一种降低蓟马成虫体内TSWV带毒量的方法与流程

一种降低蓟马成虫体内tswv带毒量的方法
技术领域
1.本发明属于病毒防治技术领域，具体涉及一种降低蓟马成虫体内tswv带毒量的方法。


背景技术：

2.番茄斑萎病毒(tswv)是一种危害农业生产的重要病毒，主要通过汁液接触传染，只要寄主有伤口，即可侵入。番茄斑萎病毒的寄主植物非常广泛，侵染粮食、烟草、蔬菜及花卉等多种作物后可产生严重危害甚至绝产。近年来，随着全球气候的变化，番茄斑萎病毒病发生流行日趋严重，目前已成为全世界10种危害性最大的植物病毒之一。
3.番茄斑萎病毒主要通过介体蓟马以取食植株传播病毒，蓟马一旦获毒可终生带毒。蓟马一年四季均有发生，春、夏、秋三季主要发生在露地，冬季主要在温室大棚中，世代重叠，终年繁殖。一般发生高峰期在秋季或入冬的11-12月份，3-5月份则是第二个高峰期。蓟马害虫的生活史分别由卵、若虫(1龄和2龄若虫)、蛹(伪蛹)和成虫四个阶段组成。蓟马若虫在叶背取食到高龄末期停止取食，落入表土化蛹，蛹期通常不食不动，后羽化为成虫破土而出，活动范围变广，能够通过取食新植物而造成新种和新株系之间的相互危害，破坏力明显增大。因此，如何降低蓟马成虫向地上植物传播番茄斑萎病毒的风险，具有重要意义。向地下土壤灌施化学农药以在蓟马成虫前将其杀灭，可以有效将番茄斑萎病毒禁锢在土壤内，是当前防治番茄斑萎病毒的主要措施。但是，长期使用化学农药会造成土壤环境的污染，最终危害人类健康。


