一种肾后性急性肾损伤动物模型的构建方法

1.本发明属于实验动物模型技术领域，尤其涉及一种肾后性急性肾损伤动物模型的构建方法。


背景技术：

2.急性肾损伤(acute kidney injury，aki)在人和动物群体中都具有高发病率和死亡率，患病动物死亡率约占总体的50％，并且与肾损伤的严重程度紧密相关，其治疗结果高度依赖于病因和可用的治疗方法。传统的急性肾损伤检测金标准是血清肌酐(serum creatinine，scr)，但许多研究指出肌酐检测在时间上具有滞后性，只有当肾脏损伤大部分时才会显著表达，这时肾功能已经损伤超过50％甚至功能衰竭。肌酐检测方法在宠物临床中往往不能及时发现急性肾损伤，延误了治疗的最佳时期，从而造成不可逆转的肾损伤甚至导致死亡，可见血清肌酐不是肾损伤的标志物，而是肾功能的标志物。
3.人肾后性急性肾损伤在临床上相对少见，肾后性急性肾损伤未能得到肾病领域技术人员的广泛关注，相关的动物模型构建方法也较单一。而此病在动物中发病较多，尤其是猫，猫急性肾损伤在临床上是常见病症，尤其是尿闭引起的肾后性aki。肾脏是保持机体体液和酸、碱及电解质平衡的重要器官，通过排尿将机体内废物排出，以免废物滞留引起机体伤害。但临床调查研究发现，由于猫生理和环境饮食等多种原因常引起尿闭，致使尿液潴留体内，体液倒流入肾，造成急性肾损伤，这给宠物及其主人带来了很大的困扰。但是目前本领域针对猫急性肾损伤的文献资料有限，尤其是猫肾后性急性肾损伤的研究更少。急性肾损伤是一种复杂内科病，为了阐明急性肾损伤的发病机制，现有技术根据不同病因建立了不同方案的动物模型，而肾后性急性肾损伤动物模型建立方案目前只有输尿管梗阻，但此方案造模时需要对动物进行开腹手术，且多数为单侧肾脏造模，极易导致肾脏出现纤维化样病变引发慢性肾病，这与临床病例急性肾损伤的发病机制相差较大。所以提供一种在不损伤实验动物正常生理结构的情况下使尿路完全阻塞/梗阻，确保解除阻塞/梗阻后应具有良好的预后且与临床下尿路阻塞发病和治疗后的情况一致的肾后性急性肾损伤模型构建方法，是本领域亟需解决的技术难题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种在不损伤实验动物正常生理结构的情况下使尿路完全阻塞/梗阻，解除阻塞/梗阻后应具有良好的预后且与临床下尿路阻塞发病和治疗后的情况一致的肾后性急性肾损伤模型构建方法，具有简便、建模时间短、可靠、稳定的优势。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种肾后性急性肾损伤动物模型的构建方法，包括如下步骤：将动物麻醉，插入导尿管，对导尿管开口处进行封闭处理，当实验动物符合急性肾损伤评判标准时，移除导尿管。
7.优选的，所述动物为雄性动物。
8.优选的，所述动物包括猫、犬、鼠。
9.优选的，动物麻醉前需禁食6-12h。
10.优选的，所述急性肾损伤评判标准采用iris急性肾损伤分级标准。
11.优选的，当实验动物的急性肾损伤分级达到iris急性肾损伤3级时，移除导尿管。
12.优选的，所述iris急性肾损伤3级时血肌酐浓度为2.6-5.0mg/dl。
13.本发明还提供了一种上述方法构建所得的肾后性急性肾损伤动物模型在筛选急性肾损伤防治药物中的应用。
14.本发明的有益效果：
15.本发明采用物理阻塞的方法建立肾后性急性肾损伤动物模型，实验方案立足于临床，本发明建立的急性肾损伤动物模型与临床下尿路阻塞/梗阻的患病动物发生急性肾损伤的机制的契合度更高，有效避免了药物和手术等因素对实验结果造成的干扰，为肾后性急性肾损伤的病理生理机制研究提供快捷简便的实验方案和稳定的动物实验基础。采用本发明方法24h便可成功构建获得肾后性急性肾损伤动物模型，在不损伤实验动物正常生理结构的情况下使尿路完全阻塞/梗阻，解除阻塞/梗阻后应具有良好的预后且与临床下尿路阻塞发病和治疗后的情况一致，为肾后性急性肾损伤的早期诊断和治疗提供了一种简单、安全、成功率高、稳定的肾后性急性肾损伤动物模型。
附图说明
16.图1为肾组织病理学观察结果，其中a(he5
×
)、b(he10
×
)、c(he20
×
)为造模前肾脏病理组织学结果；d(he5
×
)、e(he10
×
)、f(he20
×
)为scr浓度ⅲ级aki时肾脏病理组织学结果。
具体实施方式
17.本发明提供了一种肾后性急性肾损伤动物模型的构建方法，包括如下步骤：将动物麻醉，插入导尿管，对导尿管开口处进行封闭处理，当实验动物符合急性肾损伤评判标准时，移除导尿管。
