波兰青霉提取物在制备除草剂中的应用

1.本发明涉及生物防治领域，具体涉及波兰青霉提取物，还涉及波兰青霉提取物在制备除草剂中应用。


背景技术：

2.杂草会严重威胁农作物的产量，给农业生产造成巨大的经济损失。与人工除草相比，除草剂具有经济、快速、高效等优点，为农业的高产和稳产提供了重要保障。然而，近年来，长期、单一、广泛使用除草剂，导致了抗性杂草个体和种群逐年增加，降低了除草剂的防治效果，增加了杂草防治成本；同时，除草剂使用剂量增加也易造成农作物药害风险和环境污染。目前，杂草抗性问题已经是威胁粮食作物生产的重要问题之一。因此，开发安全性高、效率高的新型除草剂具有重要意义。天然产物小分子与生物在自然界中共同进化，其生物学活性能够干预特定细胞的代谢途径，因而在医药健康及农业生产中起着非常重要的作用，如抗菌药物青霉素、抗疟疾药物青蒿素以及降脂药物洛伐他汀等。因此，开发和应用具有新型生物学活性的天然产物对生命科学、医学及农业科学等广大领域具有重要意义。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种波兰青霉提取物在制备除草剂中的应用；本发明的目的之二在于提供式ii化合物在制备除草剂中的应用；本发明的目的之三在于提供一种除草剂复合物；本发明的目的之四在于提供所述复合物在制备除草剂中的应用。
4.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.1、波兰青霉提取物在制备除草剂中的应用，所述波兰青霉是在中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号为accc 31573的菌株。
6.本发明优选的，所述提取物为波兰青霉经发酵后，收集培养液用乙酸乙酯萃取，去除溶剂，得到粗提物ⅰ；菌体用甲醇浸泡超声提取，收集提取物，去除溶剂得到粗提物ⅱ，合并粗提物ⅰ和粗提物ⅱ得到提取物。
7.本发明优选的，所述超声提取的时间为30min。
8.本发明优选的，所述波兰青霉提取物含有式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示化合物；其中式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示化合物结构式如下：
[0009][0010]
r为c2h6或者ph。
[0011]
更优选的，所述除草剂为除双子叶植物或单子叶植物的杂草。
[0012]
2、式ii化合物在制备除草剂中的应用，式ⅱ所示化合物结构式如下：
[0013][0014]
3、一种除草剂复合物，所述复合物包括式ⅰ、式ⅱ、式ⅲr为c2h6和式ⅲr为ph所示的化合物；
[0015]
其中式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示化合物结构式如下：
[0016][0017]
式iii中，r为c2h6或者ph。
[0018]
本发明优选的，所述式ⅰ、式ⅱ、式ⅲr为c2h6和式ⅲr为ph的化合物质量比为4:2:1:1。
[0019]
4、所述复合物在制备除草剂中的应用。
[0020]
本发明的有益效果在于：本发明公开了波兰青霉提取物在制备除草剂中的应用，经鉴定波兰青霉提取物含有式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ所示化合物，其中式ⅱ具有除草活性，能够针对双子叶植物和单子叶植物的杂草，但是式ⅰ、式ⅱ和式ⅲ构成的复合物具有更高的除草效率，可以解决现有技术中的杂草抗性问题。因此，该除草剂具有广泛的应用价值。
附图说明
[0021]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0022]
图1为本发明提供的波兰青霉1号菌株和2号菌株及其次级代谢产物谱图对比和除草活性对比示意图；
[0023]
图2为波兰青霉1号菌株发酵液提取物对白菜及马唐种子萌发抑制活性试验(a：马唐；b：白菜)；
[0024]
图3为波兰青霉2号菌株发酵液提取物对白菜及马唐种子萌发抑制活性试验(a：白菜；b：马唐)；
[0025]
图4为化合物aa及其复合物的除草活性结果图；
[0026]
图5为化合物aa及其复合物在土壤中的除草活性。
具体实施方式
[0027]
下面结合附图和具体实施案例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施案例不作为对本发明的限定。
[0028]
实施例1、波兰青霉提取物的制备
[0029]
分别活化波兰青霉1号菌株(保藏单位：中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc 31573)和/或波兰青霉2号菌株(保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号：no.m2010086)，使用pdb培养基液体发酵培养7天，将2l发酵液用纱布过滤，得到的液体用乙酸乙酯萃取，得到的有机相进行旋蒸，得到粗提物ⅰ。采用纱布过滤得到的菌体，用甲醇浸泡，超声30min，然后过滤，得到的液体进行旋蒸，得到粗提物ⅱ，两次得到的粗体物混合，用甲醇配制成100mg/ml的提取物。
