一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法

1.本发明涉及植物组培技术领域，更具体的说是涉及一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法。


背景技术：

2.植物组织培养技术是二十世纪初开始，以植物生理学为基础，植物细胞全能性为理论依据发展起来的一项植物克隆技术，近年来随着组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，在植物的快速繁殖、种苗脱毒、远缘杂交、突变育种、基因工程及生物制品等方面得到广泛运用，尤其在植物的快速繁殖方面发展较快，已在上千种植物上获得成功，并在一些重要的经济作物上应用于生产，且取得较大经济效益。通过植物组织培养技术生产植物苗木，具有繁殖速度快、可保持优良性状、苗木整齐、生长快周期短、可脱除病毒、可工厂化生产等优点，具有增殖系数高、可控性强、不受季节限制等优势，短期内可获得大量商品苗，并可进行遗传改良。当前组织培养作为生物工程的一项重要技术，在基础理论研究和生产实践中发挥着重要作用。
3.多倍体是指由受精卵发育而来并且体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体；通过人工诱变，使细胞染色体组加倍获得多倍体材料，进而选育符合人们需要的优良品种，其中，用秋水仙素诱导是最常用、最有效的多倍体育种方法。多倍体植株有着叶片大而厚，颜色深邃，花朵大而花期延长，抗性强等优良性状，因此多倍体育种成为一种有效的提高花卉观赏性的手段。
4.在植物组织培养过程中，外植体消毒经常用到升汞，虽然用完将其回收，但操作过程中对工作人员会产生伤害，而且废升汞的处理费用很高；在百合的多倍体诱导中，嵌合体现象比较普遍，给多倍体的选育工作带来一定困难；多倍体百合由于其基因型的多样性，在后代往往会出现基因分离，导致新培育出的多倍体品种的优良特性遗传不稳定。
5.实验研究获得香水百合在鳞茎再生及快速繁殖过程中适宜的外植体及培养基配方，为香水百合组培苗进行工厂化生产提供理论依据；同时，利用组培材料进行香水百合多倍体诱导条件优化，获得正常生长的四倍体植株，为香水百合多倍体育种提供技术支持和材料储备，同时也对百合种质资源的创新打下基础。
6.因此，提供一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法，包括以下步骤：
10.(1)以香水百合开花前2～3d的花蕾为材料，无菌操作，取其花丝，用无菌剪刀将花丝切成小段，置于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；
11.(2)将产生的愈伤组织置于愈伤组织分化培养基上，进行小鳞茎的诱导；
12.(3)将步骤(2)诱导出的小鳞茎置于不定根诱导培养基上，诱导不定根，获得香水百合组培苗；
13.(4)将步骤(3)所述香水百合组培苗炼苗，栽种于栽培基质，获得香水百合植株；
14.(5)以步骤(3)所述香水百合组培苗叶片为材料，用秋水仙素进行多倍体诱导，将诱导后的材料置于步骤(1)所述愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，进行步骤(2)-(4)，获得多倍体香水百合植株。
15.进一步的，所述步骤(1)的愈伤组织诱导培养基为ms+6-ba1.0mg/l+naa 0.1～0.2mg/l。
16.进一步的，所述步骤(2)的愈伤组织分化培养基为ms+6-ba 0.5～1.0mg/l+naa 0.05～0.1mg/l。
17.进一步的，所述步骤(3)的不定根诱导培养基为1/2ms+6-ba 0.5～1.0mg/l+naa 0.05～0.1mg/l；
18.进一步的，步骤(4)所述栽培基质为珍珠岩与肥土按体积比1:1的混合基质。
19.进一步的，步骤(4)所述炼苗过程为：将步骤(3)所述组培苗移出培养箱，闭瓶炼苗3～4d后，开瓶炼苗1～2d，以进行适应性锻炼；
20.在出瓶后用清水洗净组培苗根部附着的培养基，用甲基托布津溶液浸泡组培苗基部2～3min，将组培苗分别移栽到用2
‰
高锰酸钾消毒的栽培基质中，前15d内采取增加大气相对湿度、遮阳等措施，15d后在叶面喷洒适量0.1％硝酸铵或磷酸二氢钾；
21.发现烂苗时要及时清理，以免污染其他健康苗。
22.进一步的，所述步骤(5)中用0.5％的秋水仙素处理48h。
