一种利用茶氨酸缓解重金属镉对植物的抗氧化胁迫毒害的方法

1.本发明涉及植物生理学领域，具体讲的是一种利用茶氨酸缓解重金属镉对植物的抗氧化胁迫毒害的方法。


背景技术：

2.有相当面积的土壤镉污染指数大于5，达到了重度污染的级别。耕地土壤不合理施肥加剧了土壤的酸化，土壤ph是影响土壤镉生物有效性的最主要因素，土壤ph值越低，土壤中可交换态镉含量越高，镉的生物有效性越高，植物中镉含量也越高。镉抑制植物光合作用，显著降低植物光合速率。镉介导的抗氧化机制主要通过增强超氧物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat) 及过氧化物酶(pod)等抗氧化酶的活性来实现。镉毒害会减少植物对养分的吸收及重要物质的代谢与合成，从而影响作物的产量与品质。寻找一种天然物质以缓解植物镉毒害迫在眉睫。茶氨酸是茶树最重要的特征性次生代谢产物，赋予茶独特的滋味和健康功效，我们探寻了茶氨酸对缓解植物镉毒害的生理作用，在农业生产中具有重要潜在应用价值。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是一种利用茶氨酸缓解重金属镉对植物的抗氧化胁迫毒害的方法。本发明采用以下技术方案：
4.一种利用茶氨酸缓解重金属镉对植物的抗氧化胁迫毒害的方法，包括以下步骤：
5.在遭受镉害的植物根部所在培养液或培养土中施加茶氨酸，所述茶氨酸的浓度为10-50μmol/l。
6.进一步的，施加茶氨酸的方法为直接使用茶树修剪物，等待茶树修剪物自然降解产生茶氨酸。
7.本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：本发明将茶氨酸应用于缓解植物镉毒害，并利用茶树修剪物自然降解产生茶氨酸，可以得到生态浓度的茶氨酸，成本低且方法简单，在农业生产中具有重要潜在应用价值。
8.下面结合附图和实例对本发明进行详细说明。
附图说明
9.图1为镉离子处理后的茶树与空白对照组的叶片绿色荧光强度对比图；
10.图2为茶氨酸和镉离子共同处理的茶树、镉离子处理后的茶树和空白对照组的茶树叶片丙二醛及抗氧化酶活性对比图；
11.图3为茶氨酸和镉离子处理对茶树的茶氨酸合成酶csts1、csts2和氮同化途径关键基因csgs1、csgs2、csnr、csnir、csalt、csgdh1、csgdh2、csnadh-gogat的表达的影响示意图；
12.图4为茶氨酸和镉离子共同处理的拟南芥、镉离子处理后的拟南芥和空白对照组的拟南芥叶片丙二醛及抗氧化酶活性对比图。
具体实施方式
13.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
14.本发明公开了茶氨酸参与氧化应激反应缓解植物镉毒害中的应用。
15.本发明通过：1)对鄂茶10号茶树品种进行对照ck、cd
2+
及cd
2+
+thea处理，测定各处理茶树叶片ps ii的最大量子产量(fv/fm反映潜在最大光合能力)、丙二醛含量、pod、sod及cat酶活，以及茶氨酸合成酶、氮同化途径关键基因在茶树叶片及根系中的相对表达；2)对拟南芥进行对照ck、cd
2+
、cd
2+
+thea处理，测定各处理叶片丙二醛含量、pod、sod及cat酶活，结果显示：与ck处理相比，添加40μm cd
2+
处理的拟南芥叶片丙二醛的含量显著增加，pod、sod及cat酶活显著提高；添加40μm cd
2+
+50 μm thea的处理拟南芥叶片丙二醛的含量显著高于ck处理，但显著低于40μm cd
2+
处理，而cat酶活与40μm cd
2+
处理差异不显著，pod、sod酶活显著高于40μm cd
2+
处理。该研究发现添加茶氨酸可提高镉胁迫条件下茶树叶片超氧物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)及过氧化物酶(pod)等抗氧化酶的活性，可显著降低镉胁迫条件下茶树叶片中丙二醛含量，表明茶氨酸是提高茶树镉毒胁迫耐受能力的关键次生代谢组分。该研究将茶氨酸和镉毒害引起的植物氧化应激系统联系起来，茶氨酸介导植物对镉毒害胁迫的耐受能力，为茶氨酸在植物耐镉的生理作用及应用提供依据。
16.茶树实验处理：生长势一致的二龄鄂茶10号幼苗进行营养液培养诱导出白色新生根。茶苗随机分成3组，分别进行对照处理、80μm cd
2+
处理，及80μm cd
2+
与50μm thea 共处理，各处理每5天更换一次营养液，20天处理后测定茶树叶片绿色荧光强度及 fv/fm、丙二醛含量及cat、pod、sod酶活。采用qrt-pcr技术测定茶氨酸合成酶csts1 与csts2、硝态氮吸收转运基因csnrt1.2及csnrt2.5、氮同化途径关键基因csgs1、 csnir、csnr、csgdh1、csalt、csnadh-gogat在各处理条件下茶树根中表达量。
17.茶树实验结果：
18.(1)如图1所示，与对照处理相比，80μm cd
2+
处理(cd
2+