18.在本发明中，所述动物优选为雄性动物，所述动物的种类优选为包括猫、犬、鼠。本发明对于所述动物的具体来源没有特殊限定。本发明将动物麻醉前优选的需禁食6-12h，本发明对于麻醉的具体方法没有特殊限定，在本发明具体实施例中，采用布托啡诺和丙泊酚进行麻醉，麻醉处理后，优选的用加热垫维持体温。
19.本发明对于导尿管的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售导尿管均可。本发明对于导尿管开口处封闭处理的具体封闭方式没有特殊限定，对导尿管开口处进行封闭处理，能够造成急性下泌尿道梗阻，同时也便于采集尿液。在本发明中，所述急性肾损伤评判标准优选的采用iris急性肾损伤分级标准，所述iris急性肾损伤分级标准具体如表1所示。
20.表1iris急性肾损伤分级标准
[0021][0022][0023]
*输液治疗有反应是指6h内尿液生成量超过1ml/kg/h，和/或48h后血肌酐下降至基线值；各分级根据是否出现少尿或无尿症状进一步分为两个亚级，若出现少尿或无尿症状则提示需要肾脏替代疗法。
[0024]
在本发明中，当实验动物的急性肾损伤分级优选的达到iris急性肾损伤3级时，移除导尿管，解除尿路阻塞，尽量避免出现严重的临床症状或不可逆的肾脏损伤。由表1可以看出，所述iris急性肾损伤3级时血肌酐浓度为2.6-5.0mg/dl。
[0025]
本发明还提供了一种上述方法构建所得的肾后性急性肾损伤动物模型在筛选急性肾损伤防治药物中的应用。
[0026]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0027]
实施例1
[0028]
选择未去势的健康公猫12只，年龄为2～4岁，体重3.4
±
0.3kg，进行常规的免疫及驱虫，分组饲养，2～3只猫一笼，饲养4周。待其适应环境后开始实验，整个实验过程中饲养
管理条件保持一致，实验猫在实验期间可自由采食、饮水，避免应激。实验前进行临床检查，保证良好的精神状态和正常的采食饮水，实验室检查无猫瘟、弓形虫，猫传染性腹膜炎和下泌尿道疾病等。血常规检查、血生化检查、血气检查、尿常规检查、等常规检查结果均处于正常参考范围内。实验动物由黑龙江八一农垦大学实验基地提供。
[0029]
麻醉公猫前6-12h禁食，用布托啡诺0.02-0.04mg/kg iv和丙泊酚(西安力邦制药有限公司生产)5-7mg/kg进行麻醉，加热垫维持体温。模型构建过程中监测：血压(平均动脉压不低于100，收缩压不低于80)、体温、呼吸和心率。
[0030]
将公猫麻醉后，插入导尿管，对导尿管开口处封闭处理，造成急性下泌尿道梗阻，同时也便于采集尿液。采用iris急性肾损伤分级标准(见表1)，当实验猫aki达到3级时，立即移除导尿管，肾后性急性肾损伤模型构建成功。
[0031]
在模型构建过程中，观察实验猫的精神状态，记录其饮食饮水状态、观察有无呕吐腹泻等临床症状。结果为：所有实验猫在造模手术后8h内均未表现出明显的异常，正常采食饮水；在8h后实验猫变得较暴躁具有攻击性，并且活动逐渐减少，食欲下降，但饮水量未见明显变化；16h左右开始出现精神沉郁，无食欲，偶有呕吐现象；24h出现不同程度的呕吐。
[0032]
实施例2
[0033]
对实施例1构建方法构建所得的模型进行评估检测。评估检测过程中主要用的仪器、试剂及耗材分别如表2和表3所示。
[0034]
表2试验主要仪器设备
[0035][0036]
表3试验主要试剂与耗材
[0037][0038]
1、血清肌酐(scr)浓度检测
[0039]
将实验猫人工保定，通过颈静脉采集1～2ml血液，移入无抗凝剂抗凝管中，4℃静置30min，在离心10min(3500-4000rpm)后收集血清，使用全自动生化分析仪检测各时间点scr浓度。实验猫造模手术结束后每隔2h采集一次血液样本，检测一次血清中肌酐水平，直至检测血清肌酐浓度超过2.6mg/dl(221μmol/l)，即实验猫达到iris诊断标准中ⅲ级aki为止。具体检测结果见表4。
[0040]
表4造模手术后scr的浓度变化
[0041]
[0042][0043]
由表4可以看出，实验猫在尿道闭锁后24h，血清scr浓度平均值已经达到2.65
±
0.15mg/dl，达到iris的aki诊断ⅲ级标准。
[0044]