23.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明花丝的诱导率均较高，最高达93.3％，愈伤组织生长良好，同时伴随少量小鳞茎产生；愈伤组织分化率最高达90％，小鳞茎不仅多而且生长更健壮，花丝分化产生的小鳞茎比子房产生的小鳞茎多，且生长状况良好，同时伴随少量不定根产生；筛选的不定根诱导培养基产生粗壮的根，生根率达96.7％；混合基质中百合生长更茁壮，叶子更绿。多倍体诱导产生四倍体率高达25％。形态学观察表明，四倍体植株较二倍体的叶片大且增厚，叶表面出现褶皱，颜色加深，长势旺盛；同时变异植株较对照气孔显著增大而单位面积气孔数减少。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
25.图1附图为香水百合花丝和子房的愈伤组织诱导结果对比，其中a花丝在ck上愈伤组织诱导、b花丝在ms+6-ba 1.0mg/l+naa 0.2mg/l上诱导出的愈伤组织(实施例1)、c花丝在ms+6-ba 0.5mg/l+naa 0.1mg/l上诱导出的愈伤组织、d花丝在ms+naa 0.3mg/l上诱导出的愈伤组织、e子房在ms+6-ba 1.0mg/l+naa 0.2mg/l上诱导出的愈伤组织(对比例1)、f子房在ms+6-ba 0.5mg/l+naa 0.1mg/l上诱导出的愈伤组织。
26.图2附图为香水百合花丝和子房的愈伤组织分化结果对比，其中a、b为实施例1花丝愈伤组织的分化情况，c、d为对比例1子房愈伤组织的分化情况。
27.图3附图为实施例1培养基组培苗。
28.图4附图为实施例1诱导叶片后的变化，其中a叶色加深(左为变异叶，右为正常叶)；b：叶片表面粗糙(右为变异叶，左为正常叶)；c：叶片肉质化(左为变异叶，右为正常叶)；d：叶片增大(左为变异叶，右为正常叶)e：生长健壮f：对照组培苗。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1
31.一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法，包括以下步骤：
32.(1)以香水百合开花前3d的花蕾为材料，无菌操作，取其花丝，用无菌剪刀将花丝切成小段，置于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；步骤(1)的愈伤组织诱导培养基为ms+6-ba 1.0mg/l+naa 0.2mg/l。
33.(2)将产生的愈伤组织置于愈伤组织分化培养基上，进行小鳞茎的诱导；步骤(2)的愈伤组织分化培养基为ms+6-ba 0.5mg/l+naa 0.05mg/l。
34.(3)将诱导出的小鳞茎置于不定根诱导培养基上，诱导不定根；所述步骤(3)的不定根诱导培养基为1/2ms+6-ba 0.5mg/l+naa 0.05mg/l；
35.(4)将组培苗移出培养箱，闭瓶炼苗3d后，开瓶炼苗2d，以进行适应性锻炼；
36.在出瓶后用清水洗净组培苗根部附着的培养基，用甲基托布津溶液浸泡组培苗基部3min，将组培苗分别移栽到用2
‰
高锰酸钾消毒的珍珠岩与肥土按体积比1:1的栽培基质中，前15d内采取增加大气相对湿度、遮阳等措施，15d后在叶面喷洒适量0.1％硝酸铵或磷酸二氢钾；
37.发现烂苗时要及时清理，以免污染其他健康苗；
38.(5)取香水百合组培苗叶片为材料，用0.5％的秋水仙素处理48h。进行多倍体诱导，将诱导后的材料置于步骤(1)所述愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，进行步骤(2)-(4)，获得多倍体植株。
39.实施例1花丝的愈伤组织诱导率较高，达93.3％，愈伤组织生长良好，同时伴随少量小鳞茎产生；愈伤组织分化培养基诱导分化率高达90％，小鳞茎不仅多而且生长更健壮，花丝分化产生的小鳞茎比对比例1用子房产生的小鳞茎多，且生长状况良好，同时伴随少量不定根产生；筛选的不定根诱导培养基能够产生粗壮的根，生根率达96.7％；混合基质中百合生长更茁壮，叶子更绿；多倍体诱导产生四倍体率高达25％。
40.实施例2
41.一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法，包括以下步骤：
42.(1)以香水百合开花前3d的花蕾为材料，无菌操作，取其花丝，用无菌剪刀将花丝切成小段，置于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；步骤(1)的愈伤组织诱导培