技术实现要素：

4.除了化学农药外，目前并没有其它安全高效的方式在蓟马成虫前将其杀灭在土壤中，为此，本发明尝试以降低蓟马成虫体内的带毒量，来控制蓟马成虫向地面植物广泛传播番茄斑萎病毒。
5.灵菌红素类化合物(prodigiosins，pgs)是微生物的天然次生代谢物，具有灵菌红素(prodigiosin，pg)三吡咯骨架，生物活性广泛，对番茄斑萎病毒具有抑制作用，而且对环境安全。直接向地下灌施灵菌红素，并不能达到有效降低蓟马成虫体内带毒量的防治效果，主要存在以下两点原因：第一，灵菌红素在自然环境中易降解、药效短；第二，蓟马若虫会远离灵菌红素，导致效果降低。
6.为了克服上述技术难题，我们将灵菌红素制备成缓释制剂，并选择在蓟马蛹期灌施土壤，以利用蓟马蛹期不活动的特性，使其被迫接受灵菌红素缓释制剂的作用，降低蓟马蛹体内的带毒量，从而最终降低了蓟马成虫的体内带毒量，大大减小了蓟马成虫向其它植物传播番茄斑萎病毒的风险。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种降低蓟马成虫体内tswv带毒量的方法，具体为：在蓟马蛹期向土地灌施灵菌红素缓释制剂，抑制蓟马蛹体内的带毒量，从而最终降低蓟马成虫体内的带毒量。
9.上述灵菌红素缓释制剂的浓度为200～400μg/ml。
10.上述灵菌红素缓释制剂的灌施方法为：对植物进行灌根处理，每株植物灌施100～200ml灵菌红素缓释制剂。
11.将灵菌红素制备成缓释制剂所采用的包覆材料，应当具备如下特点：在生物降解性、相容性、粘附性等方面表现出良好的性能，能够起到防止包覆物突释，控制包覆物释放速度的作用。优选地，可采用海藻酸钠。
12.本发明提供了一种灵菌红素缓释制剂，由灵菌红素、水杨酸和海藻酸钠组成。优选地，海藻酸钠、灵菌红素和水杨酸的质量比为1:2:1。在制备灵菌红素缓释制剂过程中，可选择使用乳化剂，优选地，乳化剂为吐温-20。
13.本发明所述灵菌红素缓释制剂中的灵菌红素，其结构式如下述式ⅰ所示，其制备方法参见发明专利cn103387529a。
[0014][0015]
本发明提供了一种灵菌红素缓释制剂的制备方法，步骤如下：
[0016]
向海藻酸钠溶液中依次加入异丙醇和戊二醛，搅拌均匀；然后逐滴加入吐温-20、灵菌红素溶液和水杨酸溶液，搅拌混匀；离心，去上清，洗涤后获得灵菌红素纳米囊，即灵菌红素缓释制剂。
[0017]
上述降低蓟马成虫体内tswv带毒量的方法，可应用于防控蓟马成虫向地面植物广泛传播番茄斑萎病毒。尤其是防控蓟马成虫向未染病植物传播番茄斑萎病毒。
[0018]
本发明的有益效果为：
[0019]
灵菌红素缓释制剂能够缓慢持续释放灵菌红素，并长期维持稳定的有效药物浓度。在蓟马蛹期将灵菌红素缓释制剂灌施土壤，可以有效利用蓟马蛹期不活动的特性，使其被迫接受灵菌红素缓释制剂的作用，降低蓟马蛹体内的带毒量，从而最终降低了蓟马成虫后的体内带毒量，大大减小了蓟马成虫向其它植物传播番茄斑萎病毒的风险。同时，灵菌红素属于微生物次生代谢产物，对环境安全无污染。此外，水杨酸作为植物内源激素，可通过激活植物过敏反应和调节植物病程相关蛋白基因表达从而诱导植物产生系统性抗性，抵御病原体对作物的侵害。
附图说明
[0020]
图1为灵菌红素缓释制剂电镜图；
[0021]
图2为灵菌红素缓释制剂的平均粒径分布图(左)和zeta电位分布图(右)；
[0022]
图3为不同温度条件下灵菌红素的释放曲线图，其中，上方曲线为35℃条件，中间曲线为25℃条件，下方曲线为15℃条件；
[0023]
图4为不同温度条件下水杨酸的释放曲线图，其中，上方曲线为35℃条件，中间曲
线为25℃条件，下方曲线为15℃条件；
[0024]
图5为本氏烟接种tswv后第七天症状表现，其中，左图为对照，右图为接种tswv；
[0025]
图6为不同处理组中本氏烟烟叶的tswv相对含量。
具体实施方式
[0026]
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0027]
实施例1
[0028]
灵菌红素缓释制剂的制备，步骤如下：
[0029]
将5ml海藻酸钠溶液(0.1g/ml)加入50ml三角瓶中，在磁力搅拌条件下，依次加入4ml异丙醇和2ml戊二醛，搅拌均匀后静止30min；然后逐滴加入0.5ml吐温-20、1ml灵菌红素溶液(1g/ml)和0.5ml水杨酸溶液(1g/ml)，搅拌1h混匀；在4℃、11000
×
g的低温离心机中离心10min，去上清，用去离子水洗涤三次，获得灵菌红素纳米囊，即灵菌红素缓释制剂，避光保存备用。
[0030]
(1)物理性质分析
[0031]