临床下尿路阻塞引起的急性肾损伤的恢复时间一般是在解除梗阻后1-2周临床症状和血液指标逐渐恢复正常，但具体恢复时间由于猫的恢复能力存在差异目前仍无法确定。本发明主要监测了实验动物造模期间的各种指标变化情况，每两小时采集血液检测一次，以期能够及时发现实验动物的肾脏损伤情况并停止实验，防止出现不可逆转的急性肾损伤。而在造模实验结束后实验猫恢复期间观察实验动物临床症状及全部实验猫无临床表现后(13天)检测一次血肌酐的浓度。临床症状的监测结果显示多数猫于尿路梗阻解除后的3-7天已无明显的临床表现，饮食正常，排尿规律，无呕吐腹泻等症状，但也有部分实验猫在经过治疗第10天后才逐渐恢复，血肌酐浓度在第13天检测时都已恢复至正常范围内，所以判定采用本发明方法构建的肾后性急性肾损伤动物模型解除阻塞/梗阻后具有良好的预后，且与临床下尿路阻塞发病和治疗后的情况一致。
[0045]
2、肾脏病理组织学检查
[0046]
①
肾脏样品采集
[0047]
于造模前和血清肌酐指标超过2.6mg/dl(221μmol/l)时，每个时间点随机选取2只猫采集一侧肾脏。详细步骤如下：
[0048]
1)注射布托啡诺0.02-0.04mg/kg iv，静脉推注丙泊酚(5-7mg/kg)进行诱导麻醉，再进行气管插管。使实验猫仰卧保定在手术台，连接好呼吸麻醉机。
[0049]
2)腹部剃毛，术部用75％酒精由中心向外螺旋式涂擦，之后用5％碘伏再次由中心向外螺旋式涂擦，最后用75％酒精脱碘，铺上创巾。
[0050]
3)沿腹正中线脐前后常规打开腹腔，从中轻轻移出肠管，同时用温生理盐水浸润过的纱布隔离覆盖肠管，使其保持湿润状态。
[0051]
4)将肾脏侧肠管向对侧牵拉，充分暴露背侧腹膜覆盖的肾脏。钝性剥离腹膜，使肾脏可以游离，充分显露输尿管、肾脏动静脉，分别进行结扎，之后继续分离输尿管至膀胱三角处，结扎切除多余的输尿管，取出肾脏。
[0052]
5)最后将肠管复位，依次闭合腹腔。
[0053]
6)术后进行镇痛管理及输液治疗。取出的肾脏先用无菌pbs冲洗，后放在4％多聚甲醛溶液中固定保存。
[0054]
②
肾组织切片he染色观察
[0055]
1)样本取材
[0056]
打开通风厨的电源，将待取材的肾组织移至通风厨案板上。用组织镊将组织样本仔细的从固定液中取出，并记录其大小、色泽、质地。切取厚度为3mm的肾皮质及髓质交界处放入包埋盒中，剩余样本移入固定液中室温保存。
[0057]
2)组织脱水
[0058]
包埋盒放入10％中性甲醛中充分固定，时间应大于2.5h，按照《常规组三织脱水程序》进行脱水。将包埋盒中组织先移入75％、80％、95％乙醇溶液中对应浸2h、2h、1h，然后转入无水乙醇ⅰ和ⅱ中25min，再分别浸在二甲苯ⅰ、ⅱ和ⅲ中25min，最后放入石蜡ⅰ、ⅱ和ⅲ中2h。
[0059]
3)组织包埋
[0060]
根据组织大小选择适合的包埋底模，用58℃熔融石蜡注满后由热台移入冷台，将组织切面放入底模底部，然后压上具有相同组织编号的包埋盒，等石蜡冷凝后再取出组织切块。
[0061]
4)组织修片及切片
[0062]
先将切片轮转机调至8μm处修片，将组织暴露超过85％以上即可。将修好的蜡块放入-20℃冰箱中10min，然后把切片轮转机调至3μm切片，然后移至摊片水中，等组织完全展开后，放至载玻片2/3处，最后将载玻片进行烘片30min。
[0063]
5)he染色
[0064]
he染色流程如下：
[0065]
将组织切片在二甲苯ⅰ、ⅱ和ⅲ中各浸润5min，然后在80％、95％、无水乙醇中浸润2min，用流水冲洗2min至无雾状，上下冲洗3次。再用苏木素染液浸润5min，用流水冲洗后，用分化液上下刷洗4次，再用流水冲洗5min。在伊红溶液反复提拉浸润3次(3s)，经无水乙醇浸润2min，最后放干后用中性树胶封固。
[0066]
④
切片观察
[0067]
将封好片的切片放入nanozoomer-sq扫描仪进行扫描，并描述组织病变程度。
[0068]
结果如图1所示。由图1可以看出，在造模前，肾脏皮质和髓质分界清楚。皮质内肾小球分布均匀，未见明显异常，肾小管细胞偶见胞质空泡样变性。肾脏髓质部分结构正常。当scr浓度达到ⅲ级aki时，肾脏损伤明显。肾脏皮质内肾小球分布不均匀，部分肾小球体积明显缩小且与肾球囊存在黏连现象，肾小管弥漫性空泡变性和水肿，肾小管内可见透明细胞管型，部分肾小管出现坏死，且伴有炎性细胞浸润和血液淤积。肾脏髓质间质水肿，血管扩张充血，部分间质显著黏液样变性。
[0069]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。