，用400目筛绢网收集并获得d型幼虫2000g(约100亿)；将d型幼虫平均分到120口消毒好的30m2水泥池中进行幼虫培育，控制培育密度1-3个/ml；待幼虫发育至眼点幼虫时，投放牡蛎壳，幼虫变态率30％以上；当稚贝生长至2-3mm时，移到自然海区进行暂养；海区暂养15天后进行人工分苗，再移到自然海区养成。上述培育方法技术路线如图1所示。
35.经过海区1周年养殖后，“世倍1号”海区生长情况如图2所示。经测量，“世倍1号”平均全重达95.25g，较对照组(普通葡萄牙牡蛎三倍体) 提高20.55％；“世倍1号”平均壳高12.98cm，较对照组(普通葡萄牙牡蛎三倍体)提高17.47％；“世倍1号”平均壳长6.75cm，较对照组(普通葡萄牙牡蛎三倍体)提高3.53％；“世倍1号”平均壳宽4.63cm，较对照组(普通葡萄牙牡蛎三倍体)提高3.81％，如表1所示。
36.表1养殖1周年的“世倍1号”与对照组海区生长比较
[0037][0038]
实施例2
[0039]
葡萄牙牡蛎速长选育系f选育：从广东沿海地区收集10000个葡萄牙牡蛎养殖和野生3龄群体，然后截取壳高和体重前5％的个体500个作为繁殖亲贝，所述繁殖亲贝的体重为100-130g，壳形整齐，壳高为9-11cm。通过人工授精方法获得d型幼虫，在室内水泥池中培育至眼点幼虫，投放牡蛎壳作为附着基；当牡蛎稚贝生长至2-3mm时，移到自然海区进行养成。最后以相同选育目标、育苗技术和养成方法等，经过连续7代群体选育出葡萄牙牡蛎速长选育系f7。
[0040]
速长葡萄牙牡蛎四倍体g诱导：
①
三倍体诱导：解剖100个性腺成熟的葡萄牙牡蛎速长选育系f7亲本，用显微镜分出雌(40个)雄(45个)；挤出性腺较好的30对雌雄分别获得精卵，精、卵分别先用200目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；采用单对单的方法进行受
精，同时控制每个卵子周围有5-10个精子；当10％受精卵发育至第一极体时，马上加入0.5mg/l细胞松弛素b，处理受精卵30min，之后用含1％二甲基亚砜的海水浸泡15min；将各组受精卵收集放入室内水泥池进行孵化、幼虫培育，用流式细胞仪检测三倍体诱导率在90％以上，最后在海区养成。三倍体个体的检测图如图3所示。
②
四倍体诱导：解剖性腺成熟的速长葡萄牙牡蛎三倍体，利用流式细胞仪检测出倍性为3n的个体100个，通过显微镜观察，筛选出40个卵子发育良好的雌性3n个体作为母本；解剖100个性腺成熟的葡萄牙牡蛎速长选育系f7亲本，用显微镜辨别雌雄，选择性腺饱满、精子活力强的40个个体作为父本；分别挤出精、卵，先用200目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；采用单对单的方法进行受精，同时控制每个卵子周围有5-10个精子；当50％受精卵发育第一极体时，马上加入0.5mg/l细胞松弛素b，处理受精卵30min，之后用海水(含1％二甲基亚砜)浸泡15min；将各组受精卵收集放入室内水泥池进行孵化、幼虫培育，用流式细胞仪检测四倍体诱导率在40％以上，如图4所示。最后在海区养成速长葡萄牙牡蛎四倍体约8000个。
[0041]
速长葡萄牙牡蛎四倍体群体g自繁：在牡蛎繁殖季节，以速长葡萄牙牡蛎四倍体g为基础群体，通过流式细胞仪筛选出倍性为4n雌雄个体共100 个；分别挤出精、卵，先用200目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；在人工授精过程中，控制每个卵子周围有3～5个精子；受精卵发育至d型幼虫时，全池收集幼虫并放入新的消毒好的水泥池中培育，幼虫培育密度为1～2个 /ml；当幼虫发育至眼点时，投放聚乙烯塑料壳作为附着基；当稚贝生长至 2～3mm时，将聚乙烯塑料片分散放入上升流系统进行养殖；当稚贝生长至 1cm以上时，采用脱基方法获得单体牡蛎，并将单体牡蛎装笼移至自然海区养成。采用相同方法进行连续3代四倍体群体自繁，从而生产出倍性稳定的速长葡萄牙牡蛎四倍体g3。
[0042]
速长葡萄牙牡蛎三倍体“世倍1号”生产：将3000个葡萄牙牡蛎速长选育系f7个体和300个速长葡萄牙牡蛎四倍体g3个体移到室内水泥池进行恒温(23℃)促熟，生物饵料为人工培育的金藻、角毛藻、小硅藻、扁藻；当性腺成熟后，通过流式细胞仪检测和显微镜观察获得速长葡萄牙牡蛎四倍体g2雄性个体136个，待用；解剖3000个葡萄牙牡蛎速长选育系f7个体，通过显微镜观察，挑选出雌性个体1800个待用；以g3雄性个体为父本，以 f7雌性个体为母本，进行杂交，具体从亲本中挤出精卵，精、卵分别先用200目筛绢网过滤再用500目筛绢网过滤；在人工授精过程中，控制每个卵子周围有3-5个精子；受精后，将受精卵平均分到30口30m2水泥池中进行孵化；发育至d型幼虫时，用400目筛绢网收集并获得d型幼虫3000g(约 150亿)；将d型幼虫平均分到200口消毒好的30m2水泥池中进行幼虫培育，控制培育密度1-3个/ml；待幼虫发育至眼点幼虫时，投放牡蛎壳，幼虫变态率30％以上；当稚贝生长至2-3mm时，移到自然海区进行暂养；海区暂养15天后进行人工分苗，再移到自然海区养成。
[0043]
经过海区1周年养殖后，“世倍1号”平均全重达106.34g，较对照组 (普通葡萄牙牡蛎三倍体)提高29.43％；“世倍1号”平均壳高13.08cm，较对照组(普通葡萄牙牡蛎三倍体)提高19.28％；“世倍1号”平均壳长 7.37cm，较对照组(普通葡萄牙牡蛎三倍体)提高10.33％；“世倍1号”平均壳宽4.94cm，较对照组(普通葡萄牙牡蛎三倍体)提高9.05％，结果如表2所示。
[0044]
表2养殖1周年的“世倍1号”与对照组海区生长比较
[0045]
。
[0046]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。