养基为ms+6-ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l。
43.(2)将产生的愈伤组织置于愈伤组织分化培养基上，进行小鳞茎的诱导；步骤(2)的愈伤组织分化培养基为ms+6-ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l。
44.(3)将诱导出的小鳞茎置于不定根诱导培养基上，诱导不定根；所述步骤(3)的不定根诱导培养基为1/2ms+6-ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l；
45.(4)将组培苗移出培养箱，闭瓶炼苗4d后，开瓶炼苗1d，以进行适应性锻炼；
46.在出瓶后用清水洗净组培苗根部附着的培养基，用甲基托布津溶液浸泡组培苗基部2min，将组培苗分别移栽到用2
‰
高锰酸钾消毒的珍珠岩与肥土按体积比1:1的栽培基质中，前15d内采取增加大气相对湿度、遮阳等措施，15d后在叶面喷洒适量0.1％硝酸铵或磷酸二氢钾；
47.发现烂苗时要及时清理，以免污染其他健康苗；
48.(5)取香水百合组培苗叶片为材料，用0.5％的秋水仙素处理48h，进行多倍体诱导，将诱导后的材料置于步骤(1)所述愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，进行步骤(2)-(4)，获得多倍体植株。
49.实施例2花丝的愈伤组织诱导率较高，达86.7％，愈伤组织生长良好，同时伴随少量小鳞茎产生；愈伤组织分化培养基诱导分化率高达86.7％，小鳞茎不仅多而且生长更健壮，同时伴随少量不定根产生；筛选的不定根诱导培养基能够产生粗壮的根，生根率达86.7％；混合基质中百合生长更茁壮，叶子更绿。多倍体诱导产生四倍体率高达25％。
50.对比例1
51.一种香水百合鳞茎再生及多倍体诱导的方法，包括以下步骤：
52.(1)以香水百合开花前3d的花蕾为材料，无菌操作，取其子房，用无菌剪刀将花丝切成小段，置于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；步骤(1)的愈伤组织诱导培养基中为ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l。
53.(2)将产生的愈伤组织置于愈伤组织分化培养基上，进行小鳞茎的诱导；步骤(2)的愈伤组织分化培养基为ms+6-ba0.5mg/l+naa0.05mg/l。
54.(3)将诱导出的小鳞茎置于不定根诱导培养基上，诱导不定根；所述步骤(3)的不定根诱导培养基为1/2ms+6-ba0.5mg/l+naa0.05mg/l；
55.(4)将组培苗移出培养箱，闭瓶炼苗3d后，开瓶炼苗2d，以进行适应性锻炼；
56.在出瓶后用清水洗净组培苗根部附着的培养基，用甲基托布津溶液浸泡组培苗基部3min，将组培苗分别移栽到用2
‰
高锰酸钾消毒的珍珠岩与肥土按体积比1:1的栽培基质中，前15d内采取增加大气相对湿度、遮阳等措施，15d后在叶面喷洒适量0.1％硝酸铵或磷酸二氢钾；
57.发现烂苗时要及时清理，以免污染其他健康苗；
58.(5)取香水百合组培苗叶片为材料，用0.5％的秋水仙素处理48h，进行多倍体诱导，将诱导后的材料置于步骤(1)所述愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，进行步骤(2)-(4)，获得多倍体植株。
59.对比例1子房的愈伤组织诱导率达80.0％，愈伤组织生长良好，同时伴随少量小鳞茎产生；愈伤组织分化培养基诱导分化率高达86.7％，小鳞茎多而且生长健壮，子房分化产生的小鳞茎比实施例1用花丝产生的小鳞茎更少，且生长状况略低，同时伴随少量不定根产
生；筛选的不定根诱导培养基能够产生粗壮的根，生根率达96.7％；混合基质中百合生长更茁壮，叶子更绿。多倍体诱导产生四倍体率高达25％。
60.对比例2
61.步骤(1)-(4)同实施例1；
62.步骤(5)取香水百合组培苗小鳞茎为材料，用0.5％的秋水仙素处理48h。进行多倍体诱导，将诱导后的材料置于步骤(1)所述愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，进行步骤(2)-(4)，获得多倍体植株。
63.结果表明对比例2多倍体诱导产生四倍体率高达20％。
64.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。