)茶树叶片绿色荧光强度显著减弱，fv/fm下降39.90％(p《0.05)，丙二醛的含量升高97.8％，达到显著水平 (p《0.05)，pod、sod及cat酶活显著提高，分别提高56.34％、82.75％与49.59％；如图2所示，80μm cd
2+
与50μm thea共处理(cd
2+
+thea)的茶树叶片，其fv/fm显著升高到0.54，丙二醛的含量显著下降到0.112μmol g-1
，pod、sod及cat酶活均表现出上升的趋势，其中cat与sod酶活分别上升了20.10％与25.47％，达到显著水平(p《 0.05)。
19.(2)如图3所示，茶氨酸合成酶csts1在茶树根中的表达受cd
2+
+thea处理诱导，达到显著水平；茶氨酸合成酶csts2在叶片中的表达被镉处理、镉与茶氨酸共处理显著抑制，在茶树根中，csts2表达在镉与茶氨酸共处理条件下较镉处理显著上升。镉处理显著抑制硝态氮吸收基因csnrt1.2及csnrt2.5在茶树根系中的表达，镉与茶氨酸共处理条件下csnrt1.2表达量恢复到对照处理的水平；镉处理条件下，氮同化途径关键基因csgs1、csgs2、csnr、csnir、csalt、csgdh1、csgdh2、csnadh-gogat在根中的表达被明显抑制，其中csgs1、csgs2、csnir、csalt、csgdh1达到显著水平，而镉与茶氨酸共处理条件下csgs1、csnr、csnir、
csalt、csgdh1、csnadh-gogat表达量显著高于镉处理；csgs1与csgdh1在cd
2+
处理及cd
2+
与thea共处理的茶树叶片中的表达量显著高于对照处理，cd
2+
处理抑制csgs2在茶树叶片中的表达，cd
2+
与thea共处理可恢复其表达，可得知茶氨酸缓解茶树镉害的作用机理可能与提高茶树茶氨酸合成酶基因及氮同化途径关键基因的表达以促进氮的利用效率有关。
20.拟南芥实验处理：野生型拟南芥进行营养液培养3周，分为3组，分别进行对照处理、40μm cd
2+
处理，及40μm cd
2+
与50μm thea共处理，各处理每5天更换一次营养液，9天处理后测定拟南芥叶片丙二醛含量及cat、pod、sod酶活。
21.拟南芥实验结果：如图4所示，与对照处理相比，40μm cd
2+
处理拟南芥叶片丙二醛的含量升高4.2倍，达到显著水平(p《0.05)，pod、sod及cat酶活显著提高，分别提高75.0％、115.0％与43.7％；与40μm cd
2+
处理相比，镉与茶氨酸共处理拟南芥叶片丙二醛含量显著下降，降幅为17.8％，pod与sod酶活分别上升了26.9％与27.7％，达到显著水平，cat酶活差异不显著。
22.本实施例采用叶绿素荧光成像仪测定茶树叶片绿色荧光强度及fv/fm。
23.测定茶树或拟南芥叶片丙二醛含量的方法为：称重0.5g茶树或拟南芥鲜叶样品，经液氮研磨后，用5％三氯乙酸溶液浸提，与0.5％硫代巴比妥酸(tba)反应生成粉红色化合物，测定其在532nm波长处的吸光度值，与标准品比较定量。丙二醛含量＝ c
×
v/m。c：标准系列曲线丙二醛浓度；v：样品溶液的体积；m：样品的鲜重。结果由 3个生物实验和3个技术重复获得。
24.茶树或拟南芥叶片sod、pod、cat酶活测定方法为：样品经液氮研磨后，于1
×
pbs 缓冲液(ph＝7.8)中溶解。离心后取上清进行sod、pod和cat酶活检测。
25.sod活性测定采用氮蓝四唑nbt光还原法。取酶液0.05ml加入2.95ml反应液 (50mmol/l pbs，1.25mmol/l nbt，0.1mmol/l edta，0.22mol/l蛋氨酸，33μmol/l 核黄素)，在4000lx光照下进行光化还原反应20min，检测560nm下的od值。sod 活性＝((a560ck-a560e)
×
v)/(a560ck
×
0.5
×
fw
×
vt)。a560ck：对照品在560nm 处的吸收值；a560e：检测样品在560nm处的吸收值；v：粗提液的总体积；fw：样品鲜重；vt：用于测量的粗提液的体积。结果由3个生物学重复和3个技术重复获得。
26.pod活性测定采用愈创木酚法。取酶液0.05ml，加入2.95ml反应液(50ml 0.05 mol/l pbs(ph6.0)，28μl愈创木酚，加热使其溶解，冷却后加入19μl 30％h2o2)，测定470nm处的光吸收值。pod活性＝(δa470
×
vt)/(0.01
×
fw
×
vs
×
t)。δa470：在470nm处吸收的差异值；vs：粗提液的总体积；fw：样品鲜重；vt：用于测量的粗提液的体积；t：反应时间。结果由3个生物学重复和3个技术重复获得。
27.cat活性测定采用h2o2法。取0.1ml酶液加入1.9ml pbs(ph7.0)和1ml 0.1mol/l h2o2，测定240nm下的吸光值。cat活性＝(δa240
×
vt)/(0.01
×
fw
×
vs
×
t)。δa240：在240nm处的吸收差异值；vs：粗提液的总体积；fw：样品鲜重；vt：用于测量的粗提液的体积；t：反应时间。结果由3个生物学重复和3个技术重复获得。
28.以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。