[0030]
将波兰青霉提取物通过硅胶柱进行洗脱，达到各组分分离提纯的目的，具体流程如下：第一次过柱，流动相选用正己烷/丙酮，洗脱比例设置为4:1，3:1，2:1，1:1，0:1进行梯度洗脱，通过液相色谱图的对比，收集在3:1后半段以及2:1的比例下流出硅胶柱。由于化合物中还有其他杂质，将分离出的化合物混合再次通过硅胶柱洗脱。第二次过柱，流动相选用正己烷/乙酸乙酯，洗脱比例设置为2:1，1.5:1，1:1，1:1.5进行梯度洗脱，通过液相色谱图的对比，收集在1.5:1的比例下流出硅胶柱，且纯度较高，得到的旋蒸、得到纯化的化合物，干燥后，放置在-8℃下保存。
[0031]
将提取的化合物采用高效液相色谱法(hplc)进行检测。hplc检测条件如下：采用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件：0-5min，甲醇为10％；5-20min，甲醇从10％
→
95％；20-25min，甲醇为95％；25-27min，甲醇从95％
→
10％，流速0.5ml/min，检测波长为254nm。
[0032]
波兰青霉1号和波兰青霉2号提取物检测结果如图1所述。结果显示，波兰青霉1号和波兰青霉2号的提取物主要次级代谢产物相同，包括4.2min的主产物峰，但也存在差异。主要表现在，波兰青霉1号提取物在4.6-4.8min中存在两个主要差异峰。经化合物纯化及结构鉴定，4.2min的主产物峰为式ii化合物(aa)。4.6-4.8min为式ⅰ化合物(aame)以及式iii化合物(fa、fb)。说明波兰青霉1号和2号菌株提取物中均含有化合物aa，但只有波兰青霉1号菌株提取物中含有aame、fa、fb。化合物结构式如下所示：
[0033][0034]
化合物英文全称为aspterric acid methyl ester，化合物的分子式为c
16h24
o4，分子量为280.1675，简称化合物aame。式ii化合物的结构式如下：
[0035][0036]
式ii化合物英文全称aspterric acid，化合物的分子式为c
15h22
o4，分子量为266.1518，简称化合物aa。
[0037]
式iii化合物的结构式为：
[0038][0039]
r为c2h6或者ph。
[0040]
式iii化合物英文全称为fructigenine a/b,化合物的分子式分别为c
27h29
n3o3和c
24h31
n3o3,分子量分别为443.2207以及409.2362。简称化合物fa、fb。
[0041]
实施例2、活性测试
[0042]
1)测试波兰青霉1号菌株发酵液提取物对小白菜以及马唐发芽的抑制活性
[0043]
实验方法：将2l 7天的发酵液用纱布过滤，得到的液体用乙酸乙酯萃取，得到的上清液进行旋蒸，得到粗提物ⅰ。采用纱布过滤得到的菌体，用甲醇浸泡，超声30min，然后过滤，得到的液体进行旋蒸，得到粗提物ⅱ，两次得到的粗体物混合，用甲醇配制成100mg/ml的提取物母液。
[0044]
种子表面消毒：将种子(表面光滑，种子平整，不开裂，品相完整)先用无菌水冲洗，然后用体积分数70％的乙醇浸泡2min，再用2％次氯酸钠浸泡2min，最后用无菌水彻底清洗5-6次，冲洗后，将种子晾干。
[0045]
将提取物母液梯度稀释，选用96孔板进行活性试验，每个孔添加100μl ms培养基，试验组加入不同浓度的提取物，设置浓度为10μg/μl，5μg/μl，2.5μg/μl，1.25μg/μl，0μg/μl(阴性对照)以及1％甲醇(阴性对照)，混匀，加入5颗已消毒的种子，平板放置在恒温光照培养箱中(25℃,湿度55％，16h/8h光/暗循环)培养，同时设置3次重复，结果如图2所示。
[0046]
结果显示，在浓度为0μg/ml的阴性对照孔中，马塘和小白菜均正常发芽，颜色为深绿或淡绿色，添加了波兰青霉1号菌株发酵液提取物的种子，萌发受抑制，并且叶片颜色发黄，随着浓度增加，抑制效果明显，表明波兰青霉1号提取物对小白菜以及马唐发芽具有抑制作用。
[0047]
2)测试波兰青霉2号菌株发酵提取物对小白菜以及马唐发芽的抑制活性
[0048]
实验方法：将2l 7天的发酵液用纱布过滤，得到的液体用乙酸乙酯萃取，得到的上清液进行旋蒸，得到粗提物ⅰ。采用纱布过滤得到的菌体，用甲醇浸泡，超声30min，然后过滤，得到的液体进行旋蒸，得到粗提物ⅱ，两次得到的粗体物混合，用甲醇配制成100mg/ml的提取物母液。
[0049]
种子表面消毒：将种子(表面光滑，种子平整，不开裂，品相完整)先用无菌水冲洗，然后用体积分数70％的乙醇浸泡2min，再用质量分数2％的次氯酸钠浸泡2min，最后用无菌水彻底清洗5-6次，冲洗后，将种子晾干。
