一种优化细胞保存的细胞储存装置和细胞存储方法与流程

1.本发明属于细胞组织工程领域，特别涉及一种优化细胞保存的细胞储存装置和细胞存储方法。


背景技术：

2.在过去十年里，生物细胞成为多个领域的实用工具，用以帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。无论细胞的种类和用途是什么，都离不开低温保存。
3.细胞贮存过程中会发生如红细胞膜脂质和蛋白质被羟基、过氧基和烷氧基等反应性氧原子团氧化、过氧化、交联及磷脂酰丝氨酸外翻等改变，即“贮存损伤”，此类损伤直接或间接地造成无效输注，甚至增加输血风险，且缩短了红细胞寿命。干细胞也会因不当的冷冻试剂和方案产生随机分化，失去原有价值。
4.通常的冷冻方案为，先用蛋白酶来解离细胞，再进行离心，最后用含有冷冻液的培养基重悬，常用的冷冻液，包括二甲基亚砜(dmso)、蔗糖及甘油等。dmso和甘油属于渗透性抗冻剂，蔗糖则为非渗透性抗冻剂。dmso和甘油均可有效地帮助细胞抵御冷冻带来的有害影响，但经含有大剂量dmso和甘油的冷冻液冷冻的干细胞并不适合人体，它们极易损伤并且dmso极可能会有毒副作用。此外，使用普通的冷冻液fbs/dmso/甘油混合物时，细胞复苏之后的活性往往较差，复苏过程中容易导致细胞氧化损伤与分化潜能降低。