对灵菌红素缓释制剂的粒径、zeta电位以及pdi等数据进行检测，结果如图1和图2所示，灵菌红素缓释制剂的平均粒径为100～200nm，zeta电位+31.5mv，多分散指数(pdi)为0.542。上述结果表明，灵菌红素缓释制剂具有优良的纳米药剂的特性。
[0032]
(2)缓释特性分析
[0033]
将5mg灵菌红素缓释制剂置于3.5kd透析袋，并浸入100ml pbs缓冲液中。分别在15℃、25℃和35℃下以60rpm摇动，定期分别等量取出5ml样品进行分析，并用5ml新鲜pbs缓冲液替换。然后分别在535nm和298nm处测量释放pbs缓冲液的吸光度来计算灵菌红素和水杨酸的药物释放量。
[0034]
药物释放曲线如图3和图4所示，灵菌红素缓释制剂具有良好的缓释特性，随着温度的升高，灵菌红素和水杨酸的释放速度逐渐增加但累计释放量基本相同。上述结果表明，灵菌红素缓释制剂具有缓慢持续释放药物的特性，能长期维持稳定的有效药物浓度，从而有利于提高田间施用效果。
[0035]
实施例2
[0036]
西花蓟马获毒能力测试，步骤如下：
[0037]
将健康无毒本氏烟栽培于花盆中，当生长至5-6片真叶时，用于试验。将带tswv的本氏烟叶片1g放入提前灭菌消毒的研钵中，加入10ml 1
×
pbs缓冲液后研磨作为接种液。取拟接种的健康本氏烟植株，在其顶部2-3片真叶上撒少量500目金刚砂粉末，然后用棉签蘸取适量接种液在叶脉位置轻轻摩擦接种，30min后以清水轻轻冲洗叶片，放置于黑暗环境下24h后转移到正常的环境中继续培养。接种约7-10d后，出现畸形、褪绿、黄化、斑驳等典型症状，如图5所示，即为带毒植株，用于后续实验。
[0038]
将五根健康新鲜的豆角放于成虫饲养玻璃罐中，待成虫在豆角上产卵24h后，将豆角取出放到另一个新的玻璃罐中，三天后一龄若虫孵化后，将若虫转移至tswv感染的离体本氏烟叶片上。叶片背面朝上放在含有5mm厚2％琼脂和一层滤纸的的玻璃培养皿内，封口
后置于27
±
1℃、光照为l:d＝16:8h的培养箱中培养120h。
[0039]
然后试验设两个处理，处理一：转移约200头二龄老熟若虫(以体色变为橙红色为标准)至放有新鲜豆角的平底玻璃罐，罐底平铺过筛高温灭菌地表土，将灵菌红素缓释制剂稀释至200μg/ml后灌施土壤，使其湿度保持在70％，为试验组。处理二：转移约200头老熟二龄若虫至放有新鲜豆角的平底玻璃罐，罐底平铺过筛高温灭菌地表土，灌施水打湿土壤使其湿度保持在70％，为对照组。将各处理置于27
±
1℃、光照为l:d＝16:8h的培养箱中饲养至成虫羽化。成虫5日龄时，各处理分别取20头雌虫20头雄虫置于1.5ml rna-free pe管中，每个处理3次重复，以液氮速冻，之后提取rna，利用rt-qpcr技术定量检测不同处理成虫中tswv含量。
[0040]
检测结果如表1所示，两个处理试验中，有少量蓟马未感染tswv，而感染tswv的个体均超过总数的90％。将单个西花蓟马体内病毒含量分级归类，分别为1(0《r《1)、2(1《r《2)、3(2《r《3)、4(3《r《4)、5(r》4)，与对照相比，灵菌红素缓释制剂处理蓟马成虫体内病毒含量相对较低，具有低病毒含量的带毒成虫(等级1和2)的比例在82.78％，其中病毒含量分级为1的占60.35％，显著高于对照组的31.80％。上述结果表明，灌施灵菌红素缓释制剂能够降低病毒增殖能力，从而降低西花蓟马成虫的带毒量。
[0041]
表1不同处理西花蓟马体内tswv浓度的比例
[0042][0043]
实施例3
[0044]
西花蓟马传毒能力测试，步骤如下：
[0045]
取实施例2中两个处理试验饲养的成虫作为试虫，羽化5日后，采用活体本氏烟检测其传毒能力，具体方法为：将本氏烟幼苗移植到高35cm，直径为20cm的塑料桶中(桶底植物培养基厚约10cm)，塑料桶上面覆盖有200目的防虫纱网。当本氏烟培养到4-5片真叶时，试验分设三个处理，处理a：每桶接入上述实例2中处理一饲养的雌成虫或雄成虫一头；处理b：每桶接入上述实例2中处理二饲养的雌成虫或雄成虫一头；处理c：不接入试虫，作为对照(ck)；每个处理需10个桶，5桶接入雌虫，5桶接入雄虫，再设3次重复，即每个处理共接入30头。接入试虫后盖紧盖子，置于培养箱中培养两周，依照gb/t23222-2008中病毒病分级标准调查各处理烟株的发病情况。
[0046]
试验结果如表2所示，对照组烟株表现为无症状；处理a烟株的发病严重度低于处理b。通过qrt-pcr检测tswv的拷贝数，如图6所示，处理a中tswv的拷贝数显著低于处理b。上述结果表明，在西花蓟马蛹期往土壤中灌施灵菌红素缓释制剂，能够显著降低西花蓟马的带毒量，从而降低其传毒量，使得作物发病程度降低。
[0047]
表2不同处理烟株发病情况
[0048][0049]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。