[0050]
将提取物母液梯度稀释，选用96孔板进行活性试验，每个孔添加100μl ms培养基，试验组加入不同浓度的提取物，设置浓度为10μg/μl，8μg/μl，6μg/μl，4μg/μl，0μg/μl(阴性对照)以及1％甲醇(阴性对照)，混匀，加入5颗已消毒的种子，平板放置在恒温光照培养箱中(25℃,湿度55％，16h/8h光/暗循环)培养，同时设置3次重复，结果如图3所示。
[0051]
结果显示，在阴性对照孔中，马塘和小白菜均正常发芽，颜色为深绿或淡绿色，添
加了波兰青霉2号菌株发酵液提取物的种子，对小白菜的抑制效果不显著，对马塘在高浓度下有一定抑制作用，低浓度下抑制效果不明显。
[0052]
3)aa抑制小白菜种子萌发进行实验
[0053]
为了研究抑制种子萌发的活性成分，本发明还提供针对aa抑制小白菜种子萌发进行实验，测试分离提取后的化合物aa对小白菜和马唐发芽的抑制活性。
[0054]
实验方法：
[0055]
将化合物aa用甲醇溶解至浓度为1mg/μl。于96孔板中，先加入100μl水，再加入0.2-22μl溶解后的化合物aa(摩尔浓度分别为125μm、250μm、500μm、1000μm、2000μm)，之后加入5颗已消毒的种子，然后将平板放置在恒温光照培养箱中(25℃，湿度55％，16h/8h光/暗循环)培养。
[0056]
其中，阳性对照为1μg/μl(591μm)草甘膦，阴性对照为1％甲醇。
[0057]
结果如图4中a显示，在浓度为1％甲醇的阴性对照孔中，小白菜均正常发芽，颜色为深绿。阳性对照草甘膦抑制小白菜种子的正常萌发，表现为萌发的小白菜叶片发黄。化合物aa对小白菜的萌发具有一定的抑制作用，表现在低浓度导致叶片发黄，高浓度aa抑制小白菜种子萌发，但相同浓度下，抑制效果和草甘膦相当。
[0058]
4)本发明还提供针对aa复合物(质量占比aa:aame:fa:fb:4:2:1:1)抑制小白菜种子萌发进行实验，测试分离提取后的aa复合物对小白菜发芽的抑制活性。
[0059]
实验方法：
[0060]
将上述比例配置aa复合物母液用甲醇溶解至浓度为100μg/μl的母液。于96孔板中，先加入100μl水，再加入不同体积的上述母液，设置化合物浓度梯度分别为0.5μg/μl、1μg/μl、2μg/μl、4μg/μl、8μg/μl。阳性对照为1μg/μl的草甘膦，阴性对照为1％甲醇。之后加入5颗已消毒的种子，然后将平板放置在恒温光照培养箱中(25℃,湿度55％，16h/8h光/暗循环)培养，结果如图4中a所示。
[0061]
结果显示，在浓度为1％甲醇的阴性对照孔中，小白菜均正常发芽，颜色为深绿。阳性对照草甘膦抑制小白菜种子的正常萌发，表现为萌发的小白菜叶片发黄。aa复合物对小白菜的萌发具有一定的抑制作用，表现在低浓度导致叶片发黄，高浓度抑制小白菜种子萌发，并且相较于单独aa，抑制效果明显增加。
[0062]
5)本发明还提供化合物aa和aa复合物在土壤环境中抑制小白菜发芽和生长的活性，测试化合物aa在土壤环境中抑制小白菜发芽和生长的活性。
[0063]
实验方法：将化合物aa、aa复合物和阳性对照药物草甘膦配制成10mg/ml的溶液母液。
[0064]
将混合均匀的营养土装入培养盆中，在培养盆中加入适量清水，使营养土湿润，将营养土表面压实，使各盆营养土的高度一致，然后在每盆中点播15粒小白菜种子，表面轻撒一层干燥的营养土，分别取500μl甲醇、aa溶液以及草甘膦溶液，均匀喷洒于不同的培养盆表面，然后将培养盆放置在恒温光照培养箱中(25℃,湿度55％,16h/8h光/暗循环)培养。结果如图5所示，结果显示与培养基中结果一致。
[0065]
化合物aa(分子式：c
15h22
o4；分子量：266.33/mol；cas登记号码：67309-95-9)
[0066]
本发明提供了式(ⅱ)化合物，并提供了式(ⅱ)及其通过产生菌波兰青霉1号菌株和波兰青霉2号菌株的制备方法，及作为除草剂的应用，因而也提供含有上述化合物或其产
生菌的除草剂。
[0067]
经实验，明确式(ⅱ)化合物针对双子叶植物，或单子叶植物的杂草，具有很好的除草活性，并且具有较高的安全性及较高的除草效率。同时，将式(ⅱ)化合物应用作为一种新型的除草剂，可以解决现有技术中的杂草抗性问题。因此，该除草剂具有广泛的应用价值。
[0068]
上述作为除草剂的应用，其中，除草是指针对双子叶植物，或单子叶植物杂草，实验选用的双子叶植物bracssica属、单子叶植物digitaria属的杂草。例如，双子叶植物bracssica属的杂草为小白菜，单子叶植物digitaria属的杂草选用马唐。
[0069]
因此，针对波兰青霉1号菌株，波兰青霉2号菌株的发酵提取物和化合物aa，化合物aame以及其与fa、fb混合物对双子叶植物brassica属的小白菜以及单子叶植物马唐发芽和生长的抑制作用。
[0070]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。