技术实现要素：

5.针对以上技术问题，本发明提供一种优化细胞保存的细胞储存装置和细胞存储方法。以二甲基亚砜、3~5kda 胶原抗冻肽、胎牛血清、海藻糖为冷冻液防冻核心，透明质酸-羟基磷灰石水凝胶为保护框架配合各种添加剂设计一种细胞的冷冻液以及其使用方法装置以解决细胞氧化损伤与分化潜能降低的问题。
6.本发明的技术方案是通过以下实现的。
7.根据一种优化细胞保存的细胞存储方法一个方面，提供细胞的冷冻液，其中，每1000ml冷冻液包括以下成份及含量：20-50mg 3~5kda 胶原抗冻肽；50～100g枸杞多糖；10～50g透明质酸-羟基磷灰石复合水凝胶；50～100g葡萄糖；20～150g海藻糖；5～20g丙酮酸钠；5～20g维生素c；20～50ml二甲基亚砜；60～100ml甘油；200～300ml胎牛血清；余量为缓冲液。
8.其中，细胞的冷冻液的ph为7.0～7.4。
9.其中，细胞包括普通体细胞，自体血液细胞，自体脂肪细胞，脐带血来源细胞。
10.其中，缓冲液包括pbs缓冲液或hepes缓冲液中的一种或两种。
11.根据本发明的另一方面，提供用于一种优化细胞保存的细胞存储方法，具体包括以下步骤：（1）检查细胞生长状态，若细胞状态很好且融合率达90%左右，适当的冻存一些前几代的细胞，来备以后实验所需细胞。
12.（2）用提前预热的至室温的无菌pbs轻轻漂洗细胞2-3次。
13.（3）利用胰酶在37℃下孵育2min消化细胞。若出现细胞漂浮起来，此时弃胰酶立即加入新鲜dmem培养基（培养基：胰酶=4:1）终止消化，移液枪将其转移至离心管，800rmpm/in，3min 离心，弃上清废液，留底部沉淀。
14.（4）将细胞放入以上所述的冷冻液中，室温降到4℃用20min，冷冻1～2小时，在-20℃冷冻1～4小时。
15.（5）将步骤(4)液体继续在-80℃环境下冷冻8～12小时。
16.（6）将步骤(5)处理后的液体放入液氮中储存装置。
17.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，该细胞的冷冻液中，以二甲基亚砜、3~5kda胶原抗冻肽、胎牛血清、海藻糖为冷冻液防冻核心，透明质酸-羟基磷灰石水凝胶为保护框架实现与其他原料的良好兼容，达到各种原料功能协同化，储存细胞的目的。
18.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，透明质酸-羟基磷灰石复合水凝胶，复合水凝胶经透析完全后均能够保持良好的灭菌稳定性。复合水凝胶中的羟基磷灰石含量和交联程度对凝胶溶胀性能具有一定影响，通过该参数可以调控目标水凝胶的组成及溶胀行为。羟基磷灰石颗粒的引入能提高水凝胶的弹性、稳定性，使得复合水凝胶具有更好的可塑性，利于用作面部轮廓整形修正等软组织填充材料。羟基磷灰石颗粒还能提高复合水凝胶的细胞粘附性，为成纤维细胞提供适宜的生长环境，有利于后续的细胞外基质分泌，延长其体内停留时间，有可能促进组织修复或重建，能够提升细胞解冻后的存活率和增殖率。
19.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，二甲基亚砜(dmso)，是良好的细胞冷冻剂，在低温冻存时，可以长期保持细胞的活力与功能，但在室温下，有较强的细胞毒副作用，对细胞的存活率、生长增殖能力能够产生影响。
20.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，3~5kda 胶原抗冻肽，原抗冻肽热滞活性最高，表明其可以显著降低结冰点，适用于在低温度下保护细胞的生理功能。
21.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，胎牛血清是重要细胞营养成分，同时对细胞在不同温度环境下提供保护。
22.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用海藻糖对生物体具有的保护作用，这是因为海藻糖在高温、高寒、等环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。
23.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，枸杞多糖的添加可降低细胞内活性氧的水平，保护线粒体结构和功能，从而改善解冻后细胞质量。
24.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，葡萄糖作为细胞保存液基本成分，使细胞有平衡稳定的环境有效降低储存细胞的，改善细胞能量代谢。
25.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，丙酮酸钠丙酮酸作为１种 α－酮酸，可直接通过非酶促的去羰基反应消耗过氧化氢，与氧自由基反应生产水和co2，并间接增加抗氧化剂即还原型谷胱甘肽的含量，进而增加谷胱甘肽抗氧化能力。贮存过程中添加sp，可提升atp浓度、减低 mda浓度。
26.所述一种优化细胞保存的细胞存储方法，维生素c可有效提高储存红细胞回输存活率，并且降低免疫原性。
27.根据本发明的另一方面，提供用于一种优化细胞保存的细胞储存装置，包括：分析装置，用于检查细胞生长状态，若细胞状态很好且融合率达90%左右，适当的冻存一些前几代的细胞，来备以后实验所需细胞；细胞清洗装置，用于将提前预热的至室温的无菌pbs轻轻漂洗细胞2-3次；消化装置，用于利用胰酶在37℃下孵育2min消化细胞。若出现细胞漂浮起来，此时弃胰酶立即加入新鲜dmem培养基（培养基：胰酶=4:1）终止消化，移液枪将其转移至离心管，800rmpm/in，3min离心，弃上清废液，留底部沉淀；冷冻装置，用于将细胞放入以上所述的冷冻液中，室温降到4℃用20min，冷冻1～2小时，在-20℃冷冻1～4小时。以及将步骤(4)液体继续在-80℃环境下冷冻8～12小时；储存装置，用于将步骤(5)处理后的液体放入液氮中储存装置。
28.综上，本发明具有以下有益效果：1、本发明的细胞冷冻液，能够有效地保持干细胞活力，避免氧化损伤，细胞复苏率高。
29.2、本发明的人体干细胞冷冻液，通过添加定量的透明质酸-羟基磷灰石复合水凝胶和二甲基亚砜，将二甲基亚砜的含量由10％以上降至2～5％，细胞解冻复苏后，不需去除即可直接进行培养。
附图说明
30.图1是发明一种优化细胞保存的细胞储存装置的结构示意图。
具体实施方式
31.下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然说明书中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
32.实施例1冷冻液x1的配制：取25ml二甲基亚砜，85ml甘油，225ml胎牛血清，再加入pbs缓冲液配成1000ml的基础冷冻液，然后再加入20mg3~5kda胶原抗冻肽，60g枸杞多糖，45g羧化多聚-l-赖氨酸，50g葡萄糖，80g海藻糖，7g抗冻维生素c，7g维生素c，制成1000ml人体干细胞的冷冻液母液，然后分装10份100ml进行冻存。
33.人体干细胞的冷冻储存法1：（1）利用观测装置内，检查细胞生长状态，若细胞状态很好且融合率达90%左右，适当的冻存一些前几代的细胞，来备以后实验所需细胞。
34.（2）在除菌装置，用提前预热的至室温的无菌pbs轻轻漂洗细胞2-3次。
35.（3）在消化装置内，利用胰酶在37℃下孵育2min消化细胞。若出现细胞漂浮起来，此时弃胰酶立即加入新鲜dmem培养基（培养基：胰酶=4:1）终止消化，移液枪将其转移至离心管，800rmpm/in，3min离心，弃上清废液，留底部沉淀。
36.（4）在冷冻装置内，将细胞放入以上所述的冷冻液中
（5）根据待冻存的干细胞的细胞总量，计算出所需冻存液x1的量，将细胞放入适量的冷冻液x1中，在-20℃冷冻1小时，继续在-80℃环境下冷冻12小时。
37.（6）转入液氮中长期储。
38.实施例2冷冻液x2的配制：取20ml二甲基亚砜，100ml甘油，200ml胎牛血清，再加入hepes缓冲液配成1000ml的基础冷冻液，然后再加入20mg 3~5kda胶原抗冻肽，100g枸杞多糖，10g羧化多聚-l-赖氨酸，100g葡萄糖，150g海藻糖，5g丙酮酸钠，5g维生素c，制成1000ml人体干细胞的冷冻液母液，然后分装10份100ml进行冻存。
39.人体干细胞的冷冻存储方法2：（1）利用观测装置内，检查细胞生长状态，若细胞状态很好且融合率达90%左右，适当的冻存一些前几代的细胞，来备以后实验所需细胞。
40.（2）在除菌装置，用提前预热的至室温的无菌pbs轻轻漂洗细胞2-3次。
41.（3）在消化装置内，利用胰酶在37℃下孵育2min消化细胞。若出现细胞漂浮起来，此时弃胰酶立即加入新鲜dmem培养基（培养基：胰酶=4:1）终止消化，移液枪将其转移至离心管，800rmpm/in，3min 离心，弃上清废液，留底部沉淀。
42.（4）在冷冻装置内，将细胞放入以上所述的冷冻液中。
43.（5）根据待冻存的干细胞的细胞总量，计算出所需冻存液x2的量，将细胞放入适量的冷冻液x2中，在-20℃冷冻1小时，继续在-80℃环境下冷冻12小时，（6）转入液氮中长期储存。
44.实施例3冷冻液x3的配制取50ml二甲基亚砜，60ml甘油，300ml胎牛血清，再加入pbs缓冲液配成1000ml的基础冷冻液，然后再加入50mg 3~5kda胶原抗冻肽，50g枸杞多糖，50g羧化多聚-l-赖氨酸，50g葡萄糖，20g海藻糖，20g丙酮酸钠，20g维生素c，制成1000ml人体干细胞的冷冻液母液，然后分装10份100ml进行冻存。
45.人体干细胞的冷冻存储方法3：（1）利用观测装置内，检查细胞生长状态，若细胞状态很好且融合率达90%左右，适当的冻存一些前几代的细胞，来备以后实验所需细胞。
46.（2）在除菌装置，用提前预热的至室温的无菌pbs轻轻漂洗细胞2-3次。
47.（3）在消化装置内，利用胰酶在37℃下孵育2min消化细胞。若出现细胞漂浮起来，此时弃胰酶立即加入新鲜dmem培养基（培养基：胰酶=4:1）终止消化，移液枪将其转移至离心管，800rmpm/in，3min 离心，弃上清废液，留底部沉淀。
48.（4）在冷冻装置内，将细胞放入以上所述的冷冻液中（5）根据待冻存的干细胞的细胞总量，计算出所需冻存液x3的量，将细胞放入适量的冷冻液x3中，在-20℃冷冻1小时，继续在-80℃环境下冷冻12小时。
49.（6）转入液氮中长期储存。
50.实验例不同冷冻液的细胞复苏率比较实验设计：通过以常用冻存液(90％胎牛血清+10％dmso)作为对照，验证本发明的
人体干细胞的冷冻液(x1～x3)对于经4次传代培养的脐血间充质干细胞的冷冻保存性能。
51.实验方法：(1)取甲、乙两份来源于北京市海淀区妇幼保健院的脐血标本(2份均获得产妇同意)，以等量的pbs缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液；650g离心15min抽取白膜层细胞，以等量的pbs缓冲液洗涤离心，基础培养液重悬；接种至100mm培养皿，置于37℃、饱和湿度、5％co2的培养箱内培养；第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60％～ 80％融合时，用0 .25％胰酶(含0 .02％edta)常规消化传代至第四代。
52.(2)将传至第四代的细胞培养物取出，拍打混匀成单细胞悬液，并计算细胞总数，根据计算结果，将同一供者的细胞分装成4份，保证每份细胞含量为1
×
107。
53.(3)将分装出的细胞悬液依次以800～1000r/min离心5min，去上清液，振开细胞沉淀，向同一供者的4份细胞沉淀中分别加入适量的冷冻液x1～x3或对照冻存液(90％胎牛血清+10％dmso)，轻轻吹打混匀并标号。
54.(4)将共8支冻存管在普通冰箱冻室(-20℃)冻存2小时，然后移至超低温冰箱(-80℃)冻存12小时，转入液氮。
55.(5)冻存细胞在液氮中保存48h后取出，将冻存管在35℃水域中迅速搅动3分钟，至冻存液完全融化，打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，加入培养液，1500rp离心5min，弃上清(其中含有x1～x3的冻存管也可不经此除杂步骤，直接培养，经证明实验结果并无明显差异)，加dmem培养基转入培养瓶中置于37℃下培养，48小时后在显微镜下观察并计算复苏率。
56.实验结果：冻存管标号冻存细胞数量复苏细胞数量细胞复苏率%甲-x11
×
1070.91
×
10791甲-x21
×
1070.90
×
10790甲-x31
×
1070.92
×
10792甲-对照1
×
1070.56
×
10756乙-11
×
1070.91
×
10791乙-21
×
1070.94
×
10794乙-31
×
1070.91
×
10791乙-对照1
×
1070.59
×
10759结果分析：通过上表可知，经本发明的人体干细胞的冷冻液x1～x3冻存的甲、乙两份脐血间充质干细胞，其复苏率均在90％以上，要远高于普通冻存液的复苏率。
